第三章_沉淀技术
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•温度的影响：高离子强度溶液中，温度升高一般使β 下降（温度升高利于盐的溶解，夺取更多的水分子，使 蛋白质溶解性更差） lgS =β-ksI
17
3）、盐析分类
lgS =β-ksI
1. ks盐析：固定蛋白质的pH 、T（ β ）,变动离子 强度I达到沉淀的目的。
2. β盐析：在一定的离子强度下（ I ） ，改变溶液 的pH、T ，达到沉淀的目。
15
讨论 1）、KsI项
Ks与溶液的pH、温度无关，仅取决于蛋白质的性 质和盐的种类。 盐浓度↑→离子强度I↑→S↓→析出。 lgS =β-ksI
16
2）、β值的特性及对盐析的影响 •表示不外加盐时的理想溶解度S，与盐的种类无关， 但与温度、pH有关； •pH的影响：pI时蛋白质溶解度最低，β在pI时最小（ 调节pH可以导致蛋白质净电荷数变化）
1) 高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀， 若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉 淀作用。 2) 低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降 低。较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相 当于25 mg/mL～30mg/mL。
28
pH值对盐析的影响 在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质 的等电点附近，提高盐析效率。
43
（2）脱水作用
由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同
29
温度的影响 • 对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强 度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。 • 在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数 还是随浓度升高而增加的。
• 一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度
敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧 失。
30
6、盐析的操作与应用 盐析的操作方法过程 加入沉淀剂——沉淀物的陈化——离心过滤收集沉淀物
3. ks盐析用于蛋白质粗品的分级沉淀。 4. β分段盐析用于蛋白质进一步的精细分离纯化。
18
3、 无机盐的挑选原则 • 相同离子浓度条件下，不同种类盐对同一种蛋白质 的盐析效果不同； • 高溶解度，能配臵高离子强度的盐溶液； • 溶解度受温度的影响小；
• 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；
例如：硫酸铵盐分离血浆中蛋白质，饱和度达到 20%时，纤维蛋白原首先析出，饱和度增至28%33%优球蛋白析出，33%-50%，拟球蛋白析出，大 于50%，白蛋白析出。
2）离子种类对蛋白质溶解度也有一定的影响，通 常离子半径小而带高电荷的离子的影响较强，半 径大而带低电荷的离子影响较弱。
27
蛋白质的浓度
33
25℃调整硫酸铵饱和度查询表
34
2）. 加入饱和硫酸铵溶液法（需要量小时）。
取过量硫酸铵加热溶解，在0℃或室温放臵，直至 固体析出，得到饱和溶液，饱和度调整计算公式 V=V0 (S2—S1)/(1—S2)
V为应加入饱和硫酸铵溶液的体积，
V0 是蛋白质溶液的原始体积， S2是所要达到的硫酸铵饱和度， S1 原来溶液的硫酸铵饱和度。
3
三.沉淀技术的应用特点 • 设备简单，成本低，小批量生产。（豆腐，胶体凝 聚）； • 有选择性（不同的溶剂可以沉淀出不同的成分出来 ）； • 沉淀剂的选择要考虑对生物活性的破坏作用和对人 体的残留毒害。
4
四.沉淀方法的分类
盐析法
有机溶剂沉淀
选择性变性沉淀
等电点沉淀
有机聚合物沉淀
5
第一节 盐析法
14
2、盐析公式及讨论
蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系： lgS =β-KsI
S，蛋白质溶解度（g/L） I，离子强度=(1/2)∑cizi2 ci为i离子的摩尔浓度，zi为i离子所带的电荷数。 β为常数，I=0时的lgS Ks为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半 径等）、蛋白结构有关，Ks越大，盐析效果越 好（S越小，越易沉淀）
可达数年之久。 缺点： 硫酸铵腐蚀性比较强，后期处理困难，残留在食品中
会影响食品的风味；临床治疗中具有毒性，在最终产
品中必须完全除去。
25
2. 次常用Na2SO4。缺点：在30℃以下溶解度较低， 主要用于热稳定蛋白。
26
5、盐析的影响因素 盐饱和度和离子类型 1）不同的蛋白质盐析，要求的盐饱和度不同。
此外，还要考虑：不易引起蛋白质的变性；价格低廉 ；是否有毒性。
19
（1）相同离子浓度条件下，不同种类盐对同一种蛋白 质的盐析效果不同；
例：不同种类盐对一氧化碳血红蛋白影响不同 （p26 图3-4）
所以选用盐的时候要考虑的不同盐的盐析效果， 常见阴离子的盐析效果：PO43- > SO42- > CH3COO- > Cl- > NO3 - > ClO4 - > I - > SCN – 常见阴离子的盐析效果：NH4+>K+>Na+>Mg+
42
