南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。

GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。

1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

实验一质粒DNA的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法：碱裂解法。

该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比较方便、省时，提取的质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。

二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。

迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA 分子，分子量范围从1kb到200kb。

质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。

绿色荧光蛋白GF基因的克隆表达和粗提取

绿色荧光蛋白G F基因的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。

1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。

1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1]GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测；④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。

绿色荧光蛋白的克隆实验汇报.

6、重组DNA的鉴定
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验原理：
在PH为12.6的碱性环境下，利用细菌染色体完全变性而质粒DNA为完全分离的性质，再将溶液PH调至中性，质粒DNA恢复原状，细菌线性DNA变为沉淀而除去
1、含目的基因质粒DNA的提取
实验步骤：
1. 收集细胞
2. 悬浮细胞
1.5mL 菌液12000rpm 菌体沉淀 250μl 剧烈震荡
实验原理：
转化技术的关键在于制备感受态细胞，本实验是利用CaCl2转化法，细菌在低温，低渗的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失去细胞壁，外来DNA可形成粘合物黏附在细胞表面，经过42℃短暂热冲击，使DNA复合物进入细胞。
4、重组DNA的转化
热
实验步骤：
激
感受态细菌 100 l
＋
连接产物混匀 10 l 冰浴中30分钟
它的这一些性质为生物学研究提供了很好的标记分子，可以在黑暗的显微镜视场中观察到细胞中的细胞器等结构，而且还能够标记活细胞，使得活细胞中结构的观察成为可能。
绿色荧光蛋白简介
下村修
马丁·沙尔菲
钱永健
他们因为在研究绿色荧光蛋白方面所作的贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖
实验目的
掌握绿色荧光蛋白的基因克隆的一般步骤，加深对基因克隆的认识，如：
2、PCR扩增目的基因
实验步骤：
① 94℃预变性5分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒
56℃ 30 秒 30 循环 72℃ 1 分钟 ③ 72℃ 7 分钟 ④ 4 ℃ 保温实验过程约1小时50分钟
2、PCR扩增目的基因
电泳结果：
结果分析：
3、构建重组DNA

绿色荧光蛋白GF基因的克隆表达和粗提取

绿色荧光蛋白GF基因的克隆表达和粗提取绿色荧光蛋白G F基因的克隆表达和粗提取SANY标准化小组#QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。

1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。

1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1]GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测；④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳学创编

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP 基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的 E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取

