示差分光光度法
分光度光度法
分光度光度法分光光度法学习资料一、分光光度法的基本概念1. 定义- 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
它利用物质对光的选择性吸收特性，不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长的光有不同程度的吸收。
2. 原理基础- 朗伯 - 比尔定律（Lambert - Beer law）是分光光度法的基本定律。
- 朗伯定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与光通过的路径长度成正比，即A = k_1b（其中A为吸光度，b为光程长度，k_1为比例常数）。
- 比尔定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与吸光物质的浓度成正比，即A = k_2c（其中c为吸光物质的浓度，k_2为比例常数）。
- 合并朗伯定律和比尔定律得到朗伯 - 比尔定律：A=varepsilon bc，其中varepsilon为摩尔吸光系数，单位为L/(mol· cm)，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力，varepsilon越大，表明该物质对该波长光的吸收能力越强。
二、分光光度计的结构与组成1. 光源- 提供足够强度和稳定的连续光谱。
在可见光区常用钨灯或卤钨灯，其发射光的波长范围为320 - 2500nm；在紫外光区常用氢灯或氘灯，发射光的波长范围为180 - 375nm。
2. 单色器- 它的作用是将光源发出的复合光分解为单色光。
主要部件包括狭缝、准直镜和色散元件（如棱镜或光栅）。
通过调节狭缝宽度可以控制出射光的带宽和光强。
3. 样品池- 用于盛放被测溶液。
在可见光区可以使用玻璃样品池，而在紫外光区则需使用石英样品池，因为玻璃对紫外光有吸收。
4. 检测器- 检测透过样品池后的光强，并将光信号转换为电信号。
常见的检测器有光电管和光电倍增管等。
光电倍增管具有更高的灵敏度，可检测微弱的光信号。
5. 信号显示与处理系统- 将检测器输出的电信号进行放大、处理，并以吸光度或透光率等形式显示出来。
分光光度法
( C )2. 用普通分光光度法测得标液c1的透光度为20%， 试液的透光度为12%；若以示差分光光度法测定以c1 为参比，则试液的透光度为
A. 40% B. 50%
C. 60%
D. 70%
( D )3. 按一般光度法用纯溶剂做参比溶液时，测得某试 液的透光度为10%。若参比溶液换为透光度为20%的
(×) 4. 有色溶液的吸光度为0，其透光率也为0。
1.5 吸 光 系 数
吸光系数K物理意义：吸光物质在单位浓度、 单位厚度时的吸光度。
1. 质量吸光系数 c单位g/L，b单位cm，K单位L ·g-1 ·cm-1 A = Kbc
2. 摩尔吸光系数 c单位mol/L，b单位cm，ε单位L ·mol-1 ·cm-1 A = εbc
1.4 光吸收基本定律—朗伯比尔定律
( ✓)1. 朗伯－比耳定律的应用条件：一是必须使
用单色光；二是吸收发生在均匀的介质；三是吸 收过程中，吸收物质相互不发生作用。
(×) 2. 有色物质的吸光度A是透光度的倒数。 (×) 3. 在分光光度分析中，入射光强度与透射光
强度之比称为吸光度，吸光度的倒数的对数为透 光率。
( ✓)1. 如果显色剂有色，则要求有色化合物与显色剂
之间的颜色差别要大，以减小试剂空白值，提高测定 的灵敏度。通常把两种有色物质最大吸收波长之差称 为“对比度”。一般要求显色剂与有色化合物的对比 度在∆λ60nm以上。
( ✓)2. 分光光度法中，可选择不同厚度的比色皿以
控制吸光度在合适范围内。
1.5 吸 光 系 数
摩尔吸光系数ε意义： 1）吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。 2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。 3）可作为定性鉴定的参数。 4）同一物质在不同波长下的ε值不同。
磺基水杨酸差示分光光度法测定不同含量铁的研究及应用_包桂兰
磺基水杨酸差示分光光度法测定不同含量铁的研究及应用包桂兰1,刘青山2(1.内蒙古师范大学地理系,内蒙古呼和浩特010022;2.内蒙古轻工业学校,内蒙古包头014000)摘 要:研究了用磺基水杨酸显色,差示分光光度法测定不同含量铁的方法.在pH 1.80—3.00的缓冲介质中,铁与磺基水杨酸生成紫红色络合物,表观摩尔吸光系数ε490为1.7×103L ·mol -1·cm -1,铁含量在4.00—28.00mg ·L -1(或16.00—40.00mg ·L -1)范围内符合比耳定律.该法简便快速,选择性好,准确度高,测定范围广,适用于地质样、钢样中常量特别是高含量铁的测定.关键词:铁;磺基水杨酸;差示分光光度法中图分类号:O 657.32 文献标识码:A 文章编号:1001-8735(2001)02-0139-03关于差示分光光度法的原理、特点、实验技术条件等方面介绍的文献很多[1,2],以磺基水杨酸显色光度法测定铁已有报道[3],但差示分光光度法测定常量铁未见报道.经典的常量铁的分析是用重铬酸钾滴定法,而此法测定的废液中大量的H g 2Cl 2和Cr 3+将污染环境,用差示分光光度法可克服一般分光光度法误差大和分析带来的污染等缺点.用此法测定地质样和钢样中的高、中含量铁,相对误差在±0.3%以内.1 实验部分1.1 仪器与试剂 721型分光光度计(上海第三分析仪器厂);pHS -3型数字式酸度计(天津第二分析仪器厂).0.2000g ·L -1Fe (Ⅲ)标准溶液:称取高纯铁0.1000g 于小烧杯中,加硝酸(1+1)10mL ,加热溶解,煮沸除去氮的氧化物,冷却,移入500m L 容量瓶中,以水稀释至刻度,摇匀;5%磺基水杨酸溶液;H 3BO 3-Na 2B 4O 7缓冲溶液:pH 9.0的Na 2B 4O 7溶液和H 3BO 3饱和溶液(1+1)混合配制;硝酸、盐酸、高氯酸:AR 级;氢氟酸:ρ=1.13.