1、原理 （1）静电作用 降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降 低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶 剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，带电的蛋白质 溶质分子之间相互作用增强，使其相互吸引而聚集， 导致蛋白质溶解度降低而沉淀。
介电常数表征的是电介质的束缚电荷的能力，极性越大，介电 常数越大。
相互作用，此时生物分子很容易相互聚集，在溶
液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中
析出。
13
• 盐析机理归纳
1）.盐离子与蛋白质分子争夺水分子，破坏了蛋 白质表面的水化膜； 2）.盐离子电荷的中和作用； 3）.盐离子引起了原本在蛋白质分子周围有序排 列的水分子的极化，使水活度降低。 注： 水活度：水分含量的活性部分或自由水。
38
（3）离心或过滤，收集沉淀物
•对于高浓度的硫酸铵溶液一般采用过 滤的方法，因为离心要较高的转速的 时间。 •对于低浓度的硫酸铵溶液则多采用离 心的方法。
39
7、盐析后处理工作——脱盐 由于盐析沉淀产物中含盐量较高，所以通过盐析 法得到蛋白质后需要经过脱盐处理。 脱盐最常用的方法：透析法。 原理：大分子不能透过半透膜，小分子例如无机 盐、单糖，可以透过膜扩散到水或缓冲液中。
22
（4）盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离 过高的盐溶液密度能够干扰蛋白质的沉降和沉淀 物的收集，并且沉淀下来的目的产物中可能混有 大量的盐，不利于目的产物的回收。
23
4、 常用的几种盐 1. 最常用(NH4)2SO4， 优点： （1）溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度 ，这是其他盐类所不具备的。
36
3）. 透析平衡法 将要盐析的样品臵于透析袋中，浸入饱和硫酸铵溶 液中透析，透析袋中硫酸铵饱和度逐步提高，达到 一定饱和度后，目的蛋白质析出，停止透析。 特点：硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好， 但手续繁琐，要不断测量饱和度，所以多用于结晶。
37
（2）沉淀物的陈化 高分子溶液在防止过程中自发的聚集而沉淀的 现象称为陈化现象。 为了提高盐析的效率，盐析后一般需放臵0.5-1h， 待沉淀完全后才可以过滤离心，过早的分离将 影响收率。
2
二. 沉淀的类型：
1. 晶形沉淀：颗粒最大，其直径大约在0.1~1 μm之间 。在沉淀内部，离子按晶体结构有规则地进行排列 ，因而结构紧密，整个沉淀所占的体积较小，极易 沉降于容器底部。
2. 无定型沉淀：颗粒最小，其直径大约在0.02 μm以 下。沉淀内部离子排列杂乱无章，并且包含有大量 水分子，因而结构疏松，体积庞大，难以沉降。 3. 凝乳状沉淀：颗粒大小介于上述二者之间，其直径 大约为0.02~1 μm，因此其性质也介于二者之间。
20
（2）高溶解度，能配臵高离子强度的盐溶液； 离子强度的升高，可以降低加速盐析的过程，所 以要求盐析用盐能够配制高离子强度的盐溶液。
lgS =β-ksI
常用盐析剂在水中的溶解度：P26 表3-1
21
（3）溶解度受温度的影响小
许多蛋白质需要在较低的温度下分离，高温下蛋 白质容易失活，这就要求所选用的盐析盐必须在 较低的温度下也有较高的溶解度。（P26 表3-1 ）
由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操 作也要求在低温下（0～4℃）进行。硫铵在0℃时的溶 解度70.6g/100mL ，Na2SO4 -4.9, NaH2PO4 -1.6
(p26 表3-Leabharlann Baidu)
24
（2）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。
有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存
优级纯≥ 99.8% 分析纯≥ 99.7% 化学纯≥ 99.5%
32
加盐的方法
（1）.固体硫酸铵加入法（需要量大时）。
将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次 地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更 要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而 造成不应有的蛋白质沉淀。 特定温度下，各种不同饱和度应加入的硫酸 铵的量可以从下表查出。
9
1.盐溶和盐析
• •
当向蛋白质溶液中加入电解质时，蛋白质的溶解 度首先将随电解质的增加而增大，这种现象称为 盐溶； 当继续加入电解质时，蛋白质的溶解度减小，发 生聚集而沉淀，这种现象称为盐析。
10
盐溶 原理：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在 的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐 溶现象。蛋白质分子吸附盐类离子后，带电表层使蛋白质 分子彼此排斥（同性相斥）；而蛋白质与水分子的相互作 用却加强，溶解性增大。
加入沉淀剂：加入盐析盐的过程
沉淀物的陈化：聚集产生沉淀的过程
离心过滤收集沉淀物：收集析出沉淀的过程
下面以硫酸铵盐析法为例介绍盐析法操作过程。
31
1）加入沉淀剂
• 硫酸铵盐使用前处理 重金属离子对蛋白质巯基有敏感作用，硫酸铵中常 含有少量重金属离子，所以要进行预处理。
硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成本， 一般选用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行预处理 ，可通过化学法将重金属除去（如通入H2S后过滤） ，再将硫酸铵重结晶备用。
所以采用半透膜作为透析膜，逐步更换低盐缓冲 液可以达到脱盐效果。
40
透析
over
41
第二节 有机溶剂沉淀法
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子 生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之 一，常用丙酮、异丙酮、乙醇、甲醇等
定义： 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂 ，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分 离纯化方法，称为有机溶剂沉淀法。
11
盐析
（1）、继续增大中性盐离子强度时→大量的盐夺取了 自由水，使水分子在盐离子表面聚集→蛋白质胶体 外层的水化膜因盐的夺取而遭到破坏→蛋白质胶体 表面的疏水区域暴露出来，彼此相互聚集，沉淀；
12
（2）、加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表
面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分
子表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的
盐析：一般指溶液中加入无机盐类使某种物质 溶解度降低而析出的过程。
蛋白质盐析—蛋白质在水溶液中的溶解度受盐 浓度影响
6
一、基本原理
蛋白质溶解：相似者相溶 亲水性和疏水性：
有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团 、离子化侧链、亲水蛋白所占比例等。 如白蛋白。 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团 、疏水蛋白所占比例等。如纤维蛋白原 。
第三章 沉淀技术
1
概述
一.沉淀的定义 • 沉淀是溶液中的溶质有液相变成固相析出的过程，表示 一个新的凝结相的形成过程，或由于加入沉淀剂使某些 离子成为难溶化合物而沉积的过程。
• 沉淀VS结晶，本质上同一种过程。
• 同类分子或离子以有规则排列形式析出——结晶； • 以无规则的紊乱排列形式析出——沉淀。
7
蛋白质溶液稳定的原因：1.自身带同种电荷，2.水化膜 自身带同种电荷：
8
水化膜： • 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、 －NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分 子相互作用形成水化膜，包围于蛋白质分子周围形 成1nm~100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子 之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水 化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越 大，因而溶解度也越大。
35
饱和溶液加入法是指将预先调好pH的饱和硫酸铵 溶液逐步加至相应的蛋白质溶液中，使其达到一定 的硫酸铵浓度（或饱和度），令蛋白质沉淀下来。
适用范围： 适用于饱和度不高，原来溶液体积不大的情况，如 果加入饱和溶液后，体积过大，应改用固体加入法 为好。
注意： 加入饱和溶液时，应边搅拌边少量分批缓慢加入， 防止局部浓度过高，影响分离效果。
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3）、盐析分类
lgS =β-ksI
1. ks盐析：固定蛋白质的pH 、T（ β ）,变动离子 强度I达到沉淀的目的。
2. β盐析：在一定的离子强度下（ I ） ，改变溶液 的pH、T ，达到沉淀的目。
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讨论 1）、KsI项
Ks与溶液的pH、温度无关，仅取决于蛋白质的性 质和盐的种类。 盐浓度↑→离子强度I↑→S↓→析出。 lgS =β-ksI
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2）、β值的特性及对盐析的影响 •表示不外加盐时的理想溶解度S，与盐的种类无关， 但与温度、pH有关； •pH的影响：pI时蛋白质溶解度最低，β在pI时最小（ 调节pH可以导致蛋白质净电荷数变化）
1) 高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀， 若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉 淀作用。 2) 低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降 低。较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相 当于25 mg/mL～30mg/mL。
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pH值对盐析的影响 在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质 的等电点附近，提高盐析效率。
