蛋白质免疫印迹技术
蛋白质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）
蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。
它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或⽣物组织样品进⾏着⾊。
通过分析着⾊的位置和着⾊深度获得特定蛋⽩质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋⽩免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋⽩质从凝胶转移到固相⽀持物NC膜或PVDF膜上，然后⽤特异性抗体检测某特定抗原的⼀种蛋⽩质检测技术，现已⼴泛应⽤于基因在蛋⽩⽔平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个⽅⾯。
⼀提起Western blot，⼤家会不禁联想到Southern blot和Northern blot。
其实它们的名字也是个有趣的故事。
1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。
之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授⼜发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。
George Stark这位⽜⼈教授在两年后⼜开发出类似的蛋⽩质检测⽅法。
1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。
为什么当时没叫Eastern blot呢？这⽆从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。
30年来， Western blot技术已成为蛋⽩质研究中最常⽤的⼯具。
它的标准流程如下：蛋⽩质⾸先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相⽀持物上，固相⽀持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。
⾸先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的⾮特异性吸附，这样固定的蛋⽩质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作⽤。
最后通过放射、⽣⾊或化学发光的⽅法进⾏定位。
Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。
immunoblotting免疫印迹法
immunoblotting免疫印迹法免疫印迹法（Immunoblotting）免疫印迹法是一种常用的实验技术，用于检测和分析蛋白质的存在与表达水平。
它结合了免疫学和电泳技术，能够帮助研究者确定特定蛋白质的分子量、定量和免疫反应性。
本文将对免疫印迹法的原理、操作流程和应用范围进行探讨。
一、免疫印迹法的原理免疫印迹法的原理基于抗原抗体反应。
首先，待检样品经过电泳分离，然后将蛋白质从凝胶转移到聚丙烯酰胺膜上。
接着，利用一系列步骤将目标蛋白质与特异性的一抗和二抗结合，形成特异性的免疫复合物。
最后，通过酶促发色反应，将免疫复合物标记出来，产生相应的信号。
二、免疫印迹法的操作流程1. 样品制备：待检样品应首先经过蛋白提取、浓缩和纯化处理，以保证分析的准确性。
其中关键的步骤是蛋白质的电泳分离，常用的方法有SDS-PAGE和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2. 转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚丙烯酰胺膜上，常用的方法有湿式和半湿式转印。
湿式转印适用于小分子量蛋白质，而半湿式转印适用于大分子量蛋白质。
3. 阻断：将转印膜放入含有蛋白质的阻断缓冲液中，防止非特异性结合。
通常使用的阻断缓冲液有牛奶粉、鸡蛋清或BSA。
4. 孵育：将特异性一抗加入阻断缓冲液中，与目标蛋白质发生特异性结合。
一抗的选择应该根据具体的研究目的来确定。
5. 洗涤：将转印膜反复洗涤以去除非特异性结合的抗体和杂质。
洗涤缓冲液的选择应该根据一抗的种类来确定。
6. 结合：加入特异性的二抗，与一抗结合形成免疫复合物。
二抗通常是由小鼠或兔子制备的抗小鼠或反兔子的抗体。
7. 洗涤：再次洗涤以去除未结合的二抗和杂质。
8. 检测：利用酶标技术将免疫复合物标记出来。
常用的酶标方法有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
酶标反应产生的信号可以使用荧光、发光或显色来检测。
9. 分析：通过分析免疫印迹结果，可以确定目标蛋白质的存在与表达水平。
常用的分析方法有荧光成像、蛋白质印迹仪和密度分析软件。
蛋白质免疫印迹技术
将蛋白质免疫印迹技术与基因测序技术相结合，有助于解析基因表达与蛋白质功能之间的关联，为精准医学和个性化 治疗提供有力支持。
与单细胞测序技术结合
通过将蛋白质免疫印迹技术与单细胞测序技术相结合，可以在单细胞水平上研究蛋白质的表达和功能， 揭示细胞异质性和疾病发生发展机制。
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改进方向
优化样品处理方法 简化样品制备过程，提高处理效 率，降低对实验技能的要求。
提高检测灵敏度和特异性 通过改进技术和方法，提高蛋白 质免疫印迹技术的检测灵敏度和 特异性，进一步减少背景干扰和 假阳性结果。