所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水.1.2 实验方法 移取一定量的Fe (Ⅲ)标准溶液于25m L 容量瓶中,加2.00m L 5%磺基水杨酸,10mL H 3BO 3-Na 2B 4O 7缓冲溶液,用水稀释至刻度,摇匀.以0.100mg (或0.400mg )Fe (Ⅲ)的显色液作参比,用1cm 比色皿,于490nm 波长处测定吸光度.2 结果与讨论2.1 最大吸收波长 试验表明,在pH 1.80—3.00缓冲介质中,Fe (Ⅲ)与磺基水杨酸生成收稿日期:2001-02-23作者简介:包桂兰(1965-),女(蒙古族),内蒙古科右中旗人,内蒙古师范大学实验师.第30卷第2期2001年6月内蒙古师大学报自然科学(汉文)版Journal of I nner M ongolia Normal University (N atural Science Edition )Vol .30No .2Jun .2001紫红色络合物,其最大吸收波长λmax =490nm ,ε=1.7×103L ·mol -1·cm -1,实验用490nm .2.2 酸度的影响与显色剂用量 在pH 1.80—3.00时,磺基水杨酸是差示分光光度法测定铁的理想显色剂,完全符合文献[2](pH <1.80时络合物吸光度不稳定;pH >3.00时,显色不完全),有色化合物摩尔吸光率可以不必很大,以便溶液浓度较浓时,其吸光度也不会太大,可使测定范围较广.Fe (Ⅲ)溶液(或试液)和磺基水杨酸溶液本身的酸度很高,25m L 体积保持pH 1.80—3.00,5%磺基水杨酸溶液用量在2.00mL 时,H 3BO 3-Na 2B 4O 7缓冲溶液需要8—11m L ,实验选用10mL .图1 标准曲线1 以0.100mg Fe (Ⅲ)显色液作参比2 以0.400mg Fe (Ⅲ)显色液作参比2.3 标准曲线 分别取Fe (Ⅲ)标准溶液0.100,0.200,0.400,0.500,0.600,0.700,0.800,1.000mg 于25m L 容量瓶中,按实验方法显色定容,摇匀.以0.100mg Fe (Ⅲ)显色液作参比,在490nm 波长处,用1cm 比色皿,测定0.100—0.700mg Fe (Ⅲ)这一系列吸光度.再以0.400mgFe (Ⅲ)显色液作参比,测定0.400—1.000mgFe (Ⅲ)这一系列吸光度,绘制两条标准曲线,如图1所示.2.4 共存离子的影响 pH 1.80—3.00时,由于氢离子浓度较大,抑制了试剂本身的离解,使其它金属离子与磺基水杨酸阴离子生成络合物的可能性减小[4],实验条件下常见阳离子均不显色.试验表明,对于0.300mg Fe (Ⅲ),在拟定条件下,可允许下列离子存在(以mg 计,未作上限量):Ca 2+,M g 2+,Ba 2+,Cd 2+,Bi 3+,M n 2+,Pb 2+,Zn 2+,Al 3+,Sn 2+(10),M o 6+,V 5+(5),Cr 6+(3),Ni2+,Cu 2+,Co 2+(2),Cr 3+(0.25),Ti 4+(0.02),M n 7+(1.0)(因MnO -4本身的颜色干扰严重,但20min 内与显色剂发生氧化还原反应而退色,消耗一定量的显色剂),Cl -,NO -3,F -,PO 3-4等对测定无影响.所测定地质样铅锌矿中含有Pb ,Zn ,Cu ,铁矿中除铁无其它金属元素,钢样中含有Mn (0.44%),Ni (2.97%),Cr (1.59%)等均低于可允许量,不用掩蔽剂可直接测定铁.3 样品分析3.1 铅锌矿中铁的测定 分别称取0.1000g 铅锌矿c 1、c 2置于小烧杯中,加几滴水润湿后,加入浓盐酸10m L ,盖表面皿,加热溶解片刻.然后加浓硝酸3m L ,滴加氢氟酸数滴,煮沸驱尽氮氧化物,冷却后移入100m L 容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀.取此试液2.00m L ,以0.100mg Fe (Ⅲ)显色液作参比,按实验方法测定,结果见表1.3.2 铁矿中铁的测定 称取0.1000g 铁矿置于小烧杯中,加几滴水润湿,加入浓盐酸10mL ,盖表面皿,低温加热溶解,加5滴氢氟酸,继续加热完全溶解,冷却后移入100m L 容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀.取此试液1.00m L ,以0.100mg Fe (Ⅲ)显色液作参比,按实验方法测定,结果见表1.3.3 钢样中铁的测定 称取0.1000g 钢样142号于小烧杯中,加入10硝酸·140· 内蒙古师大学报自然科学(汉文)版第30卷 (1+2)溶液,加高氯酸5m L ,氢氟酸数滴,低温加热近干,冷却后用水浸出移入100m L 容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀.取此试液1.00mL ,以0.400mg Fe (Ⅲ)显色液作参比,按实验方法测定,结果见表1.表1 样品分析结果样品推荐值(%)测得值(%)平均值(%)相对误差(%)c 117.8017.7617.7717.7417.76-0.22c 215.8015.7615.7515.7515.76-0.25铁矿50.8850.8350.8250.8250.82-0.11钢样14294.3194.3294.3494.3594.34+0.03参考文献:[1] 罗庆尧,邓延倬,蔡汝秀,等.分光光度分析[M ].北京:科学出版社,1992.355-371.[2] 国家机械工业委员会.光度分析[M ].