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（2）脱水作用
由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同
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温度的影响 • 对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强 度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。 • 在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数 还是随浓度升高而增加的。
• 一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度
敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧 失。
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6、盐析的操作与应用 盐析的操作方法过程 加入沉淀剂——沉淀物的陈化——离心过滤收集沉淀物
3. ks盐析用于蛋白质粗品的分级沉淀。 4. β分段盐析用于蛋白质进一步的精细分离纯化。
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3、 无机盐的挑选原则 • 相同离子浓度条件下，不同种类盐对同一种蛋白质 的盐析效果不同； • 高溶解度，能配臵高离子强度的盐溶液； • 溶解度受温度的影响小；
• 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离；
例如：硫酸铵盐分离血浆中蛋白质，饱和度达到 20%时，纤维蛋白原首先析出，饱和度增至28%33%优球蛋白析出，33%-50%，拟球蛋白析出，大 于50%，白蛋白析出。
2）离子种类对蛋白质溶解度也有一定的影响，通 常离子半径小而带高电荷的离子的影响较强，半 径大而带低电荷的离子影响较弱。
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蛋白质的浓度
33
25℃调整硫酸铵饱和度查询表
34
2）. 加入饱和硫酸铵溶液法（需要量小时）。
取过量硫酸铵加热溶解，在0℃或室温放臵，直至 固体析出，得到饱和溶液，饱和度调整计算公式 V=V0 (S2—S1)/(1—S2)
V为应加入饱和硫酸铵溶液的体积，
V0 是蛋白质溶液的原始体积， S2是所要达到的硫酸铵饱和度， S1 原来溶液的硫酸铵饱和度。
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三.沉淀技术的应用特点 • 设备简单，成本低，小批量生产。（豆腐，胶体凝 聚）； • 有选择性（不同的溶剂可以沉淀出不同的成分出来 ）； • 沉淀剂的选择要考虑对生物活性的破坏作用和对人 体的残留毒害。
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四.沉淀方法的分类
盐析法
有机溶剂沉淀
选择性变性沉淀
等电点沉淀
有机聚合物沉淀
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第一节 盐析法
14
2、盐析公式及讨论
蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系： lgS =β-KsI
S，蛋白质溶解度（g/L） I，离子强度=(1/2)∑cizi2 ci为i离子的摩尔浓度，zi为i离子所带的电荷数。 β为常数，I=0时的lgS Ks为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半 径等）、蛋白结构有关，Ks越大，盐析效果越 好（S越小，越易沉淀）
可达数年之久。 缺点： 硫酸铵腐蚀性比较强，后期处理困难，残留在食品中
会影响食品的风味；临床治疗中具有毒性，在最终产
品中必须完全除去。
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2. 次常用Na2SO4。缺点：在30℃以下溶解度较低， 主要用于热稳定蛋白。
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5、盐析的影响因素 盐饱和度和离子类型 1）不同的蛋白质盐析，要求的盐饱和度不同。
此外，还要考虑：不易引起蛋白质的变性；价格低廉 ；是否有毒性。
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（1）相同离子浓度条件下，不同种类盐对同一种蛋白 质的盐析效果不同；
例：不同种类盐对一氧化碳血红蛋白影响不同 （p26 图3-4）
所以选用盐的时候要考虑的不同盐的盐析效果， 常见阴离子的盐析效果：PO43- > SO42- > CH3COO- > Cl- > NO3 - > ClO4 - > I - > SCN – 常见阴离子的盐析效果：NH4+>K+>Na+>Mg+
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1、原理 （1）静电作用 降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降 低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶 剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，带电的蛋白质 溶质分子之间相互作用增强，使其相互吸引而聚集， 导致蛋白质溶解度降低而沉淀。
