【定量数据分析】荧光定量PCR_完整版

08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
曲线进行分析； 3、反应过程中探针降解：用 PAGE 电泳对探针进行检测； 六、溶解曲线不止一个主峰 1、引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现； 2、引物浓度不佳：适当调整引物浓度； 3、退火温度低：提高退火温度； 4、镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度； 5、模板中有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的污染，或通过引 物设计避免非特异扩增。 七、如果避免荧光定量 PCR 中基因组 DNA 扩增？ 1、引物设计时避免基因组 DNA 扩增； 2、在 RNA 提取过程中使用 DNaseⅠ处理去除 RNA 中混有的基因组 DNA。 八、扩增效率低 1、反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解； 2、反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法； 3、反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到 体系中，减少抑制物的影响； 九、重复性不好 1、加样不准确； 2、仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好； 3、模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。 十、扩增曲线不正常，刚进入指数期就很快进入平台期并向右下弯曲 1、基线等设置不当：按仪器说明书重新操作； 2、模板量过多：当扩增曲线在 10 个循环内起峰时，应将模板稀释 100－1000 倍后使用。 十一、各孔间的荧光信号如何进行校正 由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效率的差异等偶然 误差不可避免，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，以消除这些因 素对定量结果的影响。 这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料来实
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现，一般采用红色 ROX 荧光，称为阳性参比信号。ROX 在反应缓冲液中的浓度是 固定的， 因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激发效率正相关。 ROX 校正可以提高定量数据的精度和重现性，减少孔间差异。 十二、荧光定量 PCR CT 值一般在多少后认为模板没扩增？ 当进入对数期的循环数大于 35 时，RealTime RT-PCR 检测无效，基因没有 表达；当进入对数的循环数在 32-35 个循环时，需要有至少 3 个重复才能判断是 否能检测到基因的表达。
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