缩短实验周期 通过改进技术和方法，减少实验 步骤和时间，提高实验效率。
降低成本 寻找更经济实惠的抗体、显影剂 和其他试剂，降低实验成本。
研发自动化、智能化的蛋白质免 疫印迹系统，简化操作流程，减 少人为误差，提高实验效率和准 确性。
定量分析能力
发展蛋白质免疫印迹技术的定量 分析能力，实现蛋白质表达水平 的准确测量，为深入研究生物过 程和疾病机制提供有力支持。
应用领域的拓展
临床诊断
将蛋白质免疫印迹技术应用于临床诊断，为疾病诊断、病情监测和 预后评估提供可靠的蛋白质标志物检测手段。
转膜
选择合适的转移膜
根据实验需求，选择适当的转移 膜，如硝酸纤维素膜或聚偏二氟
乙烯膜。
预处理转移膜
将转移膜在缓冲液中浸泡，使其充 分湿润。
转膜
将凝胶上的蛋白质条带转移到预处 理的转移膜上，完成转膜过程。
抗体孵育与显色
01
一抗孵育
将特异性抗体与转印到膜上的蛋 白质进行孵育，使抗体与目标蛋 白质结合。
原理
基于抗原-抗体反应的特异性，通过将蛋白质样品电泳分离后转印至固相支持物 上，再与特异性抗体进行反应，通过显色反应检测目标蛋白质的存在、表达量 及修饰状态等信息。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
蛋白质免疫印迹技术
2
特异性
该技术能够高度特异性地识别并检测目标蛋白,即使在复杂的生物样品中也不会产生交叉反应。
3
检测限
得益于优化的实验步骤和灵敏的检测方法,免疫印迹技术的检测限可达到皮克摩尔级别,能够灵敏检测极微量的目标蛋白。
4
重复性
该技术具有良好的实验重复性,可以准确定量并复制实验结果,为蛋白质研究提供可靠的数据支持。
蛋白质定量分析
可以利用Western blot结果对特定蛋白的相对含量进行定量分析,为进一步的生物学研究提供数据支持。
结果可视化展示
Western blot采用化学发光检测,可以清晰地显示蛋白条带,结合分子量标准进行数据分析和解读。
实验数据处理
数据分析
实验结果的数据处理通常包括绘制图表、统计分析和计算参数。数据分析可以揭示实验结果的趋势和特点,为后续的实验设计和结果解释提供依据。
技术改进方向
提高灵敏度
通过优化实验条件和试剂配方,不断提高免疫印迹技术的检测敏感度,以更准确地识别低丰度蛋白。
增强特异性
开发高特异性的抗体,减少非特异性结合,提升识别目标蛋白的准确性。
自动化集成
将实验流程进行自动化处理,实现样品预处理、电泳、转膜、免疫反应等步骤的高度整合,提高操作效率。
数据分析优化
2
结果解释和分析
对实验结果进行深入分析,阐述结果的意义和影响,讨论可能的影响因素。提出合理的解释和推论。
3
图表展示质量
使用恰当的图表、图像等辅助手段,直观、生动地展示实验结果。确保图表制作规范,便于理解和分析。
4
结论和建议
根据实验结果提出明确的结论,并提出后续研究或应用的建议,为后续工作提供参考。
实验设备
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质印迹法的应用及其技术发展
蛋白质印迹法的应用及其技术发展随着生物技术的快速发展和应用，人们对于生物分子表达与功能研究的需求也越来越高。
而蛋白质分子作为生物体中最为基础的机能分子，其研究的重要性也愈加凸显出来。
蛋白质印迹法便是一种应用广泛、有效的手段，用于检测、鉴定和定位目标蛋白质，其在基础研究、医学诊断和药物研发等领域都发挥着重要作用。
一、蛋白质印迹法的工作原理蛋白质印迹法，又称蛋白质免疫印迹法（Western Blotting），是一种广泛应用于蛋白质分子研究中的方法。
它利用特异反应性抗体对于蛋白质分子的亲和作用，将其快速、准确、可靠地检测出来。
现代的蛋白质印迹技术主要包括以下步骤：（1）蛋白质的电泳分离：将目标蛋白标本经SDS-PAGE电泳分离成不同的蛋白质带。
（2）蛋白质的转移：将分离好的蛋白质带通过电泳转移到聚丙烯酰胺薄膜或硝酸纤维素膜上。
（3）膜上目标蛋白的检测：利用与目标蛋白质对应的一抗（Primary Antibody）与膜上相应位置的目标蛋白质发生特异性结合，去除多余抗体，然后利用与一抗对应的二抗（Secondary Antibody）介导的标记物发出染色信号，并用显微摄影的方法记录下来。
二、蛋白质印迹法的应用蛋白质印迹法是一种高度特异性、灵敏度极强的检测手段，其应用在基础研究中具有以下优点：（1）蛋白质的定量和质量鉴定：蛋白质印迹法可以通过“Western blot quantification”等算法，精确地测量样本中目标蛋白的相对含量和质量，同时可以检测出多种不同大小的蛋白。
（2）蛋白质亚细胞定位：蛋白质印迹法结合细胞学分析，可以确定目标蛋白是否定位于细胞膜、细胞核或细胞质内部，同时还能对不同的亚细胞结构进行精确定位，为深入研究细胞内基本过程提供了重要的工具。
（3）蛋白质-蛋白质相互作用：蛋白质印迹法可以通过检测蛋白质-蛋白质之间的相互作用，实现蛋白质复合物结构的解析和对分子交互作用的研究。
三、蛋白质印迹技术的发展趋势随着蛋白质印迹技术的应用范围不断扩大，传统的蛋白质印迹技术也不断创新和改进。
免疫印迹技术(Immunoblotting technique)
免疫印迹技术(Immunoblotting technique)免疫印迹技术又称蛋白质印迹(Western blotting)是一种借助抗原鉴定特异性抗体的有效方法，该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
本实验以检测可提取性核抗原(ENA)抗体为例。
【实验原理】先将ENA混合抗原经SDS-PAGE电泳，使各种抗原成分根据分子量不同区分开来，再通过电转印将各种抗原成分转印到硝酸纤维素薄膜上，血清中抗ENA抗体与硝酸纤维素薄膜上的ENA抗原成分结合，再与碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体结合，形成抗原抗体酶标抗体复合物，洗涤后加入底物显色，根据有无显色带的出现判断抗ENA抗体的有无，显色带的位置判断抗ENA抗体的类型。
