真核细胞转染操作方法
PEI 转染法
PEI转染法材料：质粒DNA指数生长的真核细胞PEI（聚乙烯亚胺）1×HBS（pH7.4）配方：PEI储存液（100μM）：称取125mg PEI粉末溶解于50ml1×HBS（pH7.4）中，0.2μm滤膜过滤，储存于4℃备用。
1×HBS（pH7.4）：将8.76g NaCl溶解于900ml超纯水，加入20ml1M的HEPES，调pH值到7.4，定容至1L，过滤（0.2μm滤膜）后储存于4℃备用。
方法：1．细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以4×105至8×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60mm组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的70-90％）。
根据细胞贴壁情况于的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。
转染含5％CO2前换入2mL预热的无血清培养基。
2.制备PEI-DNA混合物：以60mm组织培养皿用420μL反应总体积为例。
准备两支1.5mL离心管，一管将质粒DNA（总量2-8μg为佳）加入240μL HBS 中，混匀。
另一管中则用HBS将100μM的PEI储存液稀释成10μM，充分混合。
然后取180μL10μM PEI溶液加入含有DNA的HBS中，充分混匀后室温静置20-30min。
最后将这420μL的PEI-DNA混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀，置于含5％～7％CO的37℃温箱2孵育。
注：每次用100μM的PEI储存液前都需要先将其充分混匀，保证所取的浓度一致。
3.培养6-10h后更换为37℃预热的含有血清的培养基，继续培养，16h左右可以观测到报告基因的表达。
siRNA的转染
siRNA的转染将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种:1。
磷酸钙共沉淀将氯化钙,RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量,因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2.电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子.将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平(50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染.4。
机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪(biolistic particl e）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5。
阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体.这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同.使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA—阳离子脂质体复合物。
sirna转染实验步骤及实验要点
sirna转染实验步骤及实验要点siRNA转染实验步骤如下：1.细胞接种：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度在30%左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。
2.转染过程：•取0.67μg (50pmol) 的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
•取1μl的EntransterTM-R4000，然后加入24μl无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。
室温静置5分钟。
•将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
•将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。
注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
•转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。
3.观察和检测：根据具体实验需求，可以在转染后的不同时间点观察细胞状态、检测基因表达、蛋白质表达等。
实验要点：1.细胞接种密度要适宜，一般在30%左右汇合度较好。
2.无血清稀释液的选择对于siRNA的稳定性和转染效率至关重要。
建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640等品牌。
3.在制备转染复合物时，要保证各个步骤的混合均匀，避免产生气泡。
4.在将转染复合物加入细胞时，要保证细胞的生存环境，避免对细胞造成损伤。
5.在转染后的观察和检测中，要注意保证实验结果的准确性和可靠性。
以上信息仅供参考，建议查阅专业文献获取更准确的信息。
真核细胞转染实验报告
一、实验目的1. 掌握真核细胞转染的基本原理和操作方法。
2. 学习通过转染技术将外源基因导入真核细胞，并观察基因表达情况。
3. 了解转染效果的评价方法。
二、实验原理真核细胞转染是指将外源DNA或RNA分子导入真核细胞的过程。
根据转染方法的不同，可以分为物理转染、化学转染和电穿孔转染等。
本实验采用化学转染方法，利用脂质体介导外源基因进入细胞。