北京:机械工业出版社,1988.55-58.[3] 衡兴国,黄按佑.实用快速化学分析新方法[M ].北京:国防工业出版社,1996.226-276,335.[4] 刘绍璞,朱鹏鸣,张国轩,等.金属化学分析概论与应用[M ].重庆:四川科学技术出版社,1985.914.S TU DY AN D APPLICA TIO N O F DET ERM INA TION O FDIFFEREN T CO N TEN T LEV EL IRON BY S U LFO SA LICYLICACID DIFFEREN T IA L SPECT ROSCO PYBAO Gui -lan 1,LIU Qing -shan 2(1.Department of G eography ,Inner Mongolia Normal University ,Huhhot 010022,China ;2.I nner Mongolia L ight I ndustry Scho ol ,Baotou 014000,China )A bstract :In this paper ,different content iron are determined by using sulfosalicylic acid .In the pH 1.80—3.00buffer solution ,iron and sulfosalicy lic acid can form purplish red complexes ,and its apparent molar absorption coefficient ε490is 1.70×103L ·mol -1·cm -1.Beer s law is obeyed for the content of iron in the range of 4.00—28.00mg ·L -1(or 16.00—40.00mg ·L -1).The method is simple ,rapid and alternative .Its deg ree of accuracy is hig h and scope of determination is wide .The method is suitable for macro -iron ,especially high content iron determination in the geological sam ple and steel sample .Key words :iron ;sulfosalicy lic acid ;differential spectroscopy 【责任编辑董祥林】·141· 第2期包桂兰等:磺基水杨酸差示分光光度法测定不同含量铁的研究及应用 。
分光光度法检出限
分光光度法检出限分光光度法是一种常用的分析方法，广泛应用于环境监测、食品安全、药物研发等领域。
在分光光度法中，检出限是一项重要的指标，用于评估分析方法的灵敏度和准确性。
检出限是指在给定的条件下，仪器能够可靠地检测到物质的最低浓度。
它通常由信号与噪音之比来表示，即检测到的信号与背景噪音的比值。
常见的表示检出限的单位有ppb（10的负9次方）、ppm （10的负6次方）和μg/L（微克/升）等。
在分光光度法中，检出限的计算方法有多种，常用的有3倍标准差法、信号与噪音法和限定因子法等。
其中，3倍标准差法是最常用的计算方法。
它基于统计学原理，通过对一系列无样品的背景噪音进行测量，计算出噪音的标准差，再乘以3倍，得到检出限。
分光光度法的检出限受到多种因素的影响，主要包括仪器的灵敏度、样品的矩阵效应和分析方法的选择等。
仪器的灵敏度是指仪器能够检测到的最低信号强度，通常由仪器的检测器和光源等决定。
样品的矩阵效应是指样品中其他成分对目标物质的检测造成的干扰，例如颜色、浊度、pH值等。
分析方法的选择也会影响检出限的大小，不同的分析方法对目标物质的灵敏度有所差异。
在实际应用中，提高检出限的方法主要包括增加仪器的灵敏度、减小样品的矩阵效应和优化分析方法等。
增加仪器的灵敏度可以通过使用更高灵敏度的检测器、增加光源强度或增加探测器的接收面积等方式来实现。
减小样品的矩阵效应可以通过前处理样品、选择合适的分析方法或使用内标法等方法来降低。
优化分析方法则需要综合考虑多个因素，例如选择合适的波长、优化反应条件和增加样品的预处理步骤等。
分光光度法的检出限是评估分析方法灵敏度和准确性的重要指标。
它受到仪器的灵敏度、样品的矩阵效应和分析方法的选择等多种因素的影响。
在实际应用中，可以通过增加仪器的灵敏度、减小样品的矩阵效应和优化分析方法等方法来提高检出限。
分析人员应根据具体情况选择合适的方法，确保检出限的准确性和可靠性。
示差法
要求：
示差法要求仪器光源强度要足够 大，仪器检测要足够灵敏。因为只 有这样的仪器才能将标准参比溶液 调到T%为100%，否则调不到。
进一步ห้องสมุดไป่ตู้
设待测溶液的浓度为Cx，标准溶液为Cs（Cs〈 Cx）， 则有： △A=Ax-As=Ɛb(Cx-Cs)=Ɛb△c 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的 吸光度之差。示差法测得的吸光度与△c呈线性关系。由 标准曲线上查的相应的值，则待测溶液的Cx： Cx=Cs+△C
示差法标尺扩展原理：
示差法
722型可见分光光度计
——高含量组分的测定
微生物11301班 七组
了解：
普通分光光度计一般只适于测定微量组 分。然而，当待测组分含量较高时，其将产 生较大的误差。
思考：采用什么方法才适合于高含量组 分的测量计算？
示差法
示差法又称为示差分光光度法。它与一般 分光光度法区别仅仅在于它采用一个已知浓度 作参比溶液，才大大提高了测定的准确度，使 其用于测定过高含量的组分，所以将这种吸光 度测量方法来扩大测量范围并提高灵敏度和准 确度的方法称之为示差法。
为什么示差分光光度法可以提高测 定的准确度?