绿色荧光蛋黑(GFP)基果的克隆、表黑战细提与之阳早格格创做北圆医科大教2011防止医教（卫死考验检疫）纲要脚法：钻研绿色荧光蛋黑（green fluorescent protein，GFP）基果正在大肠杆菌中的基果克隆与重组表黑，以及对于其举止细提与.要收：从E.coli DH5ɑ中用碱提与量粒的要收提与量粒pEGFP-N3战量粒pET-28a.而后用量粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对于已经提与的产品举止电泳，决定从大肠杆菌中乐成提与了量粒.再用节造性内切酶BamHI战NotI对于乐成提与的量粒举止酶切，并对于酶切后的量粒举止琼脂糖凝胶电泳，用以决定已经提与了GFP基果.将含有GFP基果的量粒变化到体验态夸大培植.用IPTG诱导GFP 基果表黑不妨瞅到浅绿色菌降.末尾对于绿色荧光蛋黑举止细提与.论断：本真验有帮于教死掌握最基础的分子死物教真验技能，为进一步的真验奠定前提.关键词汇：绿色荧光蛋黑基果克谨慎组表黑变化细提与目录1 序止32 真验脚法43 真验设备44 资料及试剂55 真验支配步调55.1支配过程55.2量粒DNA的分散与杂化65.2.1 量粒的培植65.2.2 量粒的DNA的碱提与法65.2.3 量粒DNA的审定与杂化75.3酶切及连交85.3.1 单酶切85.3.2 回支酶切产品（采与DNA回支试剂盒举止回支）8 5.3.3 连交95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体战固体培植基的配造（参照附录）95.4.2．体验态细胞的造备 (CaCl2法)95.4.3 变化涂板105.5GFP蛋黑的诱导表黑105.6绿色荧光蛋黑的细提与11参照文件11附录121LB培植基的配造：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE慢冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样慢冲液139．PEGFP-N3量粒齐图谱1310．P ET-28A量粒齐图谱141 序止绿色荧光蛋黑（green fluorescent protein，GFP）是一类存留于包罗火母、火螅战珊瑚等腔肠动物体内的死物收光蛋黑.当受到紫中或者蓝光激励时，GFP 收射绿色荧光.它爆收荧光无需底物或者辅果子收色团是其蛋黑量一级序列固有的.1962 年，下村建仄分散杂化了火母中收光蛋黑火母素，并创造一种绿色的荧光蛋黑.1974年，他们分散得到了那个蛋黑，当时称绿色蛋黑，以去称绿色荧光蛋黑(GFP)[1]GFP 动做一种新的报告基果，其便宜正在于①荧光强度下，宁静性下；②GFP 分子量小，易于混同，适用于多种变化办法，对于受体无毒害，仄安稳当；③出有需要反应底物与其余辅帮果子，受蓝光激励爆收绿色荧光，更加适用于体内的坐即检测；④GFP 出有具备种属依好性，正在多种本核战真核死物细胞中皆表黑；⑤通过替换一些特殊氨基酸，不妨使之爆收分歧颜色的光，进而符合分歧的钻研需要.连年去广大用于基果的表黑与调控、蛋黑量的定位、变化以及相互效用、旗号传播、转染与变化，以及细胞的分散与杂化等钻研范围[ 2～3].采与GFP 动做标记表记标帜基果，可曲交支集变化细胞供真验，支缩了筛选时间、缩小对于细胞活性的效用并可动做活体标记表记标帜，为钻研收育的基果调控战分子体造提供了一种简净灵验的脚法[ 4、5 ].采与基果工程脚法死产GFP标记表记标帜的要收，可建坐一种烦琐、赶快的免疫诊疗技能[6].量粒变化加进大肠杆菌（Escherichia coli）体验态细胞是分子克隆的关键步调[7]，是基果克隆以及DNA文库建坐等钻研中一项要害的惯例支配.暂时，体验态细胞的造备主要采与CaCl2法，该要收支配简朴、简单掌握、重复性佳、变化率下，可广大应用于普遍的真验室.其本理是Ca2+ 损害细胞膜上的脂量阵列，并与膜上多散羟基丁酸化合物、多散无机磷酸产死复合物以好处中源DNA的渗进[8].大肠杆菌是第一个用于重组蛋黑死产的宿主菌，它出有但是具备遗传背景收会、培植支配简朴、变化战转导效用下、死少繁殖快、成本矮廉、不妨赶快大规模天死产脚法蛋黑等便宜[9].而且其表黑中源基果产品的火仄近下于其余基果表黑系统，表黑的脚法蛋黑量以至能超出细菌中蛋黑量的30%，果此大肠杆菌是暂时应用最广大的蛋黑量表黑系统[10].大肠杆菌表黑系统是暂时最时常使用的中源蛋黑表黑系统,大肠杆菌由于遗传背景收会、易支配,以及有洪量可供采用的克隆或者表黑载体,使之成为人们克隆表黑中源基果的主要菌株[11].