禽流感H9抗原检测卡说明书(完整版)
鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(N7a株+SZ株)说明书
鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（N7a株+SZ株）说明书【兽药名称】通用名鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联灭活疫苗（N7a株+SZ株）商品名无英文名Newcastle Disease and Avian Influenza（Subtype H9）Vaccine, Inactivated（Strain N7a+Strain SZ）汉语拼音Ji Xinchengyi Qinliugan（H9 Yaxing）Erlian Miehuoyimiao（N7a Zhu+SZ Zhu）【主要成分与含量】疫苗中含有灭活的鸡新城疫病毒N7a株，灭活前病毒含量≥108.6 EID50/0.1ml；含有灭活的禽流感（H9亚型）病毒SZ株，灭活前病毒含量≥108.5 EID50/0.1ml。
【性状】乳白色均匀乳剂。
【作用与用途】用于预防鸡新城疫和H9亚型禽流感。
免后21日可产生免疫力，免疫期为6个月。
【用法与用量】皮下或肌肉注射。
7～28日龄鸡，每只0.15ml；28日龄以上鸡，每只0.3ml。
【注意事项】（1）仅用于接种健康鸡。
（2）使用前应使疫苗恢复至室温。
（3）使用前和使用中应充分摇匀。
（4）疫苗开启后，限当日用完。
（5）本品严禁冻结，破乳后切勿使用。
（6）屠宰前28日内禁止使用。
（7）接种工作完毕，双手应立即洗净并消毒，用过的疫苗瓶、器具和未用完的疫苗等应进行无害化处理。
【规格】（1）100ml/瓶（2）250ml/瓶（3）300ml/瓶（4）500ml/瓶【包装】【贮藏与有效期】2～8℃保存，有效期为18个月。
【批准文号】【生产企业】仅在兽医指导下使用。
H9_亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(９):１９０１￣１９０７ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ张雪花ꎬ王卫华ꎬ武㊀奇ꎬ等.Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(９):１９０１￣１９０７.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０９.０１２Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力张雪花１ꎬ２ꎬ㊀王卫华１ꎬ３ꎬ㊀武㊀奇１ꎬ２ꎬ㊀李㊀丁１ꎬ２ꎬ㊀平继辉３ꎬ㊀梅㊀梅１ꎬ２(１.江苏省农业科学院动物免疫工程研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/江苏省食品质量与安全重点实验室ꎬ江苏南京２１００１４ꎻ２.兽用生物制品<泰州>国泰技术创新中心ꎬ江苏泰州２２５３００ꎻ３.南京农业大学动物医学院ꎬ江苏南京２１００９５)收稿日期:２０２３￣０３￣２３基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目[ＣＸ(２２)３０３１]作者简介:张雪花(１９８２－)ꎬ女ꎬ山东郓城人ꎬ硕士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事动物免疫学及兽用生物制品研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｚｈａｎｇｘ￣ｕｅｈｕａ１２１３＠１６３.ｃｏｍ通讯作者:梅㊀梅ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊａｃｑｕｉ１８＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒(ＡＩＶ)变异快㊁传染性强ꎬ由病毒流行株制备而成的灭活疫苗达不到完全保护的效果ꎬ导致Ｈ９Ｎ２亚型禽流感时有发生ꎮ为研发具有广谱保护性的Ｈ９亚型禽流感疫苗ꎬ本研究利用生物信息技术ꎬ对Ｈ９亚型ＡＩＶＨＡ基因序列进行分析ꎬ设计获得ＨＡ基因序列ꎮ将ＨＡ基因构建于杆状病毒表达系统ꎬ表达的重组ＨＡ蛋白血凝效价为１ˑ２１２ꎬ与不同分支Ｈ９亚型ＡＩＶ阳性血清具有良好的交叉反应活性ꎮ将重组蛋白制备成疫苗(ｒＨＡ疫苗)免疫１０日龄雏鸡ꎬ免疫后２８ｄ将不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ流行毒株１１５和ＹＺ株分别以１ˑ１０６ＥＩＤ５０(半数鸡胚感染量)感染试验鸡ꎬｒＨＡ疫苗组交叉保护效力明显优于商品苗组ꎮ本研究结果表明Ｈ９亚型禽流感广谱型亚单位疫苗具有较好的应用前景ꎬ可以用于防控Ｈ９ＡＩＶ感染ꎮ关键词:㊀Ｈ９亚型禽流感ꎻＨＡ基因ꎻ杆状病毒表达系统ꎻ广谱亚单位疫苗ꎻ免疫中图分类号:㊀Ｓ８５２.６５㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０９￣１９０１￣０７ＡｎｔｉｇｅｎｄｅｓｉｇｎａｎｄｉｍｍｕｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆａｕｎｉｖｅｒｓａｌｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＨ９ｓｕｂｔｙｐｅａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＺＨＡＮＧＸｕｅ￣ｈｕａ１ꎬ２ꎬ㊀ＷＡＮＧＷｅｉ￣ｈｕａ１ꎬ３ꎬ㊀ＷＵＱｉ１ꎬ２ꎬ㊀ＬＩＤｉｎｇ１ꎬ２ꎬ㊀ＰＩＮＧＪｉ￣ｈｕｉ３ꎬ㊀ＭＥＩＭｅｉ１ꎬ２(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＆ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＪｉａｎｇｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ/ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＦｏｏｄＱｕａｌｉｔｙａｎｄＳａｆｅｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００１４ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＧｕｏＴａｉ(Ｔａｉｚｈｏｕ)ＣｅｎｔｅｒｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｎｏ￣ｖａｔｉｏｎｆｏｒＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓꎬＴａｉｚｈｏｕ２２５３００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００９５ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｈｅＨ９Ｎ２ｓｕｂｔｙｐｅａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ(ＡＩＶ)ｅｖｏｌｖｅｄｒａｐｉｄｌｙｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙꎬａｎｄｔｈｅｉｎａｃ￣ｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍｔｈｅｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｃｏｕｌｄｎｏｔｐｒｏｖｉｄｅｃｏｍｐｌｅｔｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔꎬｗｈｉｃｈｌｅｄｔｏＨ９Ｎ２ＡＩＶｅｐｉ￣ｄｅｍｉｃｓｏｃｃｕｒｒｉｎｇｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ.Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＨ９ＡＩＶꎬｔｈｅＨＡｇｅｎｅｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅｓｏｆＨ９ＡＩＶｅｐｉｄｅｍｉｃｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬａｎｄＨＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｏｂ￣ｔａｉｎｅｄ.ＴｈｅＨＡｇｅｎｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍꎬａｎｄｔｈｅｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｔｉｔｅｒｏｆｒＨＡｐｒｏｔｅｉｎｗａｓ１ˑ２１２.ＴｈｅｒＨＡｓｈｏｗｅｄｇｏｏｄｃｒｏｓｓ￣ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒａｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｒａｎｃｈｅｓｏｆＨ９ＡＩＶ.