【主要试剂与器材】1.ENA多肽抗体谱检测试剂盒包括印有ENA的硝酸纤维素薄膜、碱性磷酸酶记标的抗人IgG抗体、显色液(BCIP/NBT)、浓缩洗涤液和样品缓冲液、终止液、ENA多肽抗体标准带图谱等，有商品供应。
2.待检血清和阳性质控血清3.小型摇床、恒温箱、反应槽、吸管、微量移液器、滤纸等。
【操作方法】1.将浓缩洗涤液、样品稀释液按说明书用蒸馏水进行稀释。
2.抗原条放入反应槽中，每个槽内加入样品稀释液1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体。
3.用样品稀释液将血清1∶10稀释，吸取1.5ml稀释血清加入槽内，置小型摇床上孵育30min。
4.弃去槽内液体，每个槽内加入1∶10稀释的洗涤液 1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体，用吸水纸吸干。
5.吸取1.5ml用样品稀释液1∶10稀释AP标记的抗人 IgG，加入槽内，置小型摇床上孵育30min。
6. 同4洗涤。
7.每个槽内加入底物液1.5ml，置小型摇床上孵育 20min后，弃去槽内液体，用自来水洗净，加入终止液。
8.与标准显色带比较，判断结果。
【结果判断】将印迹膜上出现的显色区带与标准图谱比较，可判断哪种ENA抗体阳性。
蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )
蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB ）标签：western-blot免疫印迹 蛋白质蛋白质免疫印迹可应用于：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒裂解液 PBS SDS上样缓冲液 电泳缓冲液 转移缓冲液 丽春红染液 TBST TBS 洗脱抗体缓冲液 抗体仪器、耗材电泳仪移液器脱色摇床显影仪实验方法原理Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。
蛋白质印迹技术
蛋白质印迹技术蛋白质印迹（Western blotting）是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学办法，又称免疫印迹（immunoblotting )。
1979年，Towbin等将分析DNA的Southern blotting技术扩展到蛋白质的讨论领域，并且和特异、敏捷的免疫分析技术相结合，称之为“Western blotting"（蛋白质印迹）。
免疫印迹可分为两个步骤：将蛋白质由凝胶转移至固相基质上；特异性抗体检测。
试验原理蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分别为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白），将凝胶上的蛋白质以电转印的方式，转印至固相支持物（如硝酸纤维素膜，NC膜）上，再用特异抗体作为探针对靶蛋白举行检测的办法。
因为该办法结合了PAGE的高辨别率和固相免疫反应的高特异性等多种优点，可检测到低至1-5 ng的中等分子量大小的靶蛋白。
仪器和材料电转移装置（电源）；摇床；暗匣；转印夹；浅盘（30cm×15cm×3cm)；玻璃棒；杂交袋或杂交盒；胶片；保鲜膜；滤纸；0. 22μm孔径的硝酸纤维素膜。
试剂 (1) Running Buffer (Tris-甘氨酸电泳缓冲液，1×2500ml) ; 25 mmol/L Tris 7. 55g 250mmol/L甘氨酸 47. 0g 10%SDS 25m1 (2) Transfer Buffer ( Tris-甘氨酸电转膜缓冲液，1× 2500m1，pH＝8.3）：48 mmol/L Tris 14. 50g 39mmol/L 甘氨酸 7. 25g 10% SDS 9. 25ml 20％甲醇 500m1 (3) TTBS缓冲液（pH 7.5，2 ×2500ml)： 20 mmol/L Tris 12. l l g 0. 5 M NaCl 146. 1 g 0.05%Tween 20 2. 5 ml (4) Stripping Buffer（pH2. 0，1000m1)：甘氨酸 1. 8768 SDS 10. 0g (5) 10％牛奶封闭液：称取10. 0g脱脂奶粉，溶于80m1 TTBS（pH7.5 )中，搅拌彻低溶解，后加入TTBS定容至100m1，再加入10μl Thimerosal混匀。
蛋白质印迹法
蛋白质印迹法蛋白质印迹法（ProteinBlotting）是一种用于检测、调控和鉴定蛋白质水平的技术，通常也被称为蛋白质免疫印迹（Immunoblotting）、西方印迹（Western Blotting）或免疫印迹（Immunoblotting）。
它能够快速、准确、重复地测定一个新蛋白质或大量存在的蛋白质，令科学家们能够衡量蛋白质的含量以及细胞蛋白质的变化。
蛋白质印迹法包含用于分离和检测特定蛋白的一系列的步骤。
首先，蛋白质被用碱性和硫酸性溶剂分离出来，然后用紫外线伤害法进行转换，最后通过免疫印迹法测定所需的蛋白质的含量。
蛋白质印迹法的第一步是将细胞蛋白质提取出来，用特定溶剂获得有机液体，其中包含有蛋白质、糖、脂肪酸以及一些其它物质。
用碱性或硫酸性溶液将细胞蛋白质沉淀出来，然后用紫外线伤害法进行转换，将沉淀的蛋白质释放出来，使其可以测定。
接下来的步骤是用免疫印迹法测量特定蛋白质的含量。
这项技术使用对蛋白质特异性的特殊抗体，与待检测蛋白质发生作用，最后将抗体与特定蛋白质结合在一起，使得它们在一个总称为“印迹”的图像上形成可见的标记。