三、实验材料1. 真核细胞：HEK293细胞2. 外源基因：绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒3. 脂质体：Lipofectamine 20004. 实验试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、二甲基亚砜（DMSO）、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、激光共聚焦显微镜等。
四、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板中，培养至细胞密度达到80%左右。
2. 外源基因质粒制备：将GFP表达质粒用DMSO溶解，配制成浓度为10μg/μl的储备液。
3. 转染：取2孔细胞，分别加入100μl含有10μg GFP表达质粒的DMSO溶液和100μl Lipofectamine 2000溶液，混匀后室温放置5分钟。
将混合液加入细胞中，轻柔混匀，37℃、5%CO2培养箱中培养6小时。
4. 实时荧光定量PCR检测：转染后24小时，提取细胞总RNA，进行反转录得到cDNA。
以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测GFP基因的表达水平。
5. 激光共聚焦显微镜观察：转染后48小时，观察细胞中GFP的表达情况。
五、实验结果1. 实时荧光定量PCR结果：转染组GFP基因的表达水平明显高于未转染组，表明外源基因已成功导入细胞。
2. 激光共聚焦显微镜观察：转染组细胞中GFP表达明亮，荧光信号明显；未转染组细胞中GFP表达较弱，荧光信号不明显。
六、实验讨论1. 脂质体转染方法具有操作简便、效率较高、对细胞损伤较小等优点，适用于多种真核细胞的转染。
2. 转染效果受多种因素影响，如转染试剂、转染时间、细胞密度等。
HighGene plus Transfection reagent 说明书
HighGene plus Transfection reagent说明书货号：RM09014P规格：1mL，10mL◆产品描述HighGene plus Transfection reagent细胞转染试剂是一种新型的混合型高分子聚合物转染试剂。
它可以与核酸（包括质粒、siRNA、寡聚核苷酸）相互作用形成一种复合物将核酸转运到真核细胞内，适用于大部分真核细胞的细胞转染。
◆产品特点1、适用于多种细胞类型和培养板。
2、高转染效率、批次稳定重复性好、操作简单。
3、转染过程不受血清和抗生素的影响。
◆保存条件-20℃保存，24个月有效。
◆操作说明1、贴壁细胞转染（以293T细胞为例）（1）第一天，将293T细胞接种到6孔板中，细胞密度控制在70%-90%为宜；注：根据实验需求，可以选择不同的细胞培养装置，细胞接种数量和所需培养液体积详见附表1（2）第二天，先取4μg质粒加入到200μL无血清DMEM基础培养基离心管中，吹打混合均匀，然后加入8μL HighGene plus转染试剂，吹打混合；注：MEM、1640、F12等基础培养基均可用于HighGene plus转染试剂的溶剂，不同的细胞培养装置所需质粒的量和HighGene plus转染试剂剂量详见附表2（3）将200μL质粒/HighGene plus转染试剂复合物均匀滴加到6孔细胞培养板孔中，轻轻晃动细胞培养板使其均匀分布；注：6孔板中为完全培养基，轻轻晃动细胞培养板即可，切勿剧烈摇动细胞培养板，以免细胞脱落漂浮！（4）细胞转染4-6h后，半量更换新鲜完全培养基；注：半量换液时，吸弃一半原有完全培养基，补加一半新鲜完全培养基（5）细胞转染24-48h后，即可使用适当方式进行检测，如RT-PCR、Western、ELISA、报告基因等，或加入相应筛选药物（G418或Puromycin）可获得稳定细胞株。
2、悬浮细胞转染（以HEK293F细胞为例）（1）第一天，在125mL摇瓶中接种30mL密度为1×106个/mL HEK293F悬浮细胞；（2）第二天，先取30μg质粒加入到3mL无血清DMEM基础培养基离心管中，吹打混合均匀，然后加入60μL HighGene plus转染试剂，吹打混合均匀；（3）将3mL质粒/HighGene plus转染试剂复合物均匀滴加到30mL体积HEK293F悬浮细胞的125mL摇瓶中，轻轻摇动摇瓶使其混合均匀；（4）细胞转染3-5天后，根据蛋白表达的情况（胞内表达或分泌表达），收集细胞或细胞培养上清，进行后续蛋白纯化操作。
北京普利莱基因技术有限公司DOTAP真核细胞转染试剂使用说明说明书
DOTAP真核细胞转染试剂使用说明C1510描述：DOTAP是一种阳离子脂质体，可与DNA或RNA形成稳定的转染复合物进入细胞，并将核酸释放入细胞内。
它以可靠性和高效性著称，是广泛使用的商品化转染试剂。
我们的DOTAP真核细胞转染试剂是由DOTAP 和中性辅助脂质以特定比例融合制备而成的单层脂质体悬液。
这种制备方法增加了脂质体对真核细胞转染的高效性、广谱性、低毒性和可靠性，并使试剂在4°C储存至少稳定12个月。
DOTAP可高效转染多种细胞，甚至在低浓度血清环境也可工作良好。
它属于可被生物降解的脂质体因而细胞毒性明显降低，其转染效率高于Sigma公司的DOTAP单体转染试剂，与Invitrogen的LipofectAMINE相当，但其价格仅相当同类试剂的1/3。
转染时只需将稀释的DOTAP试剂与DNA溶液混合并室温放置15分钟即可加入细胞。
1ml DOTAP可转染100-500µg DNA或50-100只35mm培养皿或250-1000孔24孔板细胞。
颜色：清亮或略呈白色胶体溶液。
储存：4°C储存12个月。
切勿冻存。
适用：将DNA、RNA、寡聚核苷酸转入真核细胞。
适用于大多数传代或原代细胞。
转染步骤：以生长于24孔板的一个孔内的贴壁细胞为例，使用其它规格培养皿参见表一。
细胞准备：转染前一天传0.5-2x105细胞于24孔板内，加1ml正常培养基培养。
在光镜下观察细胞，当细胞群覆盖培养瓶皿生长表面的85-95%时，为DOTAP转染的最佳时机。
