第三章_沉淀技术

•温度的影响：高离子强度溶液中，温度升高一般使β 下降（温度升高利于盐的溶解，夺取更多的水分子，使 蛋白质溶解性更差） lgS =β-ksI
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3）、盐析分类
lgS =β-ksI
1. ks盐析：固定蛋白质的pH 、T（ β ）,变动离子 强度I达到沉淀的目的。
2. β盐析：在一定的离子强度下（ I ） ，改变溶液 的pH、T ，达到沉淀的目。
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讨论 1）、KsI项
Ks与溶液的pH、温度无关，仅取决于蛋白质的性 质和盐的种类。 盐浓度↑→离子强度I↑→S↓→析出。 lgS =β-ksI
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2）、β值的特性及对盐析的影响 •表示不外加盐时的理想溶解度S，与盐的种类无关， 但与温度、pH有关； •pH的影响：pI时蛋白质溶解度最低，β在pI时最小（ 调节pH可以导致蛋白质净电荷数变化）
相互作用，此时生物分子很容易相互聚集，在溶
液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中
析出。
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• 盐析机理归纳
1）.盐离子与蛋白质分子争夺水分子，破坏了蛋 白质表面的水化膜； 2）.盐离子电荷的中和作用； 3）.盐离子引起了原本在蛋白质分子周围有序排 列的水分子的极化，使水活度降低。 注： 水活度：水分含量的活性部分或自由水。
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（2）脱水作用
由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同
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盐析
（1）、继续增大中性盐离子强度时→大量的盐夺取了 自由水，使水分子在盐离子表面聚集→蛋白质胶体 外层的水化膜因盐的夺取而遭到破坏→蛋白质胶体 表面的疏水区域暴露出来，彼此相互聚集，沉淀；
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（2）、加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表
面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分
子表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的
第三章 沉淀技术
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概述
一.沉淀的定义 • 沉淀是溶液中的溶质有液相变成固相析出的过程，表示 一个新的凝结相的形成过程，或由于加入沉淀剂使某些 离子成为难溶化合物而沉积的过程。
• 沉淀VS结晶，本质上同一种过程。
• 同类分子或离子以有规则排列形式析出——结晶； • 以无规则的紊乱排列形式析出——沉淀。
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蛋白质溶液稳定的原因：1.自身带同种电荷，2.水化膜 自身带同种电荷：
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水化膜： • 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、 －NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分 子相互作用形成水化膜，包围于蛋白质分子周围形 成1nm~100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子 之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水 化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越 大，因而溶解度也越大。
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（3）离心或过滤，收集沉淀物
•对于高浓度的硫酸铵溶液一般采用过 滤的方法，因为离心要较高的转速的 时间。 •对于低浓度的硫酸铵溶液则多采用离 心的方法。
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7、盐析后处理工作——脱盐 由于盐析沉淀产物中含盐量较高，所以通过盐析 法得到蛋白质后需要经过脱盐处理。 脱盐最常用的方法：透析法。 原理：大分子不能透过半透膜，小分子例如无机 盐、单糖，可以透过膜扩散到水或缓冲液中。
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（4）盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离 过高的盐溶液密度能够干扰蛋白质的沉降和沉淀 物的收集，并且沉淀下来的目的产物中可能混有 大量的盐，不利于目的产物的回收。
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4、 常用的几种盐 1. 最常用(NH4)2SO4， 优点： （1）溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度 ，这是其他盐类所不具备的。
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温度的影响 • 对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强 度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。 • 在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数 还是随浓度升高而增加的。
• 一般情况下，～4℃下操作，以避免活力丧 失。
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6、盐析的操作与应用 盐析的操作方法过程 加入沉淀剂——沉淀物的陈化——离心过滤收集沉淀物
此外，还要考虑：不易引起蛋白质的变性；价格低廉 ；是否有毒性。
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（1）相同离子浓度条件下，不同种类盐对同一种蛋白 质的盐析效果不同；
例：不同种类盐对一氧化碳血红蛋白影响不同 （p26 图3-4）
所以选用盐的时候要考虑的不同盐的盐析效果， 常见阴离子的盐析效果：PO43- > SO42- > CH3COO- > Cl- > NO3 - > ClO4 - > I - > SCN – 常见阴离子的盐析效果：NH4+>K+>Na+>Mg+
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2、盐析公式及讨论
蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系： lgS =β-KsI