通过观察抗体把特定蛋白质印在“印迹”上时形成的标记，就可以测定检测蛋白质的含量。
蛋白质印迹法在研究蛋白质分子生物学、微生物学、免疫学等各个领域中都发挥着重要作用，在癌症检测中也发挥着重要作用。
通过蛋白质印迹法，研究人员可以快速、准确地测量和监测肿瘤相关的蛋白质，从而有助于癌症的早期发现，从而使得治疗更加有效。
另外，蛋白质印迹法还可以用于研究各种亚细胞定位的蛋白质，有助于科学家们更好地理解蛋白质的功能。
蛋白质印迹法在细胞生物学的研究中也有着重要的应用，它可以帮助科学家们快速、准确地测定细胞里某种蛋白质的含量，从而更好地理解细胞的结构和功能。
总的来说，蛋白质印迹法不仅是一种快速、准确的技术，而且是一种重要的技术，有助于科学家们更好地检测、调控以及鉴定蛋白质水平。
随着科学技术的发展，蛋白质印迹法在治疗和疾病诊断方面也会起到越来越重要的作用。
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。
2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。
其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。
4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。
这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。
5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。
此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。
westernblotting原理
westernblotting原理
Western blotting，又称蛋白质印迹或免疫印迹，是一种用于检测特定蛋白质在复杂样品中的存在和表达水平的分子生物学技术。
其基本原理可以分为以下几个步骤：
1. 蛋白质样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并将其稀释到适合的浓度。
2. 凝胶电泳分离：将提取的蛋白质样品加入凝胶（通常是聚丙烯酰胺凝胶）中，并通过电泳分离。
由于不同蛋白质的带电性质和分子质量不同，它们在凝胶中会分离出不同的条带。
3. 蛋白质转移：将凝胶中的蛋白质转移到一种名为硝酸纤维素（nitrocellulose）或聚偏氟乙烯（PVDF）的膜上。
这一步骤称为蛋白质转移或印迹。
蛋白质通过范德华力或电场力从凝胶转移到膜上，保证了其在膜上的空间位置与在凝胶中一致。
4. blocking：为了减少非特异性结合，需要在膜上加入一种阻断剂（如牛奶或BSA）来覆盖未被蛋白质占据的膜表面。
5. 抗原-抗体反应：将特异性抗体（通常为辣根过氧化物酶或酶联免
疫吸附测定中的酶标记抗体）与膜上的目标蛋白质结合。
这些抗体识别并与其特异性结合的目标蛋白质。
6. 检测和显色：使用一种带有酶的检测抗体（第二抗体）与第一抗体结合。
这种酶标记的第二抗体可以催化底物转化为可见的色产物。
通过化学反应，颜色的深浅与目标蛋白质在样品中的含量成正比。
7. 数据分析：最后，通过图像分析或光密度计来量化膜上的蛋白带，从而分析样品中特定蛋白质的表达水平。
总之，Western blotting是一种强大的技术，可以用于定性和定量分析样品中的特定蛋白质，是分子生物学和生物化学中不可或缺的工具。
immunoblotting免疫印迹法
immunoblotting免疫印迹法免疫印迹法（Immunoblotting）是一种常用的蛋白质检测方法，它通过使用特异性抗体来检测目标蛋白质在复杂的混合物中的存在和量。
免疫印迹法的原理是将蛋白质样品分离后转移到固定膜上，然后用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后通过检测抗体标记物的信号来确定目标蛋白质的存在与数量。
免疫印迹法的步骤如下：1.蛋白质分离：首先，将待测样品进行电泳分离。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，根据蛋白质的分子量大小将其分离成不同的带状条带。
2.转印：将蛋白质从凝胶转移到固定膜上。
这个步骤通常使用西方半湿法或湿法转印，将凝胶和膜夹在一起，通过电流使蛋白质从凝胶逐渐转移到膜上。
3.阻断：为了减少非特异性结合，需要用饱和蛋白或其他蛋白质进行膜的阻断。
常见的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）或非脂干奶粉。
4.抗体结合：将特异性的一抗加入到含有阻断剂的缓冲液中，将膜与抗体溶液一同孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
5.清洗：将膜用洗涤缓冲液洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的成分。
6.检测：将抗体标记物（如荧光素、辣根过氧化物酶等）加入到膜上，使其与结合的抗体发生特异性反应。
通过荧光素的化学反应或辣根过氧化物酶底物的显色反应来产生可见的信号。
这些信号可以通过数字成像系统进行记录和分析。
免疫印迹法的优点包括：能够检测特定蛋白质的存在和量；需要样品量比较小，一般几微克；灵敏度高，可检测到非常低浓度的目标蛋白质；可以同时检测多个蛋白质。
然而，免疫印迹法也存在一些局限性，如需要已知的特异性抗体来进行检测，如果没有可用的抗体，就无法检测目标蛋白质；对于高分子量的蛋白质，由于电泳分离的限制，可能无法很好地分离和转移；部分抗体可能存在交叉反应或非特异性结合问题；荧光或显色信号必须进行定量分析才能获得准确的结果。