这通常需要18-24小时，但依细胞类型和接种量而变。
注意：传代时接种过多的细胞，100%长满的细胞的转化效率明显降低制备转染复合物：对特定细胞类型来说，应该优化加入DNA(µg)和DOTAP(µl)比率和绝对量，参见后面附表。
推荐DNA和DOTAP 的初始比例为1:4。
DNA(µg)：DOTAP(µl)＝1:2～1:8转染实际上是人为造成细胞对外源物质的高摄取状态，因此过量摄入DNA和转染试剂将导致细胞毒性而降低转染效率。
cho高效瞬时表达方法
cho高效瞬时表达方法
CHO细胞高效瞬时表达方法是一种用于瞬时转染真核细胞的方法，该方法使用一种重组的腺病毒或质粒载体将外源基因瞬时转染入CHO细胞。
这种方法的优点是转染效率高，能够实现大规模的基因表达和生产，并且可以在短时间内完成实验。
CHO细胞高效瞬时表达方法的具体步骤包括：
1.准备重组质粒或腺病毒载体：将目的基因克隆到质粒或腺病毒载体中，并进行测序验证。
2.转染CHO细胞：将重组质粒或腺病毒载体与CHO细胞混合，通过特定的转染试剂将其导入细胞中。
3.筛选阳性克隆：在转染后的一段时间内，通过特定的筛选方法，如抗生素筛选或荧光激活细胞分选（FACS），从众多的细胞中筛选出阳性克隆。
4.扩大培养：将筛选出的阳性克隆进行扩大培养，以获得更多的目的基因产物。
5.收集产物：在目的基因产物积累到一定量后，收集产物并进行纯化和质量检测。
CHO细胞高效瞬时表达方法的应用范围广泛，可以用于抗体、重组蛋白、siRNA等生物制品的生产和研究。
siRNA的转染
siRNA的转染将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2.电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particl e）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5.阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。
使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。
质粒转化细胞转染步骤
质粒转化细胞转染步骤质粒转化和细胞转染是两种常用的实验技术，用于将外源DNA引入到细胞中。
一般情况下，质粒转化用于细菌细胞，而细胞转染适用于非细菌的真核细胞。
以下将详细介绍质粒转化和细胞转染的步骤。
一、质粒转化质粒转化是将外源质粒DNA转移到细菌细胞中。
它通常与革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）一起使用，并且可以通过化学法、热冲击法或电穿孔法进行。
1.预处理细菌细胞：将细菌单克隆培养在含有抗生素的培养基中，以筛选出含有质粒的细胞。
通常使用革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。
2.质粒DNA处理：将质粒DNA与细菌细胞一起孵育，以促进质粒与细菌细胞的结合。
孵育时间和孵育条件取决于所使用的方法。
3.转化：将孵育混合物涂布在含有适当营养物和抗生素的琼脂平板上，使质粒转移到接收细胞中。
4.筛选和鉴定：根据在琼脂平板上形成的菌落的形态、大小、颜色等特征进行筛选。
同时，还可以通过PCR、限制性酶切、测序等方法鉴定是否成功转化。
二、细胞转染细胞转染是将外源DNA引入到真核细胞中。
常见的方法包括化学转染、电穿孔转染和病毒载体转染。
1.预处理细胞：将目标细胞培养在适当的培养基中，使其达到适宜的生长状态。
2.DNA和转染试剂处理：将外源DNA与转染试剂（如转染剂、细胞渗透剂等）共同孵育，以增加DNA进入细胞的效率。
3.转染：将DNA和转染试剂的混合物加入到细胞培养物中，启动转染过程。
不同的转染方法有不同的具体操作步骤，如化学转染通过溶液浸泡法将DNA引入细胞，电穿孔转染通过电脉冲打开细胞膜孔，病毒载体转染通过病毒感染细胞等。
4.培养和筛选：将转染后的细胞培养在适宜的培养条件下，保证其正常生长。
根据转移的DNA携带的标记或筛选标志基因，使用特定的培养基或抗生素进行筛选。
5.鉴定：通过PCR、蛋白质表达分析、荧光染色等方法检测外源DNA 是否成功进入细胞，并得到所需的表达或功能。
综上所述，质粒转化和细胞转染是两种将外源DNA引入到细胞中的常见方法。
siRNA-mate 转染试剂使用步骤及说明 (2)
siRNA-mate 转染试剂使用步骤及说明产品介绍与其它转染试剂比较，siRNA-mate 转染效率高、细胞存活率高、毒性小。
可广泛用于瞬时和稳定转染，也可以应用于蛋白表达和基因功能的研究。
转染试剂保存在4℃，有效期2 年。
重要提示1. 细胞的状态：转染时贴壁细胞的密度以30 - 50%为佳，而且转染时细胞应处在生长旺盛的对数生长期。
细胞密度过高和细胞传代数过高会影响转染效果。
2. siRNA 的质量：使用高纯度的siRNA 也是转染成功的关键。
在转染前需确定siRNA 的含量和纯度，实验过程中需要使用DEPC 处理过的耗材和试剂，注意避免RNase 污染。
3. 血清的影响：在制备siRNA-mate和siRNA 形成复合体过程中不能添加血清，建议用OPTIMEM 或其他无血清培养基（如DMEM、RPMI-1640 等）稀释siRNA 和转染试剂，以达到复合物形成的最佳效果。
但是，在随后的转染过程中，血清的存在并不影响复合体的转染效果。
4. 转染试剂的用量：对于一定量的siRNA 建议尝试按照推荐剂量的siRNA-mate 转染试剂进行优化，以确定最佳的转染效率。
以24 孔板为例，每10pmol siRNA 可使用0.5 μl，1 μl，1.5 μl 和2 μl 转染试剂作为初步实验条件。
操作流程（24 孔板）以24孔板为例，若要检测基因沉默的效果，推荐最低siRNA 终浓度10 nM；若要在显微镜下从荧光强度看转染效率，因荧光信号被检测到需要一定的敏感度，推荐siRNA 终浓度50 nM。