吸光光度法一般仅适用于微量组分的测定，当待 测定组分浓度过高或过低，亦即吸光度测量值过大或 过小时，即使没有偏离朗伯--比尔定律现象。也会有很 大的测量误差，导致准确度大为降低，采用示差法可 克服这一缺点。 示差法和一般的光度法不同之处在 于，示差法不是以空白溶液（不含待测组分的溶液） 作为参比溶液，而是采用比待测溶液浓度稍低的标准 溶液作为参比溶液，然后测量待测溶液的吸光度，从 而测出待测液的浓度，从而大大提高测定结果的准确 度。
仪器分析思考题及答案
复习思考题1、电位滴定法的优点答案：电位滴定法的优点：电位滴定法一般具有较高的准确度和精密度，但分析时间较长。
由于电位滴定法测量的是随滴定剂加入而引起的电池电动势的变化，而不是电动势的绝对值，即使电极的斜率少有变化，也不影响测量结果。
而其液接电位和活度系数的变化很小，等当点附近电位突跃较大，容易准确测定终点。
2、在气相色谱法中，用于定性的参数是什么？答案：保留时间。
3、在原子吸收分光光度法中，吸收线的半宽度是指：在中心频率吸收系数一半处的, 轮廓上两点间的频率差。
4、测定饮用水中F 含量时，加入总离子强度缓冲液的作用是什么。
答案：1：维持试液和标准液很定的离子强度2保持试液在离子选择性电极适合的PH范围内3：使被测离子释放成为可检测的游离离子。
5、衡量色谱柱柱效能的指标是什么？答案：用有效塔板数n和有效塔板高度H作为衡量柱效能的指标。
6. 在液相色谱中，范第姆特方程式中的哪一项对柱效的影响可以忽略不计？答案：纵向扩散项。
7、库仑分析的理论基础是什么？答：法拉第电解定律。
8、在电位滴定中，以△E／△V～V作图绘制滴定曲线，滴定终点是哪一点？答：尖峰所对应的V值即为滴定终点。
9．物质的紫外-可见吸收光谱的产生的机理？答：由分子中价电子能级跃迁产生。
分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。
价电子跃迁的同时，伴随着核振动、分子自身转动能级的跃迁（带状光谱）。
10、气相色谱分析中，理论塔板高度与载气线速u间的关系？答：随u的增加而出现一个最小值。
11、原子吸收光谱分析中光源的作用？答：辐射待测元素的特征光谱。
获得较高的灵敏度和准确度。
12、电化学分析法分为哪些？答：电位分析法（potentiometry）、电导分析法（conductometry）、库仑分析法（coulomtry）、电解分析法（electranalysi）。
直接电位法、直接电导法、控制电位库仑法。
仪器分析习题及答案
仪器分析习题及答案1. 原⼦发射光谱是由下列哪⼀种跃迁产⽣的?A. 辐射能使⽓态原⼦外层电⼦激发；B. 辐射能使⽓态原⼦内层电⼦激发；C．热能使⽓态原⼦外层电⼦激发；D．热能使⽓态原⼦内层电⼦激发。
3. 在下列⼏种常⽤的原⼦发射光谱激发光源中,分析灵敏度最⾼，稳定性能最好的是哪⼀种?A．直流电弧；B．电⽕花；C．交流电弧；D．⾼频电感耦合等离⼦体。
6. ⽤摄谱仪进⾏发射光谱定量和定性分析时,应选⽤的⼲板是:A. 都应选⽤反衬度⼤的⼲板；B. 都应选⽤惰延量⼤的⼲板；C. 定量分析⽤反衬度⼤的⼲板,定性分析⽤惰延量⼩的⼲板；D. 定量分析⽤反衬度⼩的⼲板,定性分析⽤惰延量⼤的⼲板。
7. 在AES分析中,谱线⾃吸(⾃蚀)的原因是:A．激发源的温度不够⾼；B．基体效应严重；C．激发源弧焰中⼼的温度⽐边缘⾼；D．试样中存在较⼤量的⼲扰组分。
8. ⽤内标法进⾏定量分析时,应选择波长相近的分析线对,其原因是:A. 使线对所处的⼲板反衬度基本⼀样,以减少误差；B. 使线对的⾃吸收效应基本⼀样,以减少误差；C. 使线对所处的激发性能基本⼀样,以减少误差；D. 主要是为了测量上更⽅便些。
10. ⽤标准加⼊法测定中Fe的的含量。
取分析线对为Fe302.60nm/Si302.00nm，测得以下数据：Fe的加⼊量(%) 0 0.001 0.002 0.003△S 0.23 0.42 0.51 0.63求试样中Fe%为： A. 0.001%； B. 0.002% ； C. 0.003% ； D. 0.004%1：(C)、3：(D)、6：(C)、7：(C)、8：(A)、10：（B）1. 下列哪种说法可以概述三种原⼦光谱（发射、吸收、荧光）的产⽣机理？A. 能量与⽓态原⼦内层电⼦的相互作⽤；B. 能量与⽓态原⼦外层电⼦的相互作⽤；C．辐射能使⽓态基态原⼦内层电⼦跃迁；D．辐射能使⽓态基态原⼦外层电⼦跃迁。
2. 在原⼦吸收光谱法的理论中，以谱线峰值吸收测量替代积分吸收测量的关键条件是什么？A．光源辐射的特征谱线与原⼦吸收谱线⽐较，中⼼频率⼀样，⽽半峰宽要⼩得多；B．光源辐射的特征谱线与原⼦吸收谱线⽐较，中⼼频率和半峰宽均为⼀样；C．光源辐射的特征谱线与原⼦吸收谱线⽐较，中⼼频率⼀样，⽽半峰宽要较⼤；D．光源辐射的特征谱线与原⼦吸收谱线⽐较，只要中⼼频率⼀样，半峰宽⼤⼩都没影响。
分光光度法
光度法的优点