总体来说，免疫印迹法是一种常用且可靠的蛋白质检测方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。
蛋白质免疫印迹技术及PPT课件
实验案例二：蛋白质相互作用分析
总结词
蛋白质相互作用分析有助于了解蛋白质之间的相互作用关系，进一步揭示生物学过程的分子机制。
详细描述
在实验中，首先将蛋白质样品进行分离和提纯，然后通过电泳分离蛋白质，再将其转移到膜上。接下 来，利用抗体技术检测两种蛋白质是否相互作用。这种方法可以用于研究蛋白质之间的相互作用关系 ，为生物学过程的研究提供重要信息。
归一化处理
将目标蛋白的密度与内参蛋白的密 度进行归一化，消除实验误差。
统计学分析
对实验组和对照组的数据进行统计 分析，比较组间差异。
数据分析的注意事项
数据可靠性
确保数据来源可靠，避免数据污染和误差。
数据可比性
确保实验条件一致，使数据具有可比性。
数据解读
结合生物学背景和实验目的，对数据进行合理解 读。
凝胶电泳
01
02
03
确定电泳条件
根据蛋白大小和分离需求， 选择合适的凝胶浓度和电 泳电压。
加样与电泳
将稀释后的蛋白样品加入 凝胶的加样孔中，开始电 泳分离蛋白质。
染色与脱色
电泳结束后，对凝胶进行 染色，使蛋白质条带显现 出来，然后进行脱色处理。
转膜
选择合适的转移膜
根据需要，选择NC膜、 PVDF膜等适合的转移膜。
实验操作流程
1. 样品制备
将细胞或组织提取蛋白，进行浓 度测定。
2. 阻断
将膜置于脱脂奶粉或BSA中，封 闭非特异性结合位点。
3. 抗体孵育
将抗体与膜在适当条件下孵育， 使抗体与目标蛋白结合。
6. 结果观察
通过荧光显微镜或其他成像设备 观察蛋白条带。
5. 显影
将荧光染料或其他标记物与抗体 结合，使蛋白在膜上显像。
蛋白质免疫印迹实验(Western Blot
二试剂和器材
2．器材 电转移仪器 恒温摇床 硝酸纤维素薄膜 Whatman 3MM滤纸 电泳仪 裁纸刀 φ25cm培养皿
玻璃棒
三 操作步骤
1蛋白质电转移 戴上手套，取下SDS-PAGE凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶同样大的 硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
其定量关系符合以下公式： Ve=Vo+KV1 Ve：某一溶质的洗脱体积 Vo：层析柱的外水体积 Vi：层析柱的内水体积 K：某一溶质的分配系数
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 39mM甘氨酸 4.8mM Tris碱 0.037% SDS 20% 甲醇 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲醇， 定容到1000ml. 封闭缓冲液：5%（W/V）脱脂奶粉溶于PBS中
一 实验原理
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人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对
RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的 蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电
泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法
三、蛋白免疫印迹的应用
免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT)，亦称酶联 免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB
抗体的结构
（二）用于免疫的动物
由于动物的遗传性不同，同一抗原对不同动物 或同种不同品系动物、或不同个体，产生特异 免疫应答的强弱是不同的。因此，进行动物免 疫时，必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康 动物。 常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一 般为6个月大小的动物。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得 抗血清数量。
抗原的提取与制备 1）0.5mg/mL菠萝蛋白酶以0.9%生理盐水溶 解配置（加少量NaOH促溶）（周二上、周五 上）。 2）纯化的鸡卵类粘蛋白（周四上午）。 3）1mg/mL酪蛋白以0.9%生理盐水溶解配置 （加少量NaOH促溶） （周四下午）。
苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠
标记部位 头 左前肢 组号 1 2
加强免疫：初级免疫后两周进行。 取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水 的形态。 加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小鼠
（1）用酒精棉球消毒待注射部位
（2）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL。 第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。 第二次加强免疫后一周，即可采血，收集抗血清。 小鼠取血。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃ 下，析出血清，离心，3000rpm,10min。吸出血清，分装 （0.05～0.2mL），贮于-20℃以下冰箱保存。