遵循以下操作方法可以高效地将siRNA 转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞。
但是对某些特殊的细胞系和培养条件，或特殊应用等，也许需要单独特别优化。
A. 细胞铺板贴壁细胞数量：在转染实验之前的18 - 24 个小时，在每个孔的500 μl 生长培养基中加入1.5 - 3.5 × 104 个细胞（确保转染时细胞密度在30- 50%）。
细胞转染sop
细胞转染步骤细胞转染是将外源分子如DNA，RNA导入真核细胞的技术。
它已成为一种研究基因表达调控，基因突变分析，蛋白质生产的常规方法，其应用范围越来越广。
细胞转染可分为瞬时转染和稳定转染两大类：瞬时转染，外源基因进入受体细胞后，存在于游离载体上，不整合在细胞的染色体上。
此时，外源DNA仍然以附加的形式存在于细胞内，因此，mRNA或蛋白质产物必须在短时间（1-3天）内进行测定或分析，而且质粒的人工构想和拷贝数可能会导致特异性调控元件失活或具有特异功能。
其优点是快捷、简单，易于对结果进行分析，因此成为启动子功能分析的首选方法。
稳定转染，外源DNA整合到宿主细胞的染色体上。
由于外源基因被整合到细胞的染色体中，使得调控区能更精确的模拟正常功能，对随后的转录分析没有时间限制。
缺点是需要进行药物筛选和细胞扩增，因此操作难度大，需要的周期较长。
转染的常见方法有：（一）物理介导法：电击法、显微注射法、基因枪法（二）化学介导法：DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、脂质体法（三）病毒介导法：腺病毒法、逆转录病毒法现在对于很多普通细胞系，常用的是瞬时转染方法中的脂质体法。
下面介绍下细胞转染的具体步骤：1.转染前准备：转染前一天，取生长状况良好的细胞，经胰酶消化成单个细胞后，计数。
根据实验需要，铺合适细胞量在板中，使第二天转染时的细胞密度达到80-90%。
2、细胞转染（1）在做转染实验前一般给细胞更换新鲜的完全培养基，并置于培养箱中继续培养。
最好是加入加血清但不含抗生素的培养基。
（2）准备几个无菌的1.5ml EP管，并做好标记。
一支EP管上标记DNA（即质粒的名字），一支EP管上标记lipofectamine2000。
（3）分别在两支EP管加入50微升的opti-MEM。
（4）在标记质粒的EP管里加入质粒，另一支EP管里加入脂质体。
（5）分别轻轻混匀，室温静置5min。
（6）再将含有质粒的opti-MEM培养基加入到含有脂质体的opti-MEM的培养基中。
neofect转染试剂说明书中文
NeoFect是一种用于将DNA或RNA转染到真核细胞中的转染试剂。
以下是一个简化的、假设性的NeoFect转染试剂说明书的中文翻译，请注意，这不是官方翻译，仅供参考。
实际使用时，请参考随产品附带的正式说明书和安全数据表（SDS）。
---NeoFect转染试剂说明书【产品名称】通用名：转染试剂商品名：NeoFect【成分】主要成分为阳离子脂质体，用于促进核酸分子与细胞膜的融合。
【性状】本品为透明至微浑浊的液体，通常以小瓶或多孔板包装。
【适应症】用于科研实验中，将DNA或RNA高效转染到哺乳动物细胞中，以进行基因表达、基因沉默、基因编辑等研究。
【使用方法】1. 准备待转染的细胞和核酸溶液（DNA或RNA）。
2. 根据实验设计，将适量的NeoFect转染试剂加入无血清培养基中，轻轻混匀。
3. 将核酸溶液加入含有NeoFect的培养基中，轻轻混匀，室温孵育15-30分钟。
4. 将混合物加入到细胞培养皿中，轻轻摇晃使混合均匀。
5. 根据细胞类型和实验目的，孵育一定时间后更换为完全培养基继续培养。
【不良反应】本品仅供实验室使用，不适用于临床治疗。
【禁忌】对本品成分过敏者禁用。
【注意事项】1. 使用前请检查试剂是否清澈，如有沉淀或颜色变化请勿使用。
2. 避免反复冻融，分装后请立即使用。
3. 使用过程中请遵守实验室安全操作规程，佩戴适当的个人防护装备。
4. 请在无RNA酶和DNA酶的环境中操作RNA转染实验。
5. 转染效率受多种因素影响，如细胞状态、核酸浓度、孵育时间等，建议优化实验条件。
【贮藏】存放于4°C冰箱中，避免冷冻。
【有效期】请参考包装标签上的说明。
【生产批号】见包装标签。
【生产企业】（请填写生产企业名称和联系方式）---以上信息仅供参考，实际使用时请遵循产品附带的正式说明书和安全数据表（SDS）的内容。
在操作前，务必了解所有相关的安全和健康信息。
真核细胞转染操作方法——【感受态细胞的制备及其转化技术】
真核细胞转染操作方法一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。
不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。
一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。
不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。
需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。
由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。
利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途：(1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。
(2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。
(3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。
(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的情况。
(5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。