与目视比色法相比，光度法的优点： 1. 用光电仪器进行测量可消除轻度色盲、眼睛 疲劳等主观误差。 2. 有其他物质共存时，可选适当的入射光和参 比溶液来消除干扰，提高选择性。 3. 对于大批试样分析，校正曲线可简化手续， 提高分析速度。
2.3.2.测量条件的选择(1)
（1）选择合适的入射光 由于溶液对光的吸收是有选择性的，因此 必须选择溶液吸收最大的波长作为入射光的波 长。 （2）控制适当的吸光度范围 用光度计测量吸光度，都存在着误差。当 测量小于0.2和大于0.7吸光度时，误差会迅速 增加。为了使测量误差落在0.2～0.7之间，可 以控制试样的称取量。对于组分含量高的试样， 可减少称取量，或是稀释;对于含量低的溶液 可增加称样量或浓缩的方法来提高浓度。
图2－8 721分光光度计的光学系统
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（三）
图2－9 7530G紫外—可见光分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（四）
图2－10 7530G紫外-可见分光光度计光学系统
检测器和读数装置 （2）
2. 光电管. 是一个二极真空管由一个阳极和一个光敏阴 极组成。 3. 光电倍增管。 是利用光敏阴极把光信号放大的装置。 4. 读数装置。 读数装置常用的是微安计或检流计。
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（一）
图2－7 721分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（二）
2.分光光度法 2.分光光度法
光度可用光电比色计或分光光度计进 行测量。 测定时常用的是校正曲线法或比较法。
（1）校正曲线法
校正曲线法，又称工作曲线或标准曲线法。 当溶液厚度b固定时，吸光度A与溶液浓度c成 正比.取一系列不同浓度标准溶液（5－7图）， 分别测定其吸光度，以浓度c为横坐标，吸光 度为纵坐标，作校正曲线.试液用同样条件显 色，测定吸光度，从曲线上求得试液浓度。
分光光度法
三、测量条件的选择
1、入射光波长的选择
一般应该选择λmax为入射光波长。
如果 λmax 附近有干 扰存在，选择灵敏度 稍低但能避免干扰的 入射光波长（曲线较 平坦处）
2、参比溶液的选择
❖ 选择参比溶液的原因
由于入射光的反射，以及溶剂、试剂等对光的 吸收会造成透射光通量的减弱。为了使光通量 的减弱仅与溶液中待测物质的浓度有关，需要 选择合适的溶液作参比溶液。
单色光和互补光
➢ 单色光：具有同一波长的光。 ➢ 复合光：含有多种波长的光。如:日光，白炽灯光。
➢ 可见光：400～760 nm
➢互补色光：适当颜色的两种色光按一定强度 比例可以混合成为白光，这两种色光叫做互 补色光。
一、物质的颜色
物质的颜色是由于物质对不同波长 的光具有选择性吸收而产生的。
物质的颜色显示其吸收光的互补色。
（2）不同浓度的高锰酸钾溶液，其吸收曲线的 形状相似，最大吸收波长λmax一样。在同一波 长下吸光度A有差异。物质定量分析的依据。
（3）不同物质其吸收曲线形状和λmax各不 相同，因此吸收曲线可以提供物质的结构信 息，物质定性分析的依据之一。
§3 光吸收的基本定律
一、朗伯-比耳定律 朗伯-比耳定律的数学表达式为：
3.工作曲线不过原点 存在系统误差：吸收池不完全一样；参比溶液选择 不当等。
第三节 紫外－可见分光光度计
一、仪器的基本组成部件
光源
单色器
吸收池
检测器 信号显示系统
1、光源
在使用波长范围内提供连续的光谱，光强应 足够大，有良好的稳定性，使用寿命长。
➢ 可见光光源：钨灯，辐射 波长范围325～2500nm。
有机显色剂：种类繁多
三元配合物显色体系：一种金属离子同时与两种不同 的配位体或一种配位体与两种不同的金属离子形成的 配合物
紫外可见分析的应用-定量分析(示差光度法)
定量分析5. 示差分光光度法用普通分光光度法测定很烯或很浓溶液的吸光度时，测量误差都很大。
若用一已知合适浓度的标准溶液作为参比溶液，调节仪器的100％透射比点（即0吸光度点），测量试样溶液对该已知标准溶液的投射比，则可以改善测量吸光度的精确度。
这种方法称为示差分光光度法。
其原因如图13.25所示。
当测定低透射比（高吸光度）的高浓度试液时，用比试液浓度C1稍低的标准溶液C2作参比溶液，这种示差法叫高吸收法；当测定主透射比（低吸光度）的低浓度溶液时，用比试液浓度稍高的标准溶液作参比溶液，这种示差法叫低吸收法；若同时用浓度不同的两种标准溶液（试液的浓度需介于两标准溶液之间）分别调仪器的100%透射比点及零透射比点，这种示差方法叫最精密法。
较常用的时高吸收法，其原理如下：根据吸收定律有则即用C2作参比测得的A为示差法实质上是相当于把仪器的测量标尺放大，以提高测定的精确度。