Ｔｅｎ￣ｄａｙ￣ｏｌｄｃｈｉｃｋ￣ｅｎｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｒＨＡｐｒｏｔｅｉｎ.Ａｆｔｅｒ２８ｄａｙｓｏｆｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎꎬｔｅｓｔｉｎｇｃｈｉｃｋｅｎｓｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈ１ˑ１０６ＥＩＤ５０ｏｆＨ９ｓｕｂｔｙｐｅＡＩＶｓｔｒａｉｎ１１５ａｎｄｓｔｒａｉｎＹＺꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｒＨＡｖａｃｃｉｎｅｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｖａｃｃｉｎｅｇｒｏｕｐ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｔｈｅｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＨ９ｓｕｂ￣ｔｙｐｅＡＩＶｈａｓｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｏｂｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｓｕｎｉｖｅｒｓａｌｖａｃｃｉｎｅｔｈａｔｃａｎｐｒｏｔｅｃｔａｇａｉｎｓｔＨ９ＡＩＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀Ｈ９ｓｕｂｔｙｐｅａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａꎻＨＡ１０９１ｇｅｎｅꎻｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍꎻｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅｓꎻｉｍｍｕｎｉｔｙ㊀㊀中国于１９９４年在广东分离出第一个Ｈ９Ｎ２病毒ꎮ中国提供的数据中(全球共享所有流感数据倡议ꎬＧＩＳＡＩＤ)Ｈ９Ｎ２分离株超过７０％ꎮ最新的活禽市场监测结果显示ꎬ２０１４－２０２２年Ｈ９Ｎ２分离率持续居高不下ꎬＨ９Ｎ２亚型逐渐超越其他亚型ꎬ成为家禽中最主要的亚型ꎬ同时也成为养禽业的头号感染源[１￣２]ꎮ大多数感染Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ(亚型禽流感)的鸡不会直接死亡ꎬ从而保留了二次感染其他亚型流感病毒的机会ꎬ促进了病毒重组ꎮＨ９Ｎ２禽流感病毒作为 供体病毒 ꎬ为包括Ｈ３Ｎ８㊁Ｈ５Ｎ１㊁Ｈ７Ｎ９㊁Ｈ１０Ｎ８和Ｈ１０Ｎ３在内的各种病毒亚型提供多个内部基因[３￣６]ꎮＨ９Ｎ２ＡＩＶ继续传播和进化将进一步增加它作为新ＡＩＶ基因供体的风险ꎮ尽管Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ对禽类的致病性不强ꎬ但当与家禽中的其他病原体发生共感染或继发感染时ꎬ会造成重大经济损失[７￣９]ꎮ１９９８年ꎬ中国广东报道了世界首例人类感染Ｈ９Ｎ２禽流感病毒的病例[１０]ꎮ截至２０２１年１２月ꎬ在全球报告中ꎬ人类感染Ｈ９Ｎ２禽流感病毒确诊病例已达９５例ꎬ其中２０２０－２０２１年报道的３３例病例中有３２例来自中国ꎬ证实了Ｈ９Ｎ２禽流感病毒存在宿主溢出的高风险[１１]ꎮ可见Ｈ９Ｎ２不仅给家禽业造成严重的经济损失ꎬ也对人类健康构成重大的威胁ꎬ是重要的人兽共患病病毒ꎮＨ９型ＡＩＶ与Ｈ５㊁Ｈ７型高致病性禽流感的控制策略不同ꎮ虽然没有强制接种Ｈ９Ｎ２禽流感疫苗ꎬ但几乎所有鸡群都接种了Ｈ９疫苗ꎬ以减少潜在的经济损失ꎮ中国兽药基本信息数据库数据表明ꎬ在过去５年中ꎬ全国大约有５０家生物公司生产了单价或多价Ｈ９Ｎ２疫苗ꎮ经认证的Ｈ９疫苗相关产品中ꎬ疫苗株多达２５株ꎬ且均为全病毒灭活疫苗ꎮ研究和临床数据表明ꎬ接种Ｈ９Ｎ２疫苗可以减少病毒感染引起的临床症状ꎬ为免疫鸡群提供有效保护ꎮ然而ꎬＨ９Ｎ２频繁的抗原漂移是当前Ｈ９Ｎ２疫苗接种的挑战之一ꎮ当Ｈ９Ｎ２疫苗毒株与流行毒株之间的抗原性存在差异时ꎬ全病毒灭活疫苗无法提供足够的保护[１２]ꎮＨ９Ｎ２疫苗需要优化毒株以适应当前病毒变异㊁多抗原群共流行的情况ꎮ重要的是ꎬＨ９Ｎ２灭活疫苗主要诱导体液免疫ꎬ难以阻断鸡上呼吸道的病毒感染和排毒ꎮＨ９Ｎ２ＡＩＶ能够有效地在鸡与鸡之间进行气溶胶传播ꎬ即使在接种疫苗的鸡之间也是如此[１３]ꎬ加大了病毒防控难度ꎮ因此ꎬ 防排毒 成为Ｈ９Ｎ２新型疫苗研制的新标准和又一挑战ꎮ目前迫切需要开发更高效的疫苗来防控Ｈ９Ｎ２ꎬ例如在细胞和黏膜免疫水平上改进现有疫苗ꎬ或开发广谱疫苗以应对抗原的频繁变异[１４]ꎮ本研究室拟通过对Ｈ５亚型ＡＩＶ的血凝素(ＨＡ)蛋白质序列进行比对分析ꎬ设计出ＨＡ共有序列ꎬ制备成ＨＡ亚单位疫苗ꎬ效力试验结果证明ꎬＨＡ亚单位疫苗对不同流行毒株具有理想的保护效果[１５￣１６]ꎮ基于以上研究成果ꎬ本研究同样选择具有免疫原性的ＨＡ基因ꎬ通过对２０１０－２０１９年Ｈ９亚型ＡＩＶＨＡ蛋白关键性氨基酸位点进行分析和统计ꎬ选择每个位点最高频率氨基酸序列ꎬ并对关键性抗原位点进行校正ꎬ设计出ＨＡ(Ｈ９亚型)共有序列[１６]ꎬ利用杆状病毒表达系统表达ＨＡ蛋白ꎮ免疫效力试验结果表明ꎬ该疫苗具有良好的㊁广谱的免疫效果ꎬ为后续广谱疫苗的研究提供了研究数据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料本实验室于２０１７－２０１９年在浙江㊁安徽㊁江苏和山东等省份的养鸡场分离筛选Ｈ９亚型ＡＩＶ毒株１１５㊁２３６㊁ＹＺꎬ经进化树分析ꎬ３个毒株属于ｈ９.４.２.５分支的不同亚分支ꎮＨ９亚型禽流感代表性毒株[Ａ/ｃｈｉｃｋｅｎ/Ｓｈａｎｄｏｎｇ/６/１９９６(ｈ９.４.２.３)(ＳＤ/６)㊁Ａ/ｃｈｉｃｋｅｎ/Ｇｕａｎ￣ｇｘｉ/５５/２００５(ｈ９.４.２.５)(ＧＸ/５５)㊁Ａ/ｔｕｒｋｅｙ/Ｗｉｓｃｏｎｓｏｎ/１/１９６６(ｈ９.１)(ＷＩ/１)]由南京农业大学平继辉教授惠赠ꎮ杆状病毒表达系统为本实验室保存ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀目的基因的设计㊀对２０１０－２０１９年公布的Ｈ９亚型ＡＩＶＨＡ蛋白的抗原相关位点㊁受体结合位点㊁潜在糖基化位点等关键序列进行分析ꎬ结合本试验室分离的Ｈ９流行株关键性氨基酸位点ꎬ利用生物信息学软件选择高频氨基酸ꎬ并对关键性位点进行校正ꎬ设计合成基因ＨＡꎮ１.２.２㊀重组杆状病毒的获得与鉴定㊀利用杆状病毒表达系统构建和制备含有目的基因ＨＡ的重组杆状病毒ꎬ经蓝白斑筛选获得含有ＨＡ基因的重组质粒ꎮ用ＨＡ重组质粒转染Ｓｆ９细胞ꎬ２７ħ静置培养ꎬ每天观察ꎬ待转染细胞出现停止生长㊁变圆㊁脱落等细胞病变２０９１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第９期症状时ꎬ收获ꎬ得到重组杆状病毒ｒＶＨＡꎮ提取ｒＶＨＡ基因组ＤＮＡꎬ然后进行ＰＣＲ鉴定ꎮＰＣＲ鉴定正确后ꎬ取重组病毒ｒＶＨＡ上清液接种Ｓｆ９细胞ꎬ观察４ｄꎬ固定细胞ꎬ进行间接免疫荧光鉴定重组病毒特异性ꎮ１.２.３㊀重组蛋白的表达㊁分析㊀取重组杆状病毒ｒＶＨＡ上清液ꎬ接种悬浮培养的ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞ꎬ同时将野生型杆状病毒感染ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞作为对照ꎮ每天取少量细胞液进行台盼蓝染色ꎬ观察细胞死亡情况ꎬ待细胞９０％变蓝后收获ꎬ利用高压均质机将细胞破碎ꎬ进行Ｗｅｓｔｅｒｎ￣Ｂｌｏｔ㊁血凝活性等分析ꎮ１.２.４㊀红细胞凝集试验检测重组蛋白ＨＡ血凝活性㊀在微量血凝板上先加２５μｌ磷酸缓冲盐溶液(ＰＢＳ)ꎻ第一孔加２５μｌ重组蛋白(ｒＨＡ)混匀ꎬ倍比稀释至２１６ꎻ每孔再加入２５μｌＰＢＳ㊁２５μｌ１％鸡红细胞悬液ꎬ室温(２０~２５ħ)下反应３０ｍｉｎꎬ记录结果ꎮ１.２.５㊀重组杆状病毒传代后遗传稳定性及增殖性能鉴定㊀将重组杆状病毒ｒＶＨＡ连续传代至第８代ꎬ对每代ＨＡ基因的核酸序列进行测序ꎮ对每代重组杆状病毒进行病毒滴度(ＴＣＩＤ５０)鉴定ꎬ评价重组杆状病毒的增殖性能ꎮ１.２.６㊀交叉血凝抑制试验(ＨＩ)㊀检测ｒＨＡ与不同分支Ｈ９亚型ＡＩＶ病毒阳性血清(１１５㊁２３６㊁ＹＺ㊁ＳＤ/６㊁ＷＩ/１)的交叉反应活性ꎬ设无特定病原(ＳＰＦ)阴性血清为对照ꎮ１.２.７㊀重组蛋白的免疫原性评价㊀重组蛋白ｒＨＡ与白油按体积比１ʒ３乳化制备成ＨＡ油乳剂疫苗ꎮ乳化完全后ꎬ经性状㊁稳定性和无菌检验后ꎬ无菌装入疫苗瓶内ꎬ命名为ｒＨＡ疫苗ꎬ４ħ保存ꎮ１０日龄ＳＰＦ鸡３０只ꎬ分３组ꎬ每组１０只鸡ꎮ第一组ꎬｒＨＡ疫苗组ꎬ颈部皮下注射ｒＨＡ疫苗ꎬ每只注射０ ５ｍｌꎻ第二组ꎬ商品疫苗组ꎬ每只注射０ ３ｍｌꎻ第三组ꎬ阴性对照组ꎬ每只注射０ ５ｍｌ无菌生理盐水ꎮ免疫后第１４ｄ㊁２１ｄ㊁２８ｄ采血ꎬ分离血清ꎬ检测血清ＨＩ抗体效价ꎮ免疫２８ｄ后ꎬ选取２株处于不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ流行毒株１１５和ＹＺ株进行攻毒ꎬ每只攻毒剂量为１ˑ１０６ ０ＥＩＤ５０(半数鸡胚感染量)ꎮ每日观察鸡群采食量㊁饮水量以及精神状态是否出现异常ꎬ观察是否出现发病和死亡情况ꎮ攻毒后２ｄ㊁４ｄ㊁６ｄ㊁８ｄ㊁１０ｄ㊁１２ｄ㊁１４ｄ称量各组试验鸡的质量ꎬ计算鸡的相对增质量率ꎮ攻毒后３ｄ㊁５ｄ㊁７ｄ用无菌棉拭子采集鸡喉头和泄殖腔分泌物ꎬ采集的拭子样品通过尿囊腔途径接种１０日龄ＳＰＦ鸡胚３枚ꎬ每枚０ ２ｍｌꎬ每天观察ꎬ连续观察５日ꎬ检测鸡胚尿囊液血凝效价ꎮ若接种喉拭子或泄殖腔拭子的鸡胚任何一个出现鸡胚尿囊液血凝效价ȡ１ˑ２２ꎬ则该鸡排毒ꎻ若鸡胚尿囊液血凝效价<１ˑ２２则为可疑ꎬ需要盲传一代ꎬ盲传后血凝效价<１ˑ２２则判定为阴性ꎬ表明该鸡不排毒ꎮ１.