(6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为mRNA的基因组序列得到表达。
(7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。
DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。
目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。
进行真核转染的一般程序：1克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。
细胞稳定转染方法
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
Lipofectamine 2000转染说明
CAT. NO. 11668-027 Size:CAT. NO. 11668-019 Size: ml4℃储存（不要冻存）说明：Lipofectamin TM2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点：对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在的细胞系数据库中有各种细胞转染成功的实例。
在含有或是不含有血清的培养基中，DNA- Lipofectamin TM 2000复合物能够直接加给细胞。
在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养4-6小时后需要除去复合物。
关于转染的一些重要建议：1.不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。
在上有转染步骤，登陆后点击说明。
2.对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(μg)与Lipofectamine TM 2000(μl)的比例在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。
注意：在混合之前，我们建议用Opti-MEM I 低血清培养基（Cat: ）（reduced serum medium）稀释Lipofectamine TM2000和DNA.3.为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化混浊度。
此外，在实验过程中保证相同的接种条件。
4.为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。
5.由于一些无血清复合物（如CD239、SFM II、VP-SFM）会抑制阳离子脂质体介导的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和Lipofectamine TM 2000的相容性。
转染步骤（用于DNA）：按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。
对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。
步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。
1.贴壁细胞：转染的前一天，在500μl无抗生素培养基中接种×105个细胞，以保证在转染时候细胞的混浊度达到90%-95%。
细胞转染实验
第二次细胞传代 1） 在转染后 24 小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2） 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度 0.8X105 个细胞/35mm 培养
皿将细胞重新粉入培养皿中。 3） 在正常条件下培养 24 小时后按照染色要求条件固定。
转染条件优化可以参考 TransFast 的使用说明书。
细胞转染 1）转染试剂的准备
A. 将 400ul 去核酸酶水加入管中，震荡 10 秒钟溶解脂状物。 B.震荡后将试剂放在－20 摄氏度保存，使用前还需震荡，。
2） 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA 质量）来转染细胞。 在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的 MyoD 或者 EGFP 的 DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 5） 将混合液在室温放置 10—15 分钟。 6) 吸去培养板中的培养基，用 PBS 或者无血清培养基清洗一次。 7） 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 8） 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养 24－48 小时。
上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。 本次实验采用的脂质体是 promega 公司的 TransFast 脂质体试剂，它是一种阳离 子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的 293T 细胞优化的转 染试剂。
3. 实验材料与器材 1）材料 293T 细胞 MyoD 表达质粒和 EGFP 表达质粒 DMEM 培养基 链霉素/青霉素（双抗） FCS（小牛血清） PBS（磷酸盐缓冲溶液） 胰酶/EDTA 消化液 转染试剂（TransFast） 2）器材 20ul/200ul/1ml 微量移液器和 Tip 头 酒精灯 废液缸 血球计数板 涡旋振荡器 提示转染之前的试剂配制要充分混匀 恒温水浴箱 台式离心机 35mm 培养皿 转染管 15ml 离心管 观察用倒置显微镜 荧光显微镜和 CCD
