多肽类药物制剂研究现状_方宏清

多肽类药物制剂研究现状

方宏清

(军事医学科学院生物工程研究所　北京　100071)

摘　要　多肽类药物制剂研究面临的主要问题是多肽的稳定性不好、体内半衰期短和生物膜透过性差。本文综述了多肽类药物不稳定的原因;提高多肽稳定性的方法;多肽类药物制剂货架时间的确定;多肽类药物的分析手段;多肽类药物的控释研究;多肽的非注射途径给药研究。最后还提出了多肽类药物制剂研究的展望。

关键词　多肽　药物制剂　稳定性　控制释放　非注射途径给药

随着生物技术的发展,多肽作为药物在临床上的应用越来越广泛,相应的制剂学研究也日益受到重视。与传统的小分子有机药物相比,多肽具有稳定性差,体内半衰期短和不易通过生物膜等特点。本文从稳定性、缓释系统、非注射途径给药三方面对多肽类药物制剂的研究概况进行介绍。

1　多肽的稳定性研究

1.1　引起多肽不稳定的原因[1～3]

(1)脱酰胺反应　在脱酰胺反应中, Asn/Gln残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应与环境条件和多肽的结构有关。提高pH值、升高温度都将有利于脱酰胺反应的进行。在-Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解,位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。

(2)氧化　多肽溶液易氧化的主要原因有两种,一是溶液中有过氧化物的污染,二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中, Met、Cys和H is、Trp、Ty r等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。

(3)水解　多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂,尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。

(4)形成错误的二硫键　二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键,导致三级结构改变和活性丧失。

(5)消旋　除Gly外,所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的,易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋反应。

(6)β-消除　β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Th r、Phe、Ty r等残基都可通过β-消除降解。在碱性p H 下易发生β-消除,温度和金属离子对其也有影响。

(7)变性、吸附、聚集或沉淀　变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态,多肽往往更易发生化学反应,活性难以恢复。在多肽变性过程中,首先形成中间体。通常中间体的溶解度低,易于聚集,形成聚集体,进而形成肉眼可见的沉淀。

蛋白质的表面吸附是其贮存、使用过程中遇到的另一个令人头痛的问题,如r IL-2在进行灌注时会吸附在管道表面,造成活性损失[4]。

1.2　提高多肽稳定性的途径[1,3]

(1)定点突变　通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳

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药　学　进　展 1998年　22卷　第1期军事医学科学院青年科研基金资助项目

定性的残基,可提高多肽的稳定性。

(2)化学修饰　多肽的化学修饰方法很多,研究最多的是PEG修饰。PEG是一种水溶性高分子化合物,在体内可降解,无毒。PEG与多肽结合后能提高热稳定性,抵抗蛋白酶的降解,降低抗原性,延长体内半衰期[5]。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可保持或提高原生物活性。

(3)添加剂　通过加入添加剂,如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类,可以提高多肽的稳定性[6]。糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围,因而提高了多肽的稳定性。在冻干过程中,上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象,而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。

此外表面活性剂如SDS、Tw een、Pluro-nic,能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。

(4)冻干　多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与,水还可以作为其它反应剂的流动相。另外,水含量降低可使多肽的变性温度升高[7]。因此,冻干可提高多肽的稳定性。

1.3　多肽类药物制剂的存放时间测定

对动力学行为符合Arrhenius公式的药剂,可利用加速实验确定存放时间,但要求反应活化能是独立于温度的常数。通常认为基于Arrhenius公式的稳定性预测不适于多肽制剂,这是因为在进行蛋白质药物加速实验时有三个问题难以解决:(1)多肽的降解途径较多,各途径活化能不同,升高温度会改变多肽降解的主要方式;(2)温度会改变多肽的构象,从而改变降解反应的活化能;(3)对冻干制品,若实验温度高于玻璃化温度(Tg),固体制剂将由玻璃态变为粘塑性状态,化学反应速率将急剧增加,从高于Tg获得的数据就不能外推到低于Tg时的情况。但是,如果能解决上述问题,利用加速实验进行稳定性预测就可以成为评价多肽药物制剂的有效工具。

Yo shio ka等人[8]通过加速实验确定了六种多肽制剂在25℃存放的有效时间,结果表明与实测结果基本接近。这说明在一定条件下可用加速实验估算多肽制剂的货架时间,特别是在研究初期,用加速实验可节省大量时间和物力。但是,最终货架时间的确定还是需要采用留样观察法。

1.4　多肽类药物制剂的分析手段

多肽类药物制剂研究常用的分析手段有:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、凝胶过滤层析法、反相液相层析法、紫外光谱法、荧光光谱法、红外光谱法、圆二色性光谱法、量热法以及生物活性测定法[9]。这里仅介绍药物制剂研究中常用的一种方法——量热法(Calorimetry)。

量热法是通过测定样品在受热过程中的放热和吸热行为来研究样品中各组份的相互作用及状态变化的一种方法,常用的是差示扫描量热法(Differentiat Sca nning Calo rim etry)。该方法广泛用于多肽的热稳定性分析、各种添加剂对多肽结构的影响、多肽与配基之间的相互作用等研究,还用于测定冻干物品的玻璃化温度和共熔点。例如, Chan等[10]用DSC研究了添加剂对rh DNase 溶液热变性的影响。蛋白质浓度为10mg/ ml,扫描速率为1.2℃/min。测得rh DNase 在纯水中的Tm=67.4℃,Hm=18.0J/g。加入Ca2+有利于rh DNa se的热稳定,加入Mg2+、M n2+则不利于rhDNase的稳定。当Ca Cl2浓度为20～100mmol/L时,Tm=76. 4℃,Hm=20～22J/g。Ca Cl2和乳糖对rh D-Nase的稳定有复合作用。同时加50mmol/L Ca Cl2和100mg/ml乳糖,可使rh DNase的Tm值提高到76.4℃,Hm值到21.9J/g。Chang等[11]用DSC测定了rh IL-lra制剂的玻璃化温度、反玻璃化温度和共熔点。冷冻蛋白制剂的各种物理变化,如玻璃化、反玻璃化和共熔都会影响冻干过程。根据测定结果,作

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