３㊀数据处理用Ｒｅｅｄ￣Ｍｕｅｎｃｈ法计算病毒滴度ꎮ用Ｇｒａｐｈ￣ＰａｄＰｒｉｓｍ５软件进行统计学分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀重组质粒的鉴定对构建的ｐＦａｓｔＢａｃ１￣ＨＡ重组杆状病毒转移质粒进行双酶切验证ꎬ获得目的基因和载体２个条带(图１)ꎬ结果表明ＨＡ基因与载体ｐＦａｓｔＢａｃ１连接成功ꎮＭ:ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒꎻ１:双酶切重组质粒ꎮ图１㊀重组质粒ｐＦａｓｔＢａｃ１￣ＨＡ的鉴定Ｆｉｇ.１㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＦａｓｔＢａｃ１￣ＨＡ２.２㊀重组病毒的拯救与鉴定用重组质粒转染Ｓｆ９细胞ꎬ细胞变大变圆ꎬ折光率增加ꎬ细胞停止生长ꎬ表明细胞出现病变ꎬ收获为ｒＶＨＡꎮ通过间接免疫荧光检测重组病毒ｒＶＨＡ感染的细胞与不同Ｈ９阳性血清反应的情况ꎬ荧光显微镜下可见ꎬ感染重组病毒的细胞出现明亮的绿色荧光(图２Ａ~图２Ｃ)ꎻ野生型杆状病毒感染细胞未出现明显荧光(图２Ｄ)ꎬ表明含ＨＡ基因的重组杆状病毒拯救成功ꎬ且表达的ＨＡ蛋白与不同Ｈ９阳性血清间有反应活性ꎮ２.３㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定重组蛋白的表达ｒＶＨＡ感染的ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞完全病变后收获ꎬ用高压均质机裂解细胞ꎬ然后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ￣Ｂｌｏｔ鉴定ꎬｒＨＡ与Ｈ９亚型ＡＩＶ阳性血清孵育后ꎬ出现与预期大小一致㊁较明显的特异条带６３０００(图３)ꎬ证明ＨＡ蛋白成功获得大量表达ꎮ３０９１张雪花等:Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力Ａ:ｒＶＨＡ感染Ｓｆ９细胞(１１５血清)ꎻＢ:ｒＶＨＡ感染Ｓｆ９细胞(ＳＤ/６血清)ꎻＣ:ｒＶＨＡ感染Ｓｆ９细胞(ＷＩ/１)ꎻＤ:野毒感染Ｓｆ９细胞(１１５血清)ꎮ图２㊀重组蛋白ＨＡ与不同Ｈ９亚型禽流感阳性血清结合的间接免疫荧光法鉴定Ｆｉｇ.２㊀Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅ￣ｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＨＡｒｅａｃｔｉｎｇｗｉｔｈｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒａｏｆｄｉｆ￣ｆｅｒｅｎｔＨ９ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｓｕｂｔｙｐｅｓＭ:蛋白ｍａｒｋｅｒꎻ１:重组蛋白ＨＡꎻ２:野生杆状病毒对照ꎮ图３㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析重组蛋白质与Ｈ９阳性血清的反应Ｆｉｇ.３㊀ＲｅａｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒａｏｆＨ９ｓｕｂｔｙｐｅｓａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ２.４㊀重组蛋白ＨＡ血凝活性通过微量血凝试验检测ｒＨＡ血凝活性ꎬ同时设１１５病毒尿囊液为对照ꎬ表达的重组蛋白ＨＡ血凝效价为１ˑ２１２(图４)ꎬ说明ｒＨＡ具有凝集红细胞的生物学活性ꎮ２.５㊀重组病毒遗传稳定性及增殖性能鉴定测序结果显示ꎬ第１~８代重组杆状病毒的外源ＨＡ基因与目的序列完全一致ꎬ表明重组病毒具有良好的遗传稳定性ꎮ重组杆状病毒传至第７~８代时病毒滴度达１０８.００ＴＣＩＤ５０/ｍｌ以上(表１)ꎬ表明重组杆状病毒增殖性能良好ꎮ图４㊀重组ＨＡ蛋白的血凝活性检测Ｆｉｇ.４㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨＡｐｒｏｔｅｉｎ表１㊀重组杆状病毒稳定性检测结果Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｔａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ毒种代次ＴＣＩＤ５０的对数Ｐ３６.００Ｐ４６.５０Ｐ５７.２５Ｐ６７.５０Ｐ７８.５０Ｐ８８.２５ＴＣＩＤ５０:病毒滴度ꎮ２.６㊀重组ＨＡ蛋白交叉反应活性通过ＨＩ试验测定ｒＨＡ与不同分支Ｈ９阳性血清交叉反应的抗原性ꎬ并同时与不同分支Ｈ９病毒进行比较ꎮ由图５可知ꎬｒＨＡ与现有流行毒株血清(ｈ９.４.２.５)反应的ＨＩ滴度较高ꎬ与分支较远的ＷＩ/１(ｈ９.１)反应最差ꎮ除去血清与同源病毒的反应ꎬｒＨＡ反应活性明显优于其他病毒ꎬ表明ｒＨＡ具有良好的交叉反应活性ꎮ２.７㊀重组病毒的免疫原性评价ＨＩ血清抗体作为流感疫苗血清学保护的反应指标ꎬ商品疫苗效力评判标准为ＨＩ抗体效价ȡ１ˑ２６.００ꎮ试验组于免疫后１４ｄ㊁２１ｄ㊁２８ｄ采集静脉血ꎬ以分离的流行毒株１１５㊁ＹＺ作为检测抗原检测血清抗体ＨＩ效价ꎮ重组蛋白疫苗免疫后１４ｄ即可诱导鸡产生较高水平的ＨＩ抗体应答ꎬ免疫后１４ｄＨＩ效４０９１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第９期价能达到１ˑ２１２.００以上ꎬ免疫后２８ｄ达到１ˑ２１４.５９ꎬｒＨＡ组抗体效价显著高于商品苗组(图６)ꎮ㊀㊀ＳＰＦ鸡免疫２８ｄ后ꎬ对不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ流行株１１５和ＹＺ以１ˑ１０６ＥＩＤ５０的病毒量进行攻毒ꎮ临床观察结果显示ꎬ各攻毒试验组在攻毒后１４ｄ内均无死亡ꎮｒＨＡ组㊁商品苗组在攻毒后无异常ꎬ饮水量㊁采食量㊁精神状态均正常ꎬ空白组(阴性组)在攻毒后４ｄ食欲与饮水欲相对较差ꎮ攻毒后２ｄ㊁４ｄ㊁６ｄ㊁８ｄ㊁１０ｄ㊁１２ｄ㊁１４ｄ分别对各组试验鸡称体质量ꎬ并计算不同试验组鸡体质量相对增长率ꎮ结果显示ꎬｒＨＡ免疫组的试验鸡相对增质量率最高ꎻ空白组(阴性组)的鸡相对增质量率明显低于免疫组(图７)ꎮａ:ｒＨＡꎻｂ:ｈ９.４.２.５￣１１５ꎻｃ:ｈ９.４.２.５￣２３６ꎻｄ:ｈ９.４.２.５￣ＹＺꎻｅ:Ｓｈ９.４.２.３￣ＳＤ/６ꎻｆ:ｈ９.１￣ＷＩ/１ꎮｈ９.４.２.５为流行毒株ꎮ图５㊀重组蛋白ＨＡ与Ｈ９不同阳性血清型交叉反应活性Ｆｉｇ.５㊀Ｃｒｏｓｓ￣ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＨＡｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒ￣ｅｎｔｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｒｏｔｙｐｅｓｏｆＨ９Ａ:以病毒１１５为检测抗原检测免疫后血清ＨＩ抗体ꎻＢ:以病毒ＹＺ为检测抗原检测免疫后血清ＨＩ抗体ꎮ∗表示差异显著(Ｐ<０ ０５)ꎮ图６㊀不同抗原检测免疫后血清ＨＩ抗体Ｆｉｇ.６㊀ＨＩａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｓｅｒａａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｇｅｎｓＡ:感染１１５毒株后试验鸡相对增质量率ꎻＢ:感染ＹＺ毒株后试验鸡相对增质量率ꎮ图７㊀攻毒后不同试验组鸡的相对增质量率Ｆｉｇ.７㊀Ｒｅｌａｔｉｖｅｗｅｉｇｈｔｇａｉｎｒａｔｅｏｆｃｈｉｃｋｅｎｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓａｆｔｅｒｃｈａｌｌｅｎｇｅ㊀㊀１１５和ＹＺ毒株感染后３ｄ㊁５ｄ㊁７ｄ分别采集各组试验鸡的咽拭子和泄殖腔拭子样品ꎬ测定攻毒后每只鸡的排毒情况ꎮ感染１１５毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组喉头排毒率为２０％ꎬ泄殖腔排毒率为０ꎻ感染５ｄ后ꎬ喉头排毒率为２０％ꎬ泄殖腔排毒率为０ꎻ商品苗感染３ｄ后ꎬ喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率为２０％ꎻ感染５ｄ后ꎬ喉头排毒率为２０％ꎬ泄殖腔未检测到排毒ꎻ阴性对照组感染３ｄ㊁５ｄ后ꎬ喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率为１００％ꎻ感染７ｄ后所有组未测到排毒(表２)ꎮ５０９１张雪花等:Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力表２㊀感染１１５毒株免疫保护结果Ｔａｂｌｅ２㊀Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔ１１５ｓｔｒａｉｎｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ组别㊀㊀喉头排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄ泄殖腔排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄｒＨＡ组２０２０００００