[说明]转染详细步骤大攻略
![[说明]转染详细步骤大攻略](https://img.taocdn.com/s3/m/8d4c02e6bb68a98270fefa98.png)
[说明]转染详细步骤大攻略转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下: 1)质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下:(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
(注:如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低)(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
(注:混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏)(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
(注:溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清)(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。
(6)37?水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
Lipofectamine-2000转染说明
Lipofectamine TM 2000CAT. NO. 11668-027 Size: 0.75mlCAT. NO. 11668-019 Size: 1.5 ml4℃储存（不要冻存）说明：Lipofectamin TM 2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点：●对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在的细胞系数据库中有各种细胞转染成功的实例。
●在含有或是不含有血清的培养基中，DNA- Lipofectamin TM 2000复合物能够直接加给细胞。
●在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养4-6小时后需要除去复合物。
关于转染的一些重要建议：1.不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。
在上有转染步骤，登陆后点击说明。
2.对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(μg)与Lipofectamine TM2000(μl)的比例在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。
注意：在混合之前，我们建议用Opti-MEM I 低血清培养基（Cat: NO.31985-062）（reduced serum medium）稀释Lipofectamine TM 2000和DNA.3.为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化混浊度。
此外，在实验过程中保证相同的接种条件。
4.为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。
5.由于一些无血清复合物（如CD239、SFM II、VP-SFM）会抑制阳离子脂质体介导的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和Lipofectamine TM 2000的相容性。
转染步骤（用于DNA）：按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。
对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。
步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。
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一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。
不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。
一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。
不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。
需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如位于细胞膜表面的受体或细胞外的激素和酶，则更需要使用真核转染技术。
由于DNA导入哺乳动物细胞有关技术方法的发展，使真核表达成为可能。
利用克隆化的真核基因在哺乳动物细胞中表达蛋白质，具有以下多种不同用途：
(1) 通过对所编码的蛋白质进行免疫学检测或生物活性测定，确证所克隆的基因。
(2) 对所编码的蛋白质须进行糖基化或蛋白酶水解等翻译后加工的基因进行表达。
(3) 大量生产从自然界中一般只能小量提取到的某些生物活性蛋白。
(4) 研究在各种不同类型细胞中表达的蛋白质的生物合成以及在细胞内转运的
情况。
(5) 通过分析正常蛋白质及其突变体的特性，阐明蛋白质结构与功能的关系。
(6) 使带有内含子而不能在原核生物如酵母中正确转录为 mRNA的基因组序列
得到表达。
(7) 揭示某些与基因表达调控有关的DNA序列元件。