如果C2以常规法测得的透射比为10％，在示差法用调至透射比为100％，意味着标尺扩大了10倍。
若待测试液以常规法的最终分析法得的透射比为5％，用C2作参比的示差法测得透射比为50％。
示差法的最终分析结果准确度比常规法高，这是因为尽管示差法测出的很小的ΔC，而测得的误差dC也很大，则仍很大，但最终分析结果的相对误差为，Cs是标准参比溶液，Cs相对很大，所相对误差仍然很小。
6. 光度滴定法分光光度滴定法是利用被测组分或滴定剂或反应产物在滴定过程中的吸光度的变化来确定滴定终点，并由此计算试液中被测组分含量的方法。
分光光度滴定曲线是在某一给定波长处在滴定过程中所测得的吸光度与已知浓度的滴定剂体积之间的关系曲线，其曲线的形状取决于反应体系中样品组分、滴定剂或产物的吸光程度，如图13.26所示。
图13.26（a）是用有色滴定剂（其摩尔吸光系数εt>0）滴定含非吸收组分（εs>0）的试液，生成的产物也无吸收（εp＝0），即εt>0，εs=εp=0；（b）是εp>0，εs=εt=0；（c）是εs>0，εp=εt=0；（d）是εs>0，εt=εp=0；（e）是εp >0，εs=εt=0；（f）是εs>0，εp=εt=0。
示差分光光度法测定水样中非那西汀的含量
实验方法及步骤
1.标准溶液的配制 非那西汀标准溶液（100μg/ml）：准确称取非 那西汀0.0500g于小烧杯中，加少许乙醇溶解，转移 到500ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀备 用 2.吸收曲线绘制 移取5.00ml非那西汀标准溶液于50ml容量瓶中， 蒸馏水稀释至刻度，摇匀。以蒸馏水为空白，进行 全波长扫描，绘制吸收曲线，找出最大波长。
1. 示差分光光度法的测定步骤：
1）采用浓度为cs的标准溶液为参比溶液;
2 ）测定一系列 Δc 已知的标准溶液的相对吸光度 (ΔA)； 3）绘制ΔA-Δc工作曲线； 4）由测得试样溶液得相对吸光度 ΔA，从工作曲 线上求出 Δc ，根据 cx ＝ cs+Δc 即可求出试样浓 度cx
试剂与器材
UV-2450紫外-可见分光光度计， 石英比色皿（1cm）， 容量瓶（50ml）， 移液管（1ml、10ml）， 未知样品液。
三、示差分光光度法原理
普通分光光度法 一般测定痕量组分 参比溶液浓度为零
即朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。
示差分光光度法
用于测定浓度较高组分 用浓度稍低于待测溶液的标准溶液 作参比
设：待测溶液浓度为cx， 标准溶液浓度为cs(cs < cx)。 则： Ax= εb cx As = εb cs ΔＡ＝Ａx －Ａs =εb(cx － cs ）=εbΔc
测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准 溶液的吸光度之差ΔＡ(也叫相对吸光度Ar)。
示差法测得的吸光度ΔA与Δc呈直线关系。由标 准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx ： cx = cs + Δc 示差法标尺扩展原理
普通法： cs的T =10%；cx的T = 5% 示差法： cs 做参比，调T =100% 则： cx的T = 50% 标尺扩展10倍
分光光度法
本章小结
基本概念：吸光度，透光率，吸光系数， 最大吸收波长，显色剂，参比溶液吸收 曲线，标准曲线
基本计算：A =εbc
A = -lgT = lg I 0 It
测定方法：标准曲线法 标准对照法
判断题
1. 分光光度法灵敏度高，特别适用于常量
组分的测定。 （× ）
2. 光 照 射 有 色 溶 液 时 ， A 与 T 的 关 系 为
质量吸光系数a, 单位: Lg -1cm-1
吸光系数
与入射光的波长、物质的性质、溶 剂和温度有关；与浓度无关；
≥103，可用于定量测定； 与λmax一起可以作为定性的依据。
Lambert―beer定律
A =εbc
A ═ ab ε= aM
T =10-bc
适用条件 Preconditions:
A. 向短波方向移动
B. 向长波方向移动
√C. 不改变，但峰高度改变
D. 不改变，峰高度也不变
E. 改变，但峰高度不变
7．分光光度法中使用试剂空白作对照的目的 是：
A. 用以消除仪器测量误差 B. 用以消除溶液偏离Beer定律引起的误差 C. 用以消除单色光纯度差引起的误差
√D. 用以消除溶剂、显色剂等物质对入射光
① c 一定, A∝b Lambert ② b 一定, A∝c Beer
A =εbc
三、Lambert-Beer定律
A =bc
溶液厚度b, 单位:cm
浓度c，单位molL-1
摩尔吸光系数，单位Lmol -1cm-1
若用质量浓度代替c
A = ab
质量浓度 , 单位: gL-1
吸光度的加合性 Addition of A