商品苗组１００２００２０００阴性对照组１００１０００１００１０００㊀㊀攻击ＹＺ毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组的喉头排毒率为２０％ꎻ其余未检测到病毒ꎬ排毒率为０ꎮ商品苗组攻毒３ｄ后的喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率为２０％ꎻ攻毒５ｄ后喉头排毒率为４０％ꎬ泄殖腔未检测到排毒ꎮ阴性对照组攻毒３ｄ㊁５ｄ后的喉头排毒率为１００％ꎬ泄殖腔排毒率也为１００％ꎮ７ｄ后所有组未测到排毒(表３)ꎮ综上ꎬｒＨＡ疫苗组保护率明显高于商品苗组ꎬ表明ｒＨＡ疫苗对当前Ｈ９亚型ＡＩＶ流行株毒株具有良好的保护效果ꎮ表３㊀感染ＹＺ毒株免疫保护结果Ｔａｂｌｅ３㊀ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔＹＺｓｔｒａｉｎｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ组别㊀㊀喉头排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄ泄殖腔排毒率(％)３ｄ５ｄ７ｄｒＨＡ组２００００００商品苗组１００４００２０００阴性对照组１００１０００１００１０００３㊀讨论目前ꎬ中国控制Ｈ９Ｎ２禽流感的主要策略是疫苗接种ꎮ然而ꎬ中国Ｈ９Ｎ２病毒多种抗原型同时流行ꎬ疫苗更新速度落后于病毒变异速度ꎬ使有效疫苗接种面临挑战ꎮ灭活疫苗免疫可有效减轻Ｈ９Ｎ２病毒感染后的临床症状ꎬ大大减少经济损失ꎮ然而ꎬ另一个挑战是全病毒灭活疫苗免疫不能阻止Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ再感染或病毒脱落ꎮ在中国ꎬ包括散养和混养在内的传统畜牧业系统继续占据重要地位ꎬ然而ꎬ中国家禽业的主要发展方向是集约化圈养ꎮ研制具有广谱性中和活性的通用疫苗对于控制Ｈ９Ｎ２具有重要意义ꎮ关于广谱疫苗的研究已有报道ꎬ利用Ｅｐｉｇｒａｐｈ算法来设计猪Ｈ３流感疫苗血凝素蛋白ꎬ该疫苗接种小鼠后可产生显著针对不同Ｈ３分离株的交叉反应抗体和Ｔ细胞反应ꎬ免疫雪貂后ꎬ用２种Ｈ３Ｎ２病毒攻击ꎬ该疫苗可保护雪貂免受攻击毒株的侵害[１７￣１８]ꎻ基于马赛克ＨＡ序列的Ｈ９亚型禽流感灭活疫苗能对异源Ｈ９Ｎ２ＡＩＶ株产生较好的交叉攻毒保护效果[１９]ꎮ随着基因工程技术的发展ꎬ重组病毒表达系统成为生产有广谱交叉免疫效果的禽流感疫苗的技术平台ꎮ杆状病毒表达系统具有诸多优点:不使用活病毒ꎬ生物安全性高ꎻ表达的ＨＡ蛋白可组装成病毒样颗粒(ＶＬＰ)ꎬ其结构功能与天然蛋白质相似ꎬ免疫原性良好ꎬ蛋白质表达效率高ꎻ重组杆状病毒基因遗传稳定ꎬ病毒增殖性能良好ꎬ保证了疫苗的生产质量[２０￣２１]ꎮ新型广谱疫苗一直是防控禽流感病毒相关研究的热点方向ꎬ只研究单个毒株的ＨＡ免疫原性ꎬ不能得到具有广谱保护效果的疫苗ꎬ本研究通过对２０１０－２０１９年Ｈ９亚型禽流感及本试验室分离的最新流行株ＨＡ蛋白的抗原相关位点㊁受体结合位点㊁潜在糖基化位点等关键位点序列进行分析ꎬ并对关键位点进行校正ꎬ利用生物信息学软件选择每个位点最高频次氨基酸设计合成ＨＡ基因ꎬ并构建杆状病毒表达系统获得重组蛋白ꎬ经间接免疫荧光㊁免疫印迹㊁交叉血凝抑制试验对其广谱活性进行鉴定ꎬ初步证明重组蛋白具有广谱的交叉反应活性ꎮ重组蛋白疫苗免疫后１４ｄ即可诱导鸡产生较高水平的ＨＩ抗体应答ꎬ１４ｄＨＩ效价能达到２１２.００以６０９１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第９期上ꎬ２８ｄ达到１ˑ２１４.５９ꎬ显著高于商品苗组ꎮ用２株不同亚分支的Ｈ９亚型ＡＩＶ毒株１１５㊁ＹＺ攻击免疫组鸡ꎬ各组均未出现临床症状ꎮ攻击１１５毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为８０％ꎬ商品苗保护率为０ꎻ５ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为８０％ꎬ商品苗保护率为８０％ꎮ攻击ＹＺ毒株３ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为８０％ꎬ商品苗保护率为０ꎻ５ｄ后ꎬｒＨＡ疫苗组保护率为１００％ꎬ商品苗保护率为６０％ꎮ表明ꎬ重组蛋白疫苗组产生较好的交叉保护效果ꎬ明显高于商品苗组ꎮ另外ꎬ本研究采用高表达效率的ｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞ꎬ提高了蛋白质的表达量ꎬ血凝活性高达１ˑ２１２ꎻｈｉｇｈｆｉｖｅ细胞为无血清培养基培养的全悬浮细胞ꎬ降低了成本ꎬ生产周期变短ꎬ适于大规模培养ꎬ为亚单位疫苗规模化生产提供了可行性ꎮ综上ꎬ通过分析㊁设计Ｈ９亚型禽流感ＨＡ关键位点等得到ＨＡ基因ꎬ利用Ｂａｃ￣ｔｏ￣Ｂａｃ表达的外源蛋白ＨＡ具有广谱的保护效力ꎬ可为研究Ｈ９亚型广谱亚单位疫苗提供技术基础和科学依据ꎮ参考文献:[１]㊀ＢＩＹＨꎬＣＨＥＮＱＪꎬＷＡＮＧＱＬꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｅｓｉｓꎬｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆＨ５Ｎ６ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＣｅｌｌＨｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅꎬ２０１６ꎬ２０(６):８１０￣８２１.[２]㊀ＢＩＹＨꎬＬＩＪꎬＬＩＳＱꎬｅｔａｌ.Ｄｏｍｉｎａｎｔｓｕｂｔｙｐｅｓｗｉｔｃｈｉｎａｖｉａｎｉｎ￣ｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｄｕｒｉｎｇ２０１６－２０１９ｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉ￣ｃａｔｉｏｎｓꎬ２０２０ꎬ１１(１):５９０９.[３]㊀ＰＵＪꎬＷＡＮＧＳＧꎬＹＩＮＹＢꎬｅｔａｌ.ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕ￣ｅｎｚａｇｅｎｏｔｙｐｅｔｈａｔｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄｔｈｅｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅｎｏｖｅｌＨ７Ｎ９ｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔ￣ｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１５ꎬ１１２:５４８￣５５３.[４]㊀ＧＵＡＮＹꎬＳＨＯＲＴＲＩＤＧＥＫＦꎬＫＲＡＵＳＳＳꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒ￣ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ:ｗｅｒｅｔｈｅｙｔｈｅｄｏｎｏｒｓｏｆｔｈｅ"ｉｎｔｅｒｎａｌ"ｇｅｎｅｓｏｆＨ５Ｎ１ｖｉｒｕｓｅｓｉｎＨｏｎｇＫｏｎｇ?[Ｊ].Ｐｒｏｃｅｅｄ￣ｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡ￣ｍｅｒｉｃａꎬ１９９９ꎬ９６(１６):９３６３￣９３６７.[５]㊀ＱＩＷꎬＺＨＯＵＸꎬＳＨＩＷꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｈｅｎｏｖｅｌｈｕｍａｎ￣ｉｎｆｅｃ￣ｔｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａＡ(Ｈ１０Ｎ８)ｖｉｒｕｓａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓｉｎｐｏｕｌｔｒｙꎬＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｅｕｒｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅꎬ２０１４ꎬ１９(２５):２０８４１.[６]㊀ＬＩＦＴꎬＬＩＵＪＹꎬＹＡＮＧＪＺꎬｅｔａｌ.Ｈ９Ｎ２ｖｉｒｕｓ￣ｄｅｒｉｖｅｄＭ１ｐｒｏ￣ｔｅｉｎｐｒｏｍｏｔｅｓＨ５Ｎ６ｖｉｒｕｓｒｅｌｅａｓｅｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ:ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｔｅｒ￣ｓｐｅｃｉｅｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇｅｎｓꎬ２０２１ꎬ１７(１２):ｅ１０１００９８.[７]㊀ＬＩＣＪꎬＹＵＫＺꎬＴＩＡＮＧＢꎬｅｔａｌ.ＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉ￣ｒｕｓｅｓｆｒｏｍｄｏｍｅｓｔｉｃｐｏｕｌｔｒｙｉｎｍａｉｎｌａｎｄＣｈｉｎａ[Ｊ].ＶｉｒｏｌｏｇｙＪｏｕｒ￣ｎａｌꎬ２００５ꎬ３４０(１):７０￣８３.[８]㊀ＣＨＯＩＹＫꎬＯＺＡＫＩＨꎬＷＥＢＢＹＲＪꎬｅｔａｌ.ＣｏｎｔｉｎｕｉｎｇｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎｓｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌ￣ｏｇｙꎬ２００４ꎬ７８(１６):８６０９￣８６１４.