DNA转染技术现已变成研究基因功能和组分的重要工具，已发展了很多转染方法，并成功应用于转染各种细胞。
目前广泛应用方法有磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。
进行真核转染的一般程序：
克隆目的基因(经测序验证)-准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中-转染-筛选-鉴定
下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。
一、试剂准备
1、HBS(Hepes-buffered saline)：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。
2、核酸贮存液，过滤除菌。
3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。
二、操作步骤
(一)克隆目的基因
1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。
2、回收特异性扩增片段，连入T载体。
3、转化DH5α，质粒制备。
4、酶切初步鉴定，测序证实。
(二) 真核重组表达载体的构建：
pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗
生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。
重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切
回收插入片段和pcDNA3线性片段
T4连接酶连接
转化DH5α
质粒制备
BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。
(三)重组pcDNA3转染SHG-44细胞：
1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418 分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。
以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。
2、在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。
进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。
一般要求，6孔培养皿(35mm)，每孔1-2ml培养基3×105细胞。
依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。
典型贴壁细胞平板密度生物科研
3、 SHG-44细胞的转染：
(1) 转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。
(2) 准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。
① 溶液A：用HBS稀释DNA(pcDNA3、重组pcDNA3)各1.5μg 到总体积50μl(30μg/ml)。
②溶液B：用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl(120μg/ml)。
③混合溶液A
和B，轻柔混合(不要振荡)，室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。
(3) 不要移去培养基，逐滴加入100μl 脂质体/DNA混合物(从培养孔一边到另一边)，边加边轻摇培养板。
(4) 37℃孵育6hr。
(5) 6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。
(6) 转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。
4、 G418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。
(一)筛选结果鉴定：
(1)基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因
(2)SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达(Western-blot)。
(3)测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响
流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。
②细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。
③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算
克隆形成率抑制率。
三、注意事项
1、优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。
用于转染的核酸应高度纯化。
为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。
但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。
2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。
但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。
3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。
脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。