介电常数表征的是电介质的束缚电荷的能力，极性越大，介电 常数越大。
相互作用，此时生物分子很容易相互聚集，在溶
液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中
析出。
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• 盐析机理归纳
1）.盐离子与蛋白质分子争夺水分子，破坏了蛋 白质表面的水化膜； 2）.盐离子电荷的中和作用； 3）.盐离子引起了原本在蛋白质分子周围有序排 列的水分子的极化，使水活度降低。 注： 水活度：水分含量的活性部分或自由水。
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（3）离心或过滤，收集沉淀物
•对于高浓度的硫酸铵溶液一般采用过 滤的方法，因为离心要较高的转速的 时间。 •对于低浓度的硫酸铵溶液则多采用离 心的方法。
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7、盐析后处理工作——脱盐 由于盐析沉淀产物中含盐量较高，所以通过盐析 法得到蛋白质后需要经过脱盐处理。 脱盐最常用的方法：透析法。 原理：大分子不能透过半透膜，小分子例如无机 盐、单糖，可以透过膜扩散到水或缓冲液中。
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（4）盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离 过高的盐溶液密度能够干扰蛋白质的沉降和沉淀 物的收集，并且沉淀下来的目的产物中可能混有 大量的盐，不利于目的产物的回收。
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4、 常用的几种盐 1. 最常用(NH4)2SO4， 优点： （1）溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度 ，这是其他盐类所不具备的。
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3）. 透析平衡法 将要盐析的样品臵于透析袋中，浸入饱和硫酸铵溶 液中透析，透析袋中硫酸铵饱和度逐步提高，达到 一定饱和度后，目的蛋白质析出，停止透析。 特点：硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好， 但手续繁琐，要不断测量饱和度，所以多用于结晶。
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（2）沉淀物的陈化 高分子溶液在防止过程中自发的聚集而沉淀的 现象称为陈化现象。 为了提高盐析的效率，盐析后一般需放臵0.5-1h， 待沉淀完全后才可以过滤离心，过早的分离将 影响收率。
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二. 沉淀的类型：
1. 晶形沉淀：颗粒最大，其直径大约在0.1~1 μm之间 。在沉淀内部，离子按晶体结构有规则地进行排列 ，因而结构紧密，整个沉淀所占的体积较小，极易 沉降于容器底部。
2. 无定型沉淀：颗粒最小，其直径大约在0.02 μm以 下。沉淀内部离子排列杂乱无章，并且包含有大量 水分子，因而结构疏松，体积庞大，难以沉降。 3. 凝乳状沉淀：颗粒大小介于上述二者之间，其直径 大约为0.02~1 μm，因此其性质也介于二者之间。
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（2）高溶解度，能配臵高离子强度的盐溶液； 离子强度的升高，可以降低加速盐析的过程，所 以要求盐析用盐能够配制高离子强度的盐溶液。
lgS =β-ksI
常用盐析剂在水中的溶解度：P26 表3-1
21
（3）溶解度受温度的影响小
许多蛋白质需要在较低的温度下分离，高温下蛋 白质容易失活，这就要求所选用的盐析盐必须在 较低的温度下也有较高的溶解度。（P26 表3-1 ）
由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操 作也要求在低温下（0～4℃）进行。硫铵在0℃时的溶 解度70.6g/100mL ，Na2SO4 -4.9, NaH2PO4 -1.6
(p26 表3-Leabharlann Baidu)
24
（2）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。
有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存
优级纯≥ 99.8% 分析纯≥ 99.7% 化学纯≥ 99.5%
32
加盐的方法
（1）.固体硫酸铵加入法（需要量大时）。
将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次 地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更 要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而 造成不应有的蛋白质沉淀。 特定温度下，各种不同饱和度应加入的硫酸 铵的量可以从下表查出。
9
1.盐溶和盐析
• •
当向蛋白质溶液中加入电解质时，蛋白质的溶解 度首先将随电解质的增加而增大，这种现象称为 盐溶； 当继续加入电解质时，蛋白质的溶解度减小，发 生聚集而沉淀，这种现象称为盐析。