[９]㊀ＧＵＯＹＪꎬＫＲＡＵＳＳＳꎬＳＥＮＮＥＤＡꎬｅｔａｌ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｎｅｗｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｌｉｎｅａｇｅｓｉｎＡｓｉａ[Ｊ].ＶｉｒｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０００ꎬ２６７(２):２７９￣２８８.[１０]郭元吉ꎬ李建国ꎬ程小雯ꎬ等.禽Ｈ９Ｎ２亚型流感病毒能感染人的发现[Ｊ].中华实验和临床病毒学杂志ꎬ１９９９ꎬ１３(２):５￣８. [１１]ＡＤＬＨＯＣＨＣꎬＦＵＳＡＲＯＡꎬＧＯＮＺＡＬＥＳＪＬꎬｅｔａｌ.Ａｖｉａｎｉｎｆｌｕ￣ｅｎｚａｏｖｅｒｖｉｅｗＳｅｐｔｅｍｂｅｒ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０２１[Ｊ].ＥＦＳＡＪｏｕｒｎａｌꎬ２０２１ꎬ１９(１２):ｅ０７１０８.[１２]ＳＵＮＹＰꎬＰＵＪꎬＦＡＮＬＨꎬｅｔａｌ.Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｉ￣ｆｉｃａｃｙｏｆａｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｖａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｇｅｎｉｃｇｒｏｕｐｓｏｆＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓ[Ｊ].ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ１５６(１/２):１９３￣１９９.[１３]ＺＨＯＮＧＬꎬＷＡＮＧＸＱꎬＬＩＱＨꎬｅｔａｌ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅａｉｒｂｏｒｎｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆＨ９Ｎ２ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａＡｖｉｒｕｓｅｓｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ８８(１７):９５６８￣９５７８. [１４]ＤＯＮＧＪＺꎬＺＨＯＵＹꎬＬＩＵＬＴꎬｅｔａｌ.ＳｔａｔｕｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｆｏｒｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔａｖｉａｎＨ９Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].Ｌｉｆｅ￣ｂａｓｅｌꎬ２０２２ꎬ１２(９):１３２６.[１５]ＷＵＰＰꎬＬＵＪＨꎬＺＨＡＮＧＸＨꎬｅｔａｌ.Ｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｏｆｃｏｎｓｅｎｓｕｓｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ￣ｂａｓｅｄｖｉｒｕｓ￣ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｔｅｃｔｓｃｈｉｃｋｅｎｓａｇａｉｎｓｔｄｉｖｅｒｇｅｎｔＨ５ｓｕｂｔｙｐｅｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＩｍ￣ｍｕｎｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ８:１６４９.[１６]张雪花ꎬ陆吉虎ꎬ华㊀涛ꎬ等.通用型Ｈ５亚型禽流感病毒亚单位疫苗抗原表达和免疫效力研究[Ｊ].病毒学报ꎬ２０１９ꎬ３５(６):８６４￣８７２.[１７]ＢＵＬＬＡＲＤＢＬꎬＣＯＥＤＥＲＢＮꎬＤＥＢＥＡＵＣＨＡＭＰＪꎬｅｔａｌ.Ｅｐｉ￣ｇｒａｐｈｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｖａｃｃｉｎｅｉｎｄｕｃｅｓｂｒｏａｄｃｒｏｓｓ￣ｒｅａｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙａｇａｉｎｓｔｓｗｉｎｅＨ３ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎꎬ２０２１ꎬ１２(１):１２０３.[１８]ＢＵＬＬＡＲＤＢＬꎬＤＥＢＥＡＵＣＨＡＭＰＪꎬＰＥＫＡＲＥＫＭＪꎬｅｔａｌ.Ａｎｅｐｉｔｏｐｅ￣ｏｐｔｉｍｉｚｅｄｈｕｍａｎＨ３Ｎ２ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｉｎｄｕｃｅｓｂｒｏａｄＬＹｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎｍｉｃｅａｎｄｆｅｒｒｅｔｓ[Ｊ].ＮＰＪＶａｃｃｉｎｅｓꎬ２０２２ꎬ７(１):６５.[１９]李㊀丽ꎬ唐国毅ꎬ冯贺龙ꎬ等.基于马赛克ＨＡ序列的Ｈ９亚型禽流感灭活疫苗的免疫效力分析[Ｊ].畜牧兽医学报ꎬ２０２１ꎬ５２(１２):３５６９￣３５７７.[２０]ＢＵＣＫＬＡＮＤＢꎬＢＯＵＬＡＮＧＥＲＲꎬＦＩＮＯＭꎬｅｔａｌ.Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｒａｎｓｆｅｒａｎｄｓｃａｌｅ￣ｕｐｏｆｔｈｅＦｌｕｂｌｏｋｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ(ＨＡ)ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓꎬ２０１４ꎬ３２(４２):５４９６￣５５０２.[２１]ＭＡＮＮＩＮＩＩꎬＴＲＯＭＢＥＴＴＡＭꎬＬＡＺＺＥＲＩＧꎬｅｔａｌ.Ｅｇｇ￣ｉｎｄｅｐｅｎｄ￣ｅｎｔｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｃａｎｄｉｄａｔｅｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅｓ(Ｂａ￣ｓｅｌ)ꎬ２０１７ꎬ５(３):１８.(责任编辑:陈海霞)７０９１张雪花等:Ｈ９亚型禽流感广谱亚单位疫苗抗原设计及其免疫效力。
h9禽流感流行特点
当下H9禽流感的流行特点禽流感症状治疗措施一、当下H9流感流行特点1、根据国家有关实验室统计数据，2012年商品肉鸡感疫病染率最高的依然是H9。
如果将H9与H5加起来，总的感染率是82.21%。
这说明每只鸡死亡的原因，有82.21%来源于禽流感。
而由其他疾病导致的只占17.79%。
在商品肉鸡、肉杂鸡、青年鸡群中，根据国家有关机构资料证明，H9流感病毒（AIV）隐性感染率1%。
2、从去年冬天到今年春天，河北工程大学的专家教授化验室检测发现，普遍发生H9与IB、H9与ND及细菌病、H9与IBD及细菌引起的混合感染，甚至在临床上没有出现H9的症状，化验室化验也是H9阳性。
而且比去年比例增大。
吴延功以H9作为重点分析了近几年来疾病的流行特点：季节不同表现形式不一。
寒冷的秋冬季节主要以呼吸道疾病流行为主；炎热的夏季主要表现为病毒性肠炎和腹泻。
3、单独感染H9之后并没有固定的临床表现症状。
通过病毒接种实验，看不到H9的任何病变和症状，曾采取肌注等多种方式攻毒后，未发现H9有任何的临床表现症状。
这说明H9并不单独感染，也不致病，只有继发或并发了其他的疾病之后才会表现出一些临床症状。
4、因此，在防控H9型禽流感时应将治疗与它一起作怪的疾病同步进行。
从国家动物卫生、疫病研究中心得到的数据，我们可以得出以下结论。
二、H9流感与常见的其它病毒混感分析1.新城疫与H9型禽流感混合感染发病率最高，在临床上也是最常见的。
突出的表现是新城疫疫苗免疫后的2~3d就出现呼吸道症状或者新城疫症状，这是H9、新城疫及细菌混合感染的结果。
在我们检测到感染新城疫的有85例病例中，单独感染新城疫的仅有4例。
应在鸡免疫前和免疫时要加强保健。
首先是增强鸡的抵抗力，可以选用增强免疫的中药方剂进行保健。
一般免疫都是选在前三周进行，这三周至少要进行1个~2个疗程的保健，如果不保健的话，鸡就极有可能发病。
其次针对不同的鸡群合理应用抗生素；此外，在免疫时须再次增强抵抗力。
鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感 (H9亚型)四联灭活