S，蛋白质溶解度（g/L） I，离子强度=(1/2)∑cizi2 ci为i离子的摩尔浓度，zi为i离子所带的电荷数。 β为常数，I=0时的lgS Ks为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半 径等）、蛋白结构有关，Ks越大，盐析效果越 好（S越小，越易沉淀）
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三.沉淀技术的应用特点 • 设备简单，成本低，小批量生产。（豆腐，胶体凝 聚）； • 有选择性（不同的溶剂可以沉淀出不同的成分出来 ）； • 沉淀剂的选择要考虑对生物活性的破坏作用和对人 体的残留毒害。
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四.沉淀方法的分类
盐析法
有机溶剂沉淀
选择性变性沉淀
等电点沉淀
有机聚合物沉淀
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第一节 盐析法
可达数年之久。 缺点： 硫酸铵腐蚀性比较强，后期处理困难，残留在食品中
会影响食品的风味；临床治疗中具有毒性，在最终产
品中必须完全除去。
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2. 次常用Na2SO4。缺点：在30℃以下溶解度较低， 主要用于热稳定蛋白。
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5、盐析的影响因素 盐饱和度和离子类型 1）不同的蛋白质盐析，要求的盐饱和度不同。
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（2）高溶解度，能配臵高离子强度的盐溶液； 离子强度的升高，可以降低加速盐析的过程，所 以要求盐析用盐能够配制高离子强度的盐溶液。
lgS =β-ksI
常用盐析剂在水中的溶解度：P26 表3-1
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（3）溶解度受温度的影响小
许多蛋白质需要在较低的温度下分离，高温下蛋 白质容易失活，这就要求所选用的盐析盐必须在 较低的温度下也有较高的溶解度。（P26 表3-1 ）
3. ks盐析用于蛋白质粗品的分级沉淀。 4. β分段盐析用于蛋白质进一步的精细分离纯化。
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3、 无机盐的挑选原则 • 相同离子浓度条件下，不同种类盐对同一种蛋白质 的盐析效果不同； • 高溶解度，能配臵高离子强度的盐溶液； • 溶解度受温度的影响小；
• 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；
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1、原理 （1）静电作用 降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降 低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶 剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，带电的蛋白质 溶质分子之间相互作用增强，使其相互吸引而聚集， 导致蛋白质溶解度降低而沉淀。
介电常数表征的是电介质的束缚电荷的能力，极性越大，介电 常数越大。
加入沉淀剂：加入盐析盐的过程
沉淀物的陈化：聚集产生沉淀的过程
离心过滤收集沉淀物：收集析出沉淀的过程
下面以硫酸铵盐析法为例介绍盐析法操作过程。
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1）加入沉淀剂
• 硫酸铵盐使用前处理 重金属离子对蛋白质巯基有敏感作用，硫酸铵中常 含有少量重金属离子，所以要进行预处理。
硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成本， 一般选用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行预处理 ，可通过化学法将重金属除去（如通入H2S后过滤） ，再将硫酸铵重结晶备用。
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3）. 透析平衡法 将要盐析的样品臵于透析袋中，浸入饱和硫酸铵溶 液中透析，透析袋中硫酸铵饱和度逐步提高，达到 一定饱和度后，目的蛋白质析出，停止透析。 特点：硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好， 但手续繁琐，要不断测量饱和度，所以多用于结晶。
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（2）沉淀物的陈化 高分子溶液在防止过程中自发的聚集而沉淀的 现象称为陈化现象。 为了提高盐析的效率，盐析后一般需放臵0.5-1h， 待沉淀完全后才可以过滤离心，过早的分离将 影响收率。
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25℃调整硫酸铵饱和度查询表
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2）. 加入饱和硫酸铵溶液法（需要量小时）。
取过量硫酸铵加热溶解，在0℃或室温放臵，直至 固体析出，得到饱和溶液，饱和度调整计算公式 V=V0 (S2—S1)/(1—S2)
V为应加入饱和硫酸铵溶液的体积，
V0 是蛋白质溶液的原始体积， S2是所要达到的硫酸铵饱和度， S1 原来溶液的硫酸铵饱和度。
盐析：一般指溶液中加入无机盐类使某种物质 溶解度降低而析出的过程。
蛋白质盐析—蛋白质在水溶液中的溶解度受盐 浓度影响
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一、基本原理
蛋白质溶解：相似者相溶 亲水性和疏水性：
有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团 、离子化侧链、亲水蛋白所占比例等。 如白蛋白。 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团 、疏水蛋白所占比例等。如纤维蛋白原 。
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1.盐溶和盐析
• •
当向蛋白质溶液中加入电解质时，蛋白质的溶解 度首先将随电解质的增加而增大，这种现象称为 盐溶； 当继续加入电解质时，蛋白质的溶解度减小，发 生聚集而沉淀，这种现象称为盐析。
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盐溶 原理：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在 的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐 溶现象。蛋白质分子吸附盐类离子后，带电表层使蛋白质 分子彼此排斥（同性相斥）；而蛋白质与水分子的相互作 用却加强，溶解性增大。
例如：硫酸铵盐分离血浆中蛋白质，饱和度达到 20%时，纤维蛋白原首先析出，饱和度增至28%33%优球蛋白析出，33%-50%，拟球蛋白析出，大 于50%，白蛋白析出。
2）离子种类对蛋白质溶解度也有一定的影响，通 常离子半径小而带高电荷的离子的影响较强，半 径大而带低电荷的离子影响较弱。