TAK1通过调控p38 MAPK信号通路影响肾小管上皮细胞纤维化

TAK1通过调控p38 MAPK信号通路影响肾小管上皮细胞纤

维化

DING Wen-fei;SONG Lei;LIU Hai-yun;QIN Jian-hua;CAO Ling;GAO Li-chao;OU San-tao;WU Wei-hua

【摘要】目的:探讨转化生长因子β激活激酶1(TAK1)对肾小管上皮细胞纤维化的影响及机制.方法:以肾小管上皮细胞HK-2作为研究对象,用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肾小管上皮细胞纤维化,以real-time PCR和Western blot检测细胞中TAK1表达的变化.用TAK1 shRNA慢病毒感染肾小管上皮细胞,以real-time PCR 和Western blot检测其对TGF-β1刺激下肾小管上皮细胞中TAK1表达的影响以检测干扰效果.ELISA法检测细胞分泌的I型胶原和III型胶原水平,Western blot法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CT-GF)和磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182)的蛋白水平.用p38 MAPK激活剂处理已敲减TAK1表达的肾小管上皮细胞,检测其对细胞分泌I型胶原和III型胶原的影响及对细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182蛋白水平的影响.结果:TGF-β1可以明显上调肾小管上皮细胞中TAK1的表达水平.TAK1 shRNA 可明显下调TGF-β1刺激下的肾小管上皮细胞中TAK1的表达水平.TGF-β1处理后的肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原增多,细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182蛋白水平升高.敲减TAK1表达可以明显抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原,减少细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182的蛋白水平(P<0.05).p38 MAPK激活剂处理可以逆转敲减TAK1表达对肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原及α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182蛋白水平的抑制作用.结论:敲减TAK1表达能够通过抑制p38 MAPK信号通路而降低TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化水平.

【期刊名称】《中国病理生理杂志》

【年(卷),期】2019(035)007

【总页数】6页(P1248-1253)

【关键词】肾小管上皮细胞;转化生长因子β激活激酶1;p38MAPK信号通路;纤维化

【作者】DING Wen-fei;SONG Lei;LIU Hai-yun;QIN Jian-hua;CAO Ling;GAO Li-chao;OU San-tao;WU Wei-hua

【作者单位】;;;;;;;

【正文语种】中文

【中图分类】R692.9;R363.2

肾组织纤维化是常见慢性肾脏疾病发生的基础，其主要以肾小管间质纤维化和肾小球硬化为主要特征[1]。肾小管上皮细胞损伤是肾纤维化发生的基础，转化生长因

子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)具有促进肾小管上皮细胞分泌纤维化因子的作用[2]，是肾组织纤维化发生的关键诱导因子之一。转化生长因子β

激活激酶1(TGF-β activated kinase 1，TAK1)是一种典型的苏氨酸/丝氨酸蛋白

激酶，经TGF-β的刺激而激活，参与胰岛素敏感、糖脂代谢和中枢神经系统发育

等生理过程[3-4]。TAK1参与炎症、免疫反应和纤维化等相关疾病的发生，TAK1还可以通过调控细胞内多种信号的转导和基因的转录表达发挥多种生物学作用[5]。目前的研究显示，TAK1在肾组织纤维化发生时表达上调，并能够促进p38丝裂

原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)信号通

路的激活[6-7]。为了探讨TAK1在肾小管上皮细胞纤维化过程中的作用，本研究

用TGF-β1刺激肾小管上皮HK-2细胞模拟构建肾小管上皮细胞纤维化模型，检测肾小管上皮细胞纤维化因子的表达情况，为明确肾组织纤维化发生机制提供依据。材料和方法

1 材料

肾小管上皮细胞HK-2购自中国上海中科院细胞库。细胞培养液用含10%胎牛血

清的DMEM/F12，细胞密度为90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代，细胞在

37 ℃、饱和湿度、5% CO2条件下培养。反转录试剂盒购自Promega；ECL显

色试剂盒购自Perkin-Elmer Life Sciences；抗TAK1抗体和抗磷酸化

TAK1Ser412(p-TAK1Ser412)抗体购自Jackson；I型胶原检测试剂盒和III型胶

原检测试剂盒购自上海玉博生物科技有限公司；抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体和抗结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗体和抗p38 MAPK抗体购自PeproTech；抗磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182)抗体购自Santa Cruz；TGF-β1购自R&D Systems。

2 方法

2.1 实验分组 HK-2细胞用含终浓度为10 μg/L和0 μg/L TGF-β1的细胞培养液

培养24 h，记为TGF-β1处理组和对照(control)组，以real-time PCR和Western blot方法检测细胞中TAK1表达的变化。

2.2 Real-time PCR检测TGF-β1诱导的HK-2细胞TAK1 mRNA的表达收集

HK-2细胞，在细胞中添加TRIzol裂解液，提取细胞中总RNA。以总RNA作为

模板，合成cDNA，体系包括0.5 μL AMV reverse transcriptase、0.5 μL random primer、1 μL dNTP mixture、2 μL sample RNA、2 μL RT buffer和0.5 μL RNase inhibitor，添加RNase free H2O至3.5 μL，按照42 ℃ 60 min，