目前实践中常应用的佐剂福氏佐剂。
福氏佐剂（Freund adjuvant）, 通常是由羊 毛脂1份、石腊油5份。这是不完全福氏佐剂。
在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成 为完全佐剂。
（六）免疫方法
抗原剂量，首次剂量为10～50μ g，加强免疫的剂量 约为首次剂量的1/4。 首次免疫时抗原与完全佐剂等体积混合。加强免疫 时用不完全佐剂。 每2～3周加强免疫一次。
效价 抗血清的效价，就是指血清中所含 抗体的浓度或含量。效价测定的方法常用 的是单向扩散免疫法，此法对所有的抗体 均适用。 某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的 抗体，可用双扩散等方法测定。
免疫扩散试验
1－抗原；2－7为不同稀释倍数的抗体
第二部分 Western－blotting 检测抗血清
（三）抗原
抗原是多种多样的，就其化学成分而言，有蛋白 质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。
为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原。
不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种 免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性 基团、立体结构等。
（四）免疫途径
免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉
免疫原性（immunogenicity）是指抗原刺激机体引起免疫应 答的能力。 免疫反应性（immunoreactivity）是指抗原与相应免疫应答 产物(即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力。
抗原的分类
抗原可以分为完全抗原和半抗原。 完全抗原：具有免疫原性和免疫反应性的抗原称 为完全抗原（complete antigen） 半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原 称为半抗原（hapten），也称为不完全抗原 (incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完 全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞 发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂 都属于半抗原。
学习掌握动物抗血清的制备原理及技术 通过实际操作学会动物抗血清的制备 掌握Western－blotting的基本原理 熟悉Western－blotting的实验操作
二、实验原理
第一部分
动物的常规免疫及抗血清的制备
第二部分 Western－blotting 检测抗血清
第一部分
动物的常规免疫及抗血清的制备
因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用 血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应 （serologic reaction）。
二、印迹法（blotting）
印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜 （NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段 的方法，称为Southern 印迹法。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下， 过夜（切勿冰冻）析出血清，离心， 4000rpm,10min。在无菌条件，吸出血清，分装 （0.05～0.2mL），贮于-80℃以下冰箱，或冻干后 贮存于4℃冰箱保存。
（八）抗血清质量的评价
在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在 不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能 发生变化，因而必须经常地采血测试。只有在对抗血 清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后， 才可使用所取得的抗血清。
抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）
是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发 生于体内（in vivo），也可发生于体外（in vitro）。
体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用；
体外反应：可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应 及中和反应等各种不同的反应类型。
在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3mL血， 制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需 再进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达 到预期水平时，即可放血制备抗血清。
抗体的产生顺序与丰度
（七）抗血清的采集与保存