分光光度计的使用课件
当光通过障碍物或狭缝时，光线会发生衍射现象。衍射现象会导致光线的方向发 生变化，形成类似于干涉的明暗相间的条纹。分光光度计中的衍射光栅利用光的 衍射原理来分离不同波长的光线。
光的偏振与极化
光的偏振
当光通过某些介质时，其电矢量会相对于传播方向以一定角 度振荡，导致光的偏振现象。偏振现象可用于分析物质的晶 体结构和光学性质。
分光光度计的使用课件
汇报人：
日期:
• 分光光度计基本原理 • 分光光度计基本构造 • 分光光度计使用方法 • 分光光度计实验技术 • 分光光度计应用实例 • 分光光度计维护保养与安全防护
01 分光光度计基本原理
光的吸收与散射
光的吸收
当光通过介质时，介质中的分子或原 子会吸收特定波长的光，导致光的强 度减弱。这种吸收现象可用于分析物 质中的特定成分。
药物代谢研究
通过测量药物在人体内的 吸收和代谢过程，可以研 究其动力学。
医学诊断
某些疾病可以通过测量人 体组织在特定波长下的透 射或反射光谱来进行诊断 。
06 分光光度计维护保养与安全防护
仪器维护与保养
01
02
03
04
仪器表面清洁
保持仪器表面清洁，避免使用 腐蚀性液体擦拭，以免对仪器
造成损害。
光学元件清洁
信号处理器
信号处理器是将检测器输出的电信号进行放大、处理和转换的装置，以便进行后续的数据处理和分析 。
03 分光光度计使用方法
样品制备与测量前的准备
01 02
样品制备
在开始测量之前，需要将待测样品进行适当处理，以适应分光光度计的 测量需求。例如，对于液体样品，可能需要摇匀、稀释或过滤以消除误 差。
误差来源 1. 比色皿不干净，导致吸光度测量值不准确。
差示分光光度法测定药物制剂中的四环素
差示分光光度法测定药物制剂中的四环素四环素是生物合成的广谱抗菌素。
临床研究表明，病人服用四环素后，定时测定体液中四环素含量可诊断胃癌，四环素还可作为荧光探针用以诊断癌症。
近年来，四环素还广泛被用作饲料添加剂，以增强动物的抗病能力。
关于四环素的测定方法，已有许多报道，如微生物法、分光光度法差示导数光谱法、FIA、RHPL、ISE、吸附SV、三氯化铁比色法等。
本文利用四环素与钻离子在PH为11.5的Na2HPO4－NaOH缓冲溶液中生成黄绿色络合物，并根据其光谱变化的牲性，采用差示光度法不经分离直接测定了药物制剂中的四环素。
四环素浓度在0.80－25ug/ml范围内符合比耳定律。
1 实验部分1.1仪器与试剂TU－1221型紫外－可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；PH－HJ908OB数字酸度计时北京海淀航天计算机公司）；XYJ80－2离心沉淀机（江苏医疗器械厂）。
盐酸四环素标准液：用标准品（中国药品生物制品检定所提供）配成2mg／ml的储备液，使用时用水稀释成0.2mg／ml；钻离子溶液：用CoCl2·6H2O配成1mg／ml的储备液，使用时稀释成0.1mg／ml；Na2HPO4－NaOH缓冲溶液。
以上试剂均为分析纯，水为市售二次去离子水。
1.2 实验方法于两支25ml的比色管中，分别加入0.2mg／ml的盐酸四环素标准使用液2.0ml，一支用水稀释至刻度作参比液，另一支加入0.1mg／ml的钴离子溶液2ml，Na2HPO4－NaOH缓冲2ml，用水稀释至刻度。
前者置参比池中，后者置样品池中，于405nm处测其吸光度。
2结果与讨论2.1 实验条件的选择络合物的形成受诸多因素的影响，本文对酸度，缓冲溶液的种类及用量、钴离子的用量、反应温度、反应时间等条件的影响作了讨论。
2.1.1 吸收光谱将盐酸四环素标准使用液按实验方法处理后，在380－500nm波长范围内进行波长扫描。
盐酸四环素在405nm处最大吸收，可作为测定波长。
分析化学--分光光度法
D。减少，不变
答案： A
3、下列表述不正确的是
A。吸收光谱曲线，表明了吸光度随波长的变化关系
B。吸收光谱曲线中,最大吸收处的波长为最大吸收波长
C。吸收光谱曲线，以波长为纵坐标,以吸光度为横坐标
D。吸收光谱曲线，表明了吸光物质的吸收特性
答案： C
4、影响有色物质摩尔吸收系数的因素是
1-2 光的吸收定律
一、朗伯-比尔定律
1、朗伯定律（Lambert’s Law）：
1760 Lambert通过实验发现电磁被物质吸 收时，透过能量呈指数减少。假定一辐射 能通过光路后被吸收25%，再通过下一个 光路时被吸收0.75×25%，剩56.25%,
依次类推，在无限大的光路中
有关。浓度愈大，颜色愈深。 因此，可以用比较颜色的深浅来测定物质的
浓度，这种测定分析方法称为比色析分法。
C
一、吸光光度法
1、定义：基于物质对光的选择性吸收而建立 起来的分析方法。它包括比色法，可见分光光 度法，紫外分光光度法及红外分光光度法。
2、特点：
（1）灵敏度高：常用于测量1%~1‰的微 量组分，还可测定10－4 ~10－6的痕量组分。
练习题