附件2（略）附件3（略）附件4鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感（H9亚型）四联灭活疫苗（La Sota株+M41株+K-11株+ SS/94株）等2种兽药产品说明书和标签一、鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感（H9亚型）四联灭活疫苗（La Sota株+M41株+K-11株+SS/94株）说明书和标签（一）鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感（H9亚型）四联灭活疫苗（La Sota株+M41株+K-11株+SS/94株）说明书【兽药名称】通用名鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征、禽流感（H9亚型）四联灭活疫苗（La Sota株+M41株+K-11株+SS/94株）商品名无英文名Combined Newcastle Disease，Infectious Bronchitis，Egg Drop Syndrome and Avian Influenza（Subtype H9）Vaccine，Inactivated（Strain La Sota+Strain M41+Strain K-11 +Strain SS/94）汉语拼音Ji Xinchengyi，Chuanranxingzhiqiguanyan，Jiandanzonghezheng，Qinliugan （H9 Yaxing）Silian Miehuoyimiao（La Sota Zhu+M41 Zhu+K-11 Zhu+SS/94 Zhu）【主要成分与含量】疫苗中含灭活的鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M41株、减蛋综合征病毒K-11株和禽流感H9亚型病毒SS/94株，灭活前鸡新城疫病毒含量不低于4×108.0EID50/0.1ml，传染性支气管炎病毒含量不低于4×106.0EID50/0.2ml，减蛋综合征病毒含量不低于4×108.0EID50/0.1ml，禽流感H9亚型病毒含量不低于4×107.0EID50/0.2ml。
鸡禽流感病毒检测试剂盒说明书
使用说明书一、可做90次检测所需要的试剂：a)1块包被AIV抗原的微孔板b)10ul AIV阳性对照血清c)10ul AIV阴性对照血清d)100ul 针对鸡IgG(H+L)的山羊抗体过氧化物酶标记溶液e)40ml 稀释缓冲液f)10ml ABTS-Hydrogen Peroxide基质溶液g)2.5ml 5倍浓度反应终止液，5%SDS（用去离子水1：5稀释）h)20ml 20倍浓度洗涤液（用去离子水1：20稀释）注意：所有试剂盒内的试剂要2-7℃保存，不要冷冻。
二、检测需要但试剂盒没有提供的设备和材料：a)高精密度的移液器（1-20ul移液器）b)0.2ml、1.0ml和5.0ml移液器c)8道或12道移液器及吸头d)2个量筒（50ml）e)1ml或5ml硼硅酸盐玻璃试管f)未包被的低吸附的96孔微孔板（如Nunc catalog#269620）g)实验室级别用水（去离子蒸馏水）h)96孔板酶标仪（波长405-410nm）i)洗板设备j)盛有漂白剂或其他氧化剂的废液容器三、使用试剂和AIV抗原包被的微孔板的操作者请注意：a)所接触的试剂和样品是具有生物危险性的材料b)防止所有试剂接触皮肤和眼睛。
一旦接触，立即用冷水冲洗接触的地方。
c)洗涤液、对照液、检测板、样品和其它试剂盒内的试剂在处理前必须用漂白剂或其他强氧化剂来净化。
d)特别要注意任何检测试剂不能被血清或细菌污染。
e)每一块板中均有湿度指示剂，如果湿度指示剂变粉红色，这说明板有可能被损害，这时可以用一些办法进行处理，如净化（即用漂白液洗板）。
f)好的实验结果是在依照其后的操作程序，并用正确的、安全的实验室操作技术达到的。
g)不要使用过了有效期的试剂盒。
h)决不能用嘴接触移液器在使用开始前让所有试剂放置到室温（大约22-24度）四、样品采集为了建立群体血清学检测程序，建议每一个群体至少要在一个固定间隔时间（如每四周）随机抽取30份或更多的样品。
禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗
三 、 用 作 物 适
苹 果 新
口
口口
适用于各类蔬菜类 、 粮油类 、 果树类及 各类 大棚经济作物 ，
对土壤板结 、 土壤硬化 、 肥效降低有特效。
。
加乐多是经 国家农业 部审定登记的土壤调理剂。 该产品是 山东汇丰源农业科技发展有限公 司以高活性海藻质 、中微量元
一
素 、８ １ 种氨基酸 ， 高强度螫合剂 和有益 活性菌 为原料 ， 针对我 国 农业生产中不合理施肥造成 的土壤板结 ， 肥效降低 ， 产品质量 农
下降等现象而研发生产 的高科 技产 品。
一
用法与用量 ： 胸部肌 肉或颈部皮下注射。 － ２５
周龄鸡 ， 只 ０３ ， 周龄 以上鸡， 每 ． ５ ｍｌ 每只 ０５ 。 ． ｍｌ
注 意 事项 ：
、
功效
１ ． 主要通过高活性物质与水的媒 介作 用 ， 促进土壤迅速形 。
成团粒结构 ， 降低容重 ， 增加土壤孔 隙度 ， 提高土壤通透性 ， 活跃 土壤微生物 ， 为植物根系创造 良好 的外部环境条件 ， 促使植物根 系始终处于适合生长发育的环境 ， 形成健壮的功能根群 ， 促进根
一
（） １禽流感病毒感染鸡或健康状况异常 的鸡 切忌使用本品。
（ ） 品严禁冻结。 ２本 系对肥水的吸收利用 ， 为植物优质高产培育一个 强“ 大“ ， ｊ 源” 库” （ ） 品若 出现破损 、 ３本 异物 或破乳分 层等异 从而增强土壤保肥保水能力。 常现象 ， 切勿使用。 ２加乐 多彻底改变 了传统 施肥“ 一顿饱一顿 ” ． 饥 的营养状 （） ４ 使用前应将 疫苗恢 复至常温 ， 并充分 摇
肉鸽使用H9亚型禽流感疫苗免疫效果和生产性能变化分析
种鸽 青 年鸽 乳鸽 发病 数 发病 率 死亡 数 死亡率 发 病数 发 病率 死亡 数 死亡 率 发病 数 发病率 死 亡数 死 亡率
免 疫 鸽群 在免 疫 保护 期 内 。调查 时 间 可追 溯 １ 年
以 上
验抗 原 （ 批号 ： ２ ０ １ ３ ０ ０ １ ） 和 阳性 血 清 （ 批 号
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ４ — ０ １ — １ ５ ຫໍສະໝຸດ 成 就 未 来 ９
２ 结 果
２ ． 】 Ｈ 亚 型 抗 体 检 测 结 果
养殖 场 ， 开展 生产 性 能和 免疫 效 果 的跟 踪调 查 ． 具
１ ． ３ ． １ 样 品 来 源
１ ． ３ ． １ ． １ 未免 血 样
安 徽 省六 安 市境 内随机 选 取
ｌ ０个 规 模 鸽 场 ， 按鸽群 １ ％～ ３ ％比例 ． 采集 ６ ０ ０份
样 。
１ ． ３ ． １ ． ２ 免 疫 血 样 在 鸽 群 注 射 Ｈ 。 亚 型 禽 流 感 疫苗 ２ １ ｄ后 ， 按鸽群 ５ ％～ １ ０ ％ 比例 ， 采集 ２ ６ ０ ０份
２ ． １ ． ２ 免 疫鸽 抗 体检 测 结 果 检测 ２ ５ ９ ２份 样 品 ．
２ ． ２ ． ２ 未免鸽 群 和免 疫鸽 群 的 生 产性 能 比较 结
果 见 表 ２．
ＨＩ 抗 体 效 价 ≥４ １ ｏ ｇ ２者 有 ２ ４ ６ ７份 ，抗 体 合 格 率
表 １ 鸽 群健康 状 况调查 统计 表 调查 只数 种鸽 鸽 群健康 状态 青 年鸽 乳鸽
ｌ － ＇ ｏ ｕ ｔ ｔ ｒ ｙ ５ ｃ ｗｎ ｃ ｅ
肉 免
栗新 ， 胡祖 余 ， 吴 昌宏 ， 王举 勇 （ 安 徽 省裕 安 区动 物疫 情 测报 站 ， 安徽 六安 ２ ３ ７ ０ ０ ０ ） 摘 要 ： 为 了解 肉鸽 使 用 Ｈ 亚 型禽 流 感 疫 苗前 后 免 疫 效 果和 生 产 性 能 的 变化 。 随 机 采 集 ６ ｏ ｏ ４ ￣未 免 血样 和 ２ ６ ０ ０份 免 疫血 样 ， 开展 Ｈ 亚 型 禽 流感 疫 苗免 疫 前后 抗 体检 测 ， 并 对 种鸽 免
鸡新城疫禽流感(H9亚型)传染性法氏囊病三联灭活疫苗(LaSota株+YBF003株+S-VP2蛋白)
鸡 新城 疫 （ Ｎｅ ｗ ｃ ａ ｓ ｔ ｌ ｅ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ． ＮＤ） 、 Ｈ９亚 型 禽 流 感 （ Ｈ９ ｓ ｕ ｂ ｔ ｙ ｐ ｅ Ａ ｖ ｉ ａ ｎ Ｉ ｎ ｌ ｆ ｕ ｅ ｎ ｚ ａ ． ＡＩ ） 、 传染性法 氏囊病 （ Ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｉ ｔ ｏ ｕ ｓ Ｂ ｕ ｒ ｓ ａ ｌ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ． Ｉ Ｂ Ｄ） 是影 响养 禽业发展 的三种重 大传染病 ， 并且 这三种传染病在很 多地 区的养鸡场同时存 在 ， 某 些地 区发病还 相 当严重 ， 给养鸡业造成 巨大 的经济损失 。国内 外近年 因抗原浓缩技术和疫 苗佐 剂等工艺技术 的发展 ， 上 述三 种病 相应疫苗 的研究及应 用非常普遍 ， 但 目前还 没有 鸡新城疫 、 禽 流感 （ Ｈ９亚型 ） 、 传染 性法氏囊病三联灭 活疫 苗上 市。 单剂量接种 的安全试验 ” 、 “ 对靶 动物非 使用 日龄 的安全 试 验” 、 “ 对靶动物单剂量接种 、 单剂量重复接种 、 一次超剂 量 接种 的安全试验 ” 、 “ 对产蛋 期蛋鸡安全 试验 ” 、 “ 三 联苗 接 种对鸡的免疫学 功能影响及对鸡的生长 ｝ 生 能影 响” 。试 验 结果表 明： 鸡只精神状态均 良好 ， 采食饮水均正 常 ， 无异 常 反应 ； 疫 苗接种后对鸡 的免疫学功能 也无 明显影 响。 为验证疫 苗的安全性 ， 我们用 中试产 品开展 了临床试 验， 共免疫 试验鸡 近 ５万 羽 ， 所有 免疫鸡 免疫三联 苗后 采 食、 饮水 、 产蛋 均正常 ， 无任 何不 良反应 ， 抽取部分 雏鸡解 剖 ，结果 注射部位 １ ４日后吸收 良好 ， ｌ ｍ ｌ ／ 只 接种组解 剖 后无结节 ， 无红肿等不 良反应 ， 证明研制的鸡新城疫 、 禽 流
鸡禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗免疫程序探讨