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盐溶 原理：大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在 的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐 溶现象。蛋白质分子吸附盐类离子后，带电表层使蛋白质 分子彼此排斥（同性相斥）；而蛋白质与水分子的相互作 用却加强，溶解性增大。
加入沉淀剂：加入盐析盐的过程
沉淀物的陈化：聚集产生沉淀的过程
离心过滤收集沉淀物：收集析出沉淀的过程
下面以硫酸铵盐析法为例介绍盐析法操作过程。
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1）加入沉淀剂
• 硫酸铵盐使用前处理 重金属离子对蛋白质巯基有敏感作用，硫酸铵中常 含有少量重金属离子，所以要进行预处理。
硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成本， 一般选用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行预处理 ，可通过化学法将重金属除去（如通入H2S后过滤） ，再将硫酸铵重结晶备用。
所以采用半透膜作为透析膜，逐步更换低盐缓冲 液可以达到脱盐效果。
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透析
over
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第二节 有机溶剂沉淀法
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子 生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之 一，常用丙酮、异丙酮、乙醇、甲醇等
定义： 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂 ，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分 离纯化方法，称为有机溶剂沉淀法。
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盐析
（1）、继续增大中性盐离子强度时→大量的盐夺取了 自由水，使水分子在盐离子表面聚集→蛋白质胶体 外层的水化膜因盐的夺取而遭到破坏→蛋白质胶体 表面的疏水区域暴露出来，彼此相互聚集，沉淀；
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（2）、加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表
面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分
子表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的
盐析：一般指溶液中加入无机盐类使某种物质 溶解度降低而析出的过程。
蛋白质盐析—蛋白质在水溶液中的溶解度受盐 浓度影响
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一、基本原理
蛋白质溶解：相似者相溶 亲水性和疏水性：
有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团 、离子化侧链、亲水蛋白所占比例等。 如白蛋白。 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团 、疏水蛋白所占比例等。如纤维蛋白原 。
第三章 沉淀技术
1
概述
一.沉淀的定义 • 沉淀是溶液中的溶质有液相变成固相析出的过程，表示 一个新的凝结相的形成过程，或由于加入沉淀剂使某些 离子成为难溶化合物而沉积的过程。
• 沉淀VS结晶，本质上同一种过程。
• 同类分子或离子以有规则排列形式析出——结晶； • 以无规则的紊乱排列形式析出——沉淀。
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蛋白质溶液稳定的原因：1.自身带同种电荷，2.水化膜 自身带同种电荷：
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水化膜： • 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、 －NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分 子相互作用形成水化膜，包围于蛋白质分子周围形 成1nm~100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子 之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水 化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越 大，因而溶解度也越大。
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饱和溶液加入法是指将预先调好pH的饱和硫酸铵 溶液逐步加至相应的蛋白质溶液中，使其达到一定 的硫酸铵浓度（或饱和度），令蛋白质沉淀下来。
适用范围： 适用于饱和度不高，原来溶液体积不大的情况，如 果加入饱和溶液后，体积过大，应改用固体加入法 为好。
注意： 加入饱和溶液时，应边搅拌边少量分批缓慢加入， 防止局部浓度过高，影响分离效果。