1、人眼能感觉到的光称为可见光，其波长范 围是
A。400-800nm
B。200-320nm
C。200-800nm
D。200-1000nm
答案： A
2 、符合比尔定律的一有色溶液，当其浓度 增大时，最大吸收波长和吸光度分别是
A。不变，增加
B。不变，减少
C。增加，不变
玻璃棱镜：400－700nm
石英棱镜：200－1000nm
c 光栅：利用光的衍射和干涉原
分光光度法 科普
分光光度法科普
分光光度法是一种通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
它具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法之一。
分光光度法的原理是基于Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱。
若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光强度的减弱也愈显著。
这一关系就是郎伯定律。
分光光度法的应用范围非常广泛，可以用于测定多种物质，如蛋白质、核酸、糖类、酚类、芳香族化合物等。
在临床医学、环境科学、生物工程、制药等领域都有广泛的应用。
需要注意的是，分光光度法在使用过程中需要注意一些问题，如选择合适的波长和光源，避免干扰物质的影响，以及正确处理数据等。
此外，分光光度计也需要定期进行校准和维护，以保证测量的准确性和可靠性。
总之，分光光度法是一种简单、快速、灵敏的分析方法，在各个领域都有广泛的应用。
通过了解其原理和方法，可以更好地应用于实际工作中。
示差分光光度法
示差分光光度法示差分光光度法1示差法的原理吸光光度法一般仅适用于微量组分的测定，当待测定组分浓度过高或过低，亦即吸光度测量值过大或过小时，从上节的测量误差的讨论得知，在这种情况下即使没有偏离朗伯—比耳定律的现象，也会有很大的测量误差，导致精准度大为降低。
采纳示差法可克服这一缺点。
目前重要有高浓度示差法，稀溶液示差法和使用两个参比溶液的精密示差法。
其中以高浓度示差法应用*多，本节将侧重讨论。
示差光度法和一般的光度法不同之处重要在于，示差法不是以空白溶液（不含待测组分的溶液）作为参比溶液，而是采纳比待测溶液浓度稍低的标准溶液作参比溶液，然后测量待测溶液的吸光度，再从测得的吸光度求出它的浓度。
这样便大大提高测定结果的精准度。
设用作参比的标准溶液浓度为cs，待测溶液浓度为cx，且cxcs，依据朗伯—比耳定律得到Ax=εcxbAs=εcsb两式相减：A相对=Ax—As=εb（cx—cs）=εbΔc（2—12）实际操作是：用已知浓度的标准溶液作参比，调整其吸光度为零（透光率100%），然后测量待测溶液的吸光度。
这时测得的吸光度实际是这两种溶液吸光度的差值（相对吸光度）。
从（2—12）式可知，所测得的吸光度差值与这两种溶液的浓度差成正比。
这样便可以把空白溶液为参比的稀溶液标准曲线作为ΔA对应于Δc的工作曲线，依据测得的ΔA找出相应的Δc值，从cx=cs+Δc，便可求出待测溶液之浓度，这就是示差法定量测定的基本原理。
2示差法的误差用示差法测定浓度过高或过低试液，其精准度比一般分光光度法高。
这可从图2—3看出。
设图2—3示差法标尺原理按一般分光光度法用试剂空白作参比溶液，测得溶液的透光率Tx=6%，明显，这时的测量读数误差是很大的。
采纳示差法时，假如按一般分光光度法测得的Ts=10%的标准溶液作参比溶液，使其透光率从标尺上Ts1=10%处调至Ts2=100%处，相当于把检流计上的标尺扩展到原来的十倍（TS2/TS1=100/10=10），这样待测试液透光率原来为6%，读数落在光度计标尺刻度很密，测量误差很大的区域，改用示差法测定时，透光率则是60%，读数落在测量误差很小的区域，从而提高了测定的精准度。
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示差分光光度法
示差分光光度法是一种在分子取向反应或光谱特性中应用广泛的
分析方法。
首先，示差分光光度法通过比较两种不同取向下的吸收光谱，来
探测反应中的分子结构变化。
通过这种方法，我们可以更好地理解反
应的机理和特性。
其次，示差分光光度法在不同波长或时间段内测量光谱信号，可
以得到很高的灵敏度和分辨率。
这使得该方法在许多不同领域都有应用，如化学、生物学、医学等等。
此外，示差分光光度法还可以用于探测微量物质的存在和浓度变化。
这种方法可以用于监测环境污染、药物代谢等方面。
需要注意的是，示差分光光度法需要设备精细和技术娴熟的操作。
对于初学者来说，需要认真学习理论知识和实验技能，才能获得准确
的测量结果。
总之，示差分光光度法是一种应用广泛、灵敏度高、分辨率高的
分析方法。
在化学、生物学、医学等领域都有广泛的应用前景。
如今，随着技术的不断发展和创新，示差分光光度法将会得到更广泛的应用
和挖掘。