１６ 被调查 商品蛋鸡场 的调查方法 在 某一商 品蛋 ． 鸡场选 择 了 ３ 商 品蛋鸡 ， 流感 （ ＋Ｈ９ 二 价灭 批 禽 Ｈ５ ） 活疫 苗只免疫过 ２次 ， 首免 时间为 １ ～１ ４ ７日龄 ， 免 二
时间为 ９ ～Ｉ ０Ｅ龄 ； ０ １ ｌ 每批 为 ３０ ０ ５０ ０只 ， 品 ０ ０ 商
１ ５ 抗 体 效 价 检 测 按 《 ． 中华 人 民共 和 国 国 家 标 准一 高致 病性 禽 流感 诊 断技 术 ＞ ／ ８ ３ —０ ３ 规 ＞ ＧＢ ＴＩ ９ ６２ ０ ）
中， 我们发 现 ， 少部 分蛋鸡 场 的商 品蛋鸡 一个 饲养 周 期 只注射 过 ２次禽 流 感 （ ＋ Ｈ９ 二 价灭 活疫 苗 ， Ｈ５ ） 但在 商 品蛋鸡 淘汰 时 （４ ５ ０日龄 左 右 ） 血检 测 禽 流 采 感 Ｈ５亚 型和 Ｈ９亚 型 病 毒 免 疫 抗 体 效 价 ， 体 合 抗 格 率 （ ５ｏ 还 在 ９ 以上 。 目前 商 品蛋 鸡 场 疫 ≥ ｌｇ ） Ｏ 苗 防疫种 类 繁 多 ， 果 单 用 禽 流感 Ｈ５ Ｈ９单 价 灭 如 、 活 疫苗 免疫 商 品蛋鸡 ， 个饲 养 周 期 禽 流感 疫 苗 就 一 得 注射 ６ ～８针 。对 此 ， 们用 禽 流 感 （ ＋ Ｈ９ 二 我 Ｈ５ ） 价 灭 活疫苗 分别 对两 组商 品蛋 鸡 １ 性免 疫 和 ２ 次 次 性 免疫 注射 后 ， 期 采 血 进 行 ＨＩ 体 效 价 跟 踪 检 定 抗 测 ； 对 只做 ２次 禽 流 感 （ ＋ Ｈ９ 二 价灭 活 疫 苗 并 Ｈ５ ） 的一个 商 品蛋鸡 场 的三批 蛋鸡 作 了禽流感 免疫 抗体
效 价 和禽 流感病 毒抗 原快 速检 测 的调查 。旨在 探 索
一
定 的操作 规 范 进 行 血 凝 试 验 、 凝 抑 制 试 验 （ — 血 ＨＡ ＨＩ检测 Ｈ５亚型 和 Ｈ９ 型禽 流感 抗体 效 价 ， ） 亚 每 组 求取抗 体 效价 平 均 值 ， 制 坐标 图 （ 图 １ 。 Ａ 绘 见 ） 组 测致 平 均 抗 体 效 价 ＜ ５ ｌｇ ， ｏ 。 Ｂ组 测 致 ５ １日龄 ４ （ 老鸡 淘汰 ） 。试 验结束 。
禽流感灭活疫苗(H9)不同注射部位免疫效果的比较
组 高０５ ２０ ． ．个滴度 ，Ｂ、Ｃ、Ｄ组抗体 水平 比较稳 定 ，均 ～ 匀度 也较好 。 ３ 讨论 通过４ 日龄 、９ 日龄２ ５ ５ 次禽流感灭活疫苗 的免疫，由
（ ） 高致 病性 禽流感 诊断技 术 》中华人 民共 和 国国家 ＨＩ （《
标 准ＧＢＴ １９ ６２ ０ ） ／ ８ ３ —０ ３。
疫 途 径 随 机 分 为 Ａ、 Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ ５ ， 每 组 １ ０ 。Ａ组 组 ２只 为 空 白对 照 、 Ｂ组 为 颈 部 皮 下 注 射 、 Ｃ组 为 胸 部 肌 肉 注 射 、Ｄ组 为 翅 根 部 肌 肉注 射 、Ｅ 为腿 部 肌 肉注 射 。在 ４ 组 ５
收速 度 比皮下注 射快 ，产生抗 体 也较快 ，而皮 下注 射 ， 疫 苗吸 收 缓慢 而均 匀 ，产 生 抗体 比较 慢 ；５ — ２ ７ ７ 日龄 ， Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ 组抗体水平基本 一致 ，抗体 曲线变化相吻合
中图分类号 ：￥ ５ ． ２ ８ ２５
禽 流 感 （ ｉｎ Ｉｆ ｅｚ ，ＡＩ是 由Ａ型 流 感 病 毒 （ Ｉ Ａｖａ ｎ ｕ ｎａ ｌ ） Ａ Ｖ）
引起 的一种 禽类 急性传 染性疾 病 。禽类 感染后 表现 为呼 吸道症 状 、食欲减 少 、急性 高度致 死性 的全 身性疾 病等
且 抗 体 水 平 一 直 维 持 在 ６ｏ ２ １ｇ 以上 ； ７ ２日龄 以后 ， Ｅ （ 组 腿 部 肌 肉注 射 ） 体 滴 度 平均 值 最 高 ， 且Ｅ 抗 体 滴 度 较 其 他 抗 组
日龄 、９ 日龄分别 注射禽流感灭 活疫苗（ ９０ 。试验 ５ Ｈ ）． ｍｌ ５ 在 相 同的环境 下 ，采用 同种饲 料进 行饲喂 ，同一免疫 程 序 （ １进 行免疫 预防 ，每隔３ 随机选 取１ 只鸡 翅静 脉采 表 ） ｄ ５ 血 ，分 离血清 ，根据 Ｈ 法检测 鸡只 的抗体 水平 ，根据 平 Ｉ 均 值绘制抗体消减 曲线 。 １ 抗 体 水 平 检 测 采 用 血 凝 （ Ａ） 血 凝 抑 制 试 验 ． ４ Ｈ 与
鸡禽流感h5、h7和h9抗体水平合格率检测
畜 牧 兽 医2020年第11期新农民鸡禽流感H5、H7和H9抗体水平合格率检测熊 鑫（安徽省宁国市农业农村局，安徽 宁国 242300）摘要：本试验为了检测宁国市某养殖场屠宰环节中经疫苗免疫后的鸡祖代及父母代禽流感H5、H7和H9抗体水平合格率。
通过血凝试验分别对H5、H7和H9抗原进行倍比稀释，测得四倍抗原，根据稀释倍数制备抗原稀释液。
通过血凝抑制试通过验将血清从第1孔倍比稀释到第5孔，第6孔倍比稀释到第10孔，其中每排第11孔为阳性对照，第12孔为阴性对照。
先加入抗原稀释液振荡混匀后置于在37℃充分反应，再加入1%红细胞悬液振荡混匀后置于在37℃充分反应，进行读数。
关键词：禽流感；抗体水平；血凝试验；血凝抑制试验1 试验方法1.1 样本制备①于屠宰环节随机选取某养殖场鸡祖代（80周龄）及父母代（48周龄）各50只；②通过翅静脉采集血液，于37℃放置2h；③取上清液在1800r/min条件下离心2～3min，用移液器吸取上层清液（即为血清）于新的离心管中；④进行编号标记后于-20℃保存。
1.2 制备1%鸡红细胞悬液①注射器吸取适量阿氏液，通过翅静脉采集健康公鸡血液；②于1500r/min条件下离心8～10分钟，用移液器尽可能吸净上层清液弃去；③加入生理盐水通过称量配平后，用移液器重复吹打使悬液充分混匀；④重复②③步骤3～5次；⑤离心后将上层清液弃掉，用生理盐水配成1%红细胞悬液，置于4℃保存备用。
1.3 HA试验①取1块96孔V型微量反应板水平放置于实验台，进行标记；②分别选取6排，其中每2排为重复操作，第1～12孔分别加入25μL生理盐水；③分别于相应标记的第1孔加入H5、H7和H9抗原25μL，倍比稀释至第11孔，弃去枪头内液体；④6排的每孔加入25μL生理盐水；⑤6排的每孔加入配制好的25μL 1%红细胞悬液，振荡混匀后于37℃恒温箱内反应15～20分钟；⑥观察结果，获得抗原血凝效价，制备抗原稀释液。
禽流感病毒(H9亚型)流行毒株的分离及初步鉴定
禽流感病毒(H9亚型)流行毒株的分离及初步鉴定李凤艳【摘要】对2013～2015年从各省养鸡场采集的口腔及泄殖腔拭子进行病毒分离,用血凝及血凝抑制试验初步鉴定出含H9亚型禽流感病毒的样品,对其进行纯化得到4株H9亚型禽流感病毒,用针对H9亚型禽流感病毒HA基因的特异性引物对分离株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段后进行测序分析,结果显示4个分离株经鉴定均为H9亚型禽流感病毒.对4个分离株的生物学特性进行研究,发现4株H9亚型禽流感病毒分离株均符合低致病禽流感病毒的特点.【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】6页(P11-16)【关键词】H9亚型禽流感病毒;分离鉴定;生物学特性【作者】李凤艳【作者单位】辽宁益康生物股份有限公司,辽宁辽阳111000【正文语种】中文【中图分类】S858.28禽流行性感冒，简称禽流感（Avian lnflucnza，AI），是由正黏病毒科（Orthomyxoviridae）、流感病毒属、A型流感病毒所引起的一种禽类传染病，OIE根据对家禽所造成的疾病程度，禽流感被分为高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）和低致病性禽流感病毒（lowlypathogenic avian influenza virus， LPAIV）。
H9亚型AIV属于LPAIV，是家禽中最常见的病毒之一。
H9N2亚型AIV最早于1966年从火鸡体内分离到[1]。
此后H9亚型的禽流感病毒也从许国国家的家禽和水禽中分离到[2]。
H9N2亚型AIV在我国广泛存在，且多呈低致病性感染，并呈逐渐蔓延之势[3]。
多数携带该病毒的野禽、水禽、家禽并不表现出临床症状或仅表现轻微临床症状，一旦出现临床症状多表现为呼吸系统症状、蛋鸡产蛋下降、肉鸡生长迟缓等，是影响我国养禽业发展的重要病原。
因此，关注H9N2亚型AIV的研究具有普遍的公共卫生意义。
禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立
禽流感（avian influenza ，AI ）是由正粘病毒科、流感病毒属A 型流感病毒引起的禽类（家禽或野禽，以及部分哺乳动物）传染病[1]。
禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疫病。
尤其是高致病性禽流感，是OIE 规定的法定报告A 类动物疫病[2]。
禽流感病毒在流行的过程中不断变异，跨越宿主屏障，H5N1亚型禽流感病毒和H7N9亚型禽流感病毒屡次暴发疫情，给养禽业和人类的生命安全带来巨大的威胁。
H9亚型禽流感病毒并未被规定为高致病性禽流感，往往被人们所忽视，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。
此外，有研究显示H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产生新型禽流感病毒[3,4]。