取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血， 一是颈动脉放血，也可心脏采血。 小鼠取血。
样 品 制 备 电 泳
转 膜
杂 交
探 针 制 备 分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图
结 果 显 示
Western Blot原理
将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上； 然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应；
洗涤去除没有结合的特异性抗体后；
加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗 体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合 的标记抗体； 加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等， 观察有无特异性蛋白条带的出现。
免疫印迹的实验包括五个步骤：
⑴ 固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。
⑵ 封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处 于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。
⑶一抗杂交：初级抗体（第一抗体）是特异性 的。 ⑷二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗 体是特异性结合并作为指示物。
将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间，动 物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清 称为免疫血清。
优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫 原性，以及动物应答的能力。此外，尚需考虑免疫途 径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因 素。
（一）多克隆抗体的概念
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。 由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接 受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体 （Monoclone antibody）。 由多个抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种 各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起 就是多克隆抗体。 机体内所产生的抗体就是多克隆抗体。
如要获得大量的抗体，多采用大动物； 如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物； 如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备 抗体； 如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯 系小鼠制备。
一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备，因动物反应 良好，而且能够提供足够数量的血清。
抗原和免疫原性
抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细 胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特 异性反应的物质。 常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋 白质、核酸、激素等有机物。 抗原具有两方面的特性：免疫原性（immunogenicity） 和免疫反应性（immunoreactivity）。
抗体的种类
抗体（antibodies，Ab)是专门对抗抗原特异 结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白 （immunoglobulins, Ig)。存在于血清、体液 中，是构成机体免疫作用的主要物质。
免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同， 分为五种类型： IgG、 IgA、 IgM、 IgD和 IgE。 人体血清中IgG含量最多， IgA次之， IgM较 少， IgD和IgE微量。
左后肢
背 右前肢 右后肢 左耳朵 右耳朵
3
4 5 6 7 8
初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小 鼠 （1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL 完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态
（2）用酒精棉球消毒待注射部位
（3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL
初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两 周后进行加强免疫