目前国内外检测禽流感病毒最常用和经典的方法是鸡胚病毒分离，并且是国际贸易中指定的检测方法，但该方法技术要求高、耗费时间长，在疫情暴发时不利于病原的快速诊断和疫情控制。
以分子生物学技术为基础的荧光PCR 方法已成为病原核酸检测的主要方法，目前市场的禽流感病毒检测手段多以单重RT-PCR 为主，不能区分具体亚型，但在平时疫情检测和实施扑灭措施时对这些病毒亚型进行快速检测和定型非常重要。
本研究基于Taq-Man-MGB 荧光RT-PCR 技术建立一种禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法，能够在一次反应中对样本中的病毒进行快速定型，满足准确、快速的检测需求。
1材料与方法1.1质粒样品携带禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型HA2靶基因序列片段重组质粒pUC57-AIV-H579，浓度为104copies/μL 。
1.2禽流感病毒核酸样品禽流感病毒H5亚型核酸样品15份、禽流感病毒H7亚型核酸样品15份、禽流感病毒H9亚型核酸样品15份，禽流感病毒阴性核酸样本30份，由扬州大学禽流感病毒专业实验室分离、鉴定、保存和提供。
禽流感(H9)四联灭活疫苗研制成功
禽 感ｌ９ 联 疫苗 制成 流 （ ） 灭着 研 功 Ｈ四
洛 阳 普 莱 特 生 物 Ｔ 程 有 限 公 司研 制 的 禽 流 感 （ 。 四 联 Ｈ） 灭 活 疫 苗 近 日取 得 中 华 人 民共 和 国新 兽 药 注 册 证 书 ， 获 得 并 农业 部批 准上 市 。 禽 流 感 （ 。 四联 灭 活疫 苗是 河 南 省 “ Ｈ） 十一
（ 自中 国饲 料 工业 信 息 网 ） 摘
木 木 木 木 木 木 木 木 木 术 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木 木
、
两 年 来 人 力 成 本 的 提 高 ，很 多 散 养 户 退 出 ，这 将 促 使
２０ ０ ８年 以 及 今 后 浓 缩 料 产 量 将 会 进 一 步 下 降 ， 外 ． 粕 价 另 豆 格 等 原料 价 格 的 高 位 运 行 也 会 促 使 浓 缩 饲 料 的 萎 缩 。 同时 ，
维普资讯
兽 与 料 加 ２８ 第３第 期 药 饲 添 剂 ０ 年 ／ ３ ０ 卷
镑冀辩
未 来 中 国 ６ ￣． 料 ＼ 缩 料 和 ５ ｉ合 －ｅ 浓 在安徽启秘 预 混 料 结 构 将 有 较 大 调 整
北 京 市 饲 料 工 业 协 会 五 届 二 次 年 会 暨 饲 料 行 业 发 展 研 讨 会 日前 在 九华 山 庄 胜利 召 开 。 中 国 农 业 科 学 院 饲 料 研 究 所 技术 转 移 中 心 罗 发 洪 主任 在会 上作 了 “ ０ ８年 畜 牧 饲 料 ２０
行业发展趋势” 的主 题 报 告 。他 以近 年 我 国 中小 型饲 料 企 业
畜禽 Байду номын сангаас
禽流感病毒通用型检测卡说明书(完整版)
禽流感病毒通用型检测卡使用说明书【原理】禽流感病毒检测卡以双抗体夹心法为基础，采用免疫层析金标记技术，快速检测禽流感病毒，本检测卡检测禽流感H5型、禽流感H7型和禽流感H9型，为禽流感通用型检测卡。
【试剂组成】1. 禽流感病毒快速检测卡40片/盒2. 样本稀释液40管/盒3．棉签40支/盒【操作方法】一、样品制备：1.本检测卡采集样品为眼、气管分泌物、肛门分泌物。
将棉签插入分泌物最多的部位，轻轻摇动棉签，让棉签充分吸收分泌物。
2.将棉签在稀释液中充分搅拌并反复挤压试管壁，让分泌物充分溶解到稀释液中，得到待检样品。
3.样品一般须当即进行检测，否则应冷藏保存，超过24小时的，应该冷冻保存。
二、操作步骤：1. 使用前将试剂盒和样品恢复至室温。
2. 将棉签浸入装有样品稀释液的试管，充分搅拌混匀后，用一次性滴管取上清液。
3. 取出检测卡，开封后平放于桌面上，从滴管中缓慢而准确地逐滴加入2–3滴混合液。
4. 加样品液后，约30秒内，红色的液体从靠样品孔的观察窗边缘涌出。
朝另一方向流动。
5. 5分钟时判断结果，超过10分钟的结果无效。
【结果判定】1. 阳性：在观察孔内，若对照线显色，检测线同时显色，判为阳性。
2. 阴性：在观察孔内，若对照线显色，而检测线不显色，判为阴性。
3. 无效：在观察孔内，若对照线不显色，则结果无效，建议重新测试。
【检测方法的局限性】1. 检测线红色线条的颜色深浅直接与检测物质多少相关。
当检测物质含量很高时，检测线可能在出现后，红色又慢慢变淡，此时建议将样品数倍稀释后再进行检测，红色线条就可以稳定了。
2. 当检测线出现模糊的色迹，但不显示为清楚的线形时，判为阴性。
3. 本试剂是定性筛选试剂，一个明确的临床诊断结果应该由医生在考虑到所有的临床和实验室的现象后作出。
【注意事项】1. 本品如果购买时发现过期、破损、污染、无效的产品，请在购买处进行更换。
2. 测试样品来自动物，可能有潜在感染性，样品和使用过的试剂应被看作微生物危险品处理。
H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)说明书
H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书【产品名称】通用名称：H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）英文名称：Detection Kit for Avian Influenza Virus Subtype H7N9 RNA (PCR-Fluorescence Probing)【包装规格】大包装，48反应/盒【预期用途】流感病毒可分为甲（Ａ）、乙（Ｂ）、丙（Ｃ）三型。
其中，甲型流感依据流感病毒血凝素蛋白（HA）的不同可分为1-16种亚型，根据病毒神经氨酸酶蛋白（NA）的不同可分为1-9种亚型，HA不同亚型可以与NA的不同亚型相互组合形成不同的流感病毒。
而禽类特别是水禽是所有这些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一种。
H7N9流感病毒既可以感染禽类，也可以感染人。
人感染H7N9禽流感会出现严重肺炎，症状包括发烧、咳嗽、呼吸困难等。
本试剂盒适用于检测呼吸道样本、血清、肺组织等样本中H7N9禽流感病毒RNA，可用于该病毒感染的实验室诊断和宿主动物的监控。
检测结果仅供研究，不用于临床诊断。
【检验原理】本试剂盒基于实时荧光PCR技术，分别选取H7N9禽流感病毒的HA 基因和NA基因保守区作为扩增靶区域，设计特异性引物探针，通过一步法实时荧光PCR体系扩增对H7N9禽流感病毒进行定性检测。
反应体系中除特异性引物和特异性荧光探针外，还配以对应的PCR反应Buffer、逆转录酶、Hot-Start Taq酶、核苷酸单体（dNTPs）、Mg2+等成分，可实现对H7N9禽流感病毒核酸灵敏特异地检测。
【主要组成成分】【储存条件及有效期】保存于-20±5℃，反复冻融次数＜5次，有效期9个月。
【适用仪器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等荧光定量PCR 仪。
【样本要求】1 适用样本类型：呼吸道样本、血清、肺组织。
2 样品采集、保存与运送。
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禽流感H9病毒快速检测卡（胶体金法）
使用说明书
【产品名称】
通用名称：禽流感H9病毒快速检测卡（胶体金法）
英文名称：Aivan Influenza Virus H9 Antigen Rapid Test Card
【包装规格】
1份/袋，40份/盒
【原理】
禽流感H9病毒检测卡以双抗体夹心法为基础，采用免疫层析金标记技术，快速检测禽流感H9抗原。
【主要组成成份】
1 禽流感H9病毒检测卡40 套
2 棉签40 支
3 样品稀释液40 瓶
4 一次性卫生手套
5 双
5 使用说明书 1 份
【操作方法】
一、样品准备
1．本检测卡采集样品为眼、气管或泄殖腔分泌物。
将棉签插入分泌物最多的部位，轻轻摇动棉签，让棉签充分吸收分泌物。
2．将棉签在稀释液中充分搅拌并反复挤压试管壁，让分泌物充分溶解到稀释液中，得到待检样品。
3．样品一般须当即进行检测，否则应冷藏保存，超过24小时的，应该冷冻保存。
二、操作步骤
1. 如试剂或已采集的待检样品冷藏保存，使用前先恢复到室温。
2. 取出检测卡，开封后平放于桌面上，用一次性滴管取所采集的待检样品上清液，缓慢而准确地逐滴加
入滴液体到加样孔。
3. 加样品液后，约30秒内，红色的液体从靠样品孔的观察窗边缘涌出。
朝另一方向流动。
5分钟时判断
结果，超过30分钟的结果判读无效。
【结果判定】
1.阳性：在观察孔内，若对照线显色，检测线同时显色，判为阳性（如图一、图二），阳性结果表明检测液
中含有禽流感H9病毒。
2.阴性：在观察孔内，若对照线显色，而检测线不显色，判为阴性（如图三）。
阴性结果表明检测液中不含
禽流感H9病毒。
3.无效：在观察孔内，若对照线不显色，则结果无效，建议重新测试（如图四、图五）。
【产品性能】
特异性：与乙型流感病毒、新城疫病毒无交叉反应。
精密性：同批次产品在相同样品浓度下测定，反应结果一致，显色均一。
【注意事项】
1. 本品如果购买时发现过期、破损、污染、无效的产品，请在购买处进行更换。
2. 检测样品可能有潜在感染性，样品和使用过的试剂应被看作微生物危险品处理。
3. 所有检测卡启封后1小时内使用，此前不要随意打开。
4. 本品为一次性产品，请勿二次使用；请勿使用非本品随附的稀释液。
【储存条件及有效期】
保存于干燥阴凉处（2~30℃），有效期见包装。