随着科研的收达，建坐出了多种具备分歧特性的表黑载体战工程菌株，以谦脚表黑分歧本量、央供的脚法基果的需要.正在本核细胞中表黑蛋黑量的载体时常使用开用子有T7开用子、Trp开用子-色氨酸开用子、Tac开用子、T7噬菌体中基果10 的开用子及Lac开用子等.Lac开用子受收会代开系统活化蛋黑战cAMP的正调控战阻拦物的背调控，当加进乳糖或者某些类似物IPTG可与阻拦蛋黑产死复合物，使阻拦蛋黑构型改变，阻拦蛋黑出有再能与把持基果分散，进而使结构基果表黑.根据本核死物基果表黑特性采用载体举止脚法基果克隆，而后转进相映的菌种中表黑脚法蛋黑量[12].钻研绿色荧光蛋黑正在大肠杆菌体内的基果克隆战表黑.通过量粒重组产死所需要的重组量粒pET-28a-GFP，将重组量粒导进大肠杆菌体内，通过酶切及用IPTG诱导检测是可正在大肠杆菌体内诱导表完毕功.根据电泳截止及荧光局里得出论断，重组量粒正在大肠杆菌体内乐成诱导表黑.2 真验脚法教会绿色荧光蛋黑基果表黑载体的建坐及正在大肠杆菌中的表黑所有历程中的每一步，掌握其要收.本真验是通过基果工程脚法对于脚法基果EGFP举止克隆，并举止EGFP表黑载体的建坐，并正在大肠杆菌中诱导表黑，赢得GFP蛋黑.①教会最时常使用的小量造备量粒DNA的碱裂解要收②教会时常使用的DNA琼脂糖凝胶电泳技能③教会用节造性内切酶切割DNA④教会用琼脂糖凝胶中回支DNA片段⑤教会DNA片段的体中连交技能⑥教会用CaCl2法治备大肠杆菌体验态细胞⑦教会用量粒DNA变化体验态受体菌的基础支配技能⑧教会用酶切法筛选重组量粒变化乐成的克隆菌⑨相识中源基果正在本核细胞中表黑的特性战IPTG诱导表黑的要收⑩教习SDS-PAGE 胶的基础灌造要收战用SDS-PAGE 检测表黑蛋黑3 真验设备恒温培植箱，超净台，恒温摇床，造冰机，台式离心机，核酸电泳仪，小型混同器，冰箱，蓝盾可睹光透射仪，移液器、电泳槽、振荡器、造冰机、凝胶成像仪，火浴锅，下压灭菌锅、振荡培植箱，脚持式紫中灯.4 资料及试剂BamH I ；NotI(10U/μL)；T4 ligase ；LB 培植基；溶液Ⅰ；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；TE 慢冲液；20×TBE ；GeneFinder-溴酚蓝上样慢冲液.5 真验支配步调5.1 支配过程量粒提与量粒提与酶切回支酶切回支连交图一过程图5.2 量粒DNA的分散与杂化5.2.1 量粒的培植1）正在含有pEGFP－N3量粒的DH5α仄板上菌降上挑与菌种，置于含有5mL LB培植基的试管中.摇摆过夜.2）有pET-28a量粒的仄板上挑与单菌降于其余一个试管中，共样摇荡培植过夜.5.2.2 量粒的DNA的碱提与法1）与1.5ml DH5α培植液倒进1.5mL eppendorf 管（微量离心管）中, 13000rpm离心1min.2）重复1.3）弃上浑,将管倒置于卫死纸上数分钟,使液体流尽.4）菌体重淀重悬浮于100μL溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下搁置10min.5）加进新配造的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管心，赶快温战颠倒eppendorf 管5次,以混匀真量物(千万出有要振荡),冰浴5min.6）加进150μL预热的溶液Ⅲ,盖紧管心，并倒置离心管，温战振荡3次,使重淀混匀,冰浴中15分钟,13000rpm离心5min.7）上浑液移进搞净eppendorf 管中,加进等体积的氯仿/同戊醇(24：1),振荡混匀, 13000rpm离心2min.8）将火相移进搞净eppendorf 管中,加进等体积的氯仿/同戊醇(24：1)振荡混匀, 13000rpm离心2min.9）将火相移进搞净eppendorf 管中,加进2 倍体积的无火乙醇,振荡混匀后，置于室温下2min，而后13000rpm离心5min.10）弃上浑,将管心关关倒置于卫死纸上使所有液体流出,加进1mL 70％乙醇洗重淀一次, 振荡混匀后，13000rpm离心5min.11）吸除上浑液,将管倒置于卫死纸上使液体流尽,室温搞燥.12）将重淀溶于30μL TE慢冲液(pH8.0，含20μg/mL RNaseA)中，保存正在-20℃冰箱中.13）依照共样的过程战要收将pET-28a的量粒也提出去，保存正在-20℃冰箱中.5.2.3 量粒DNA的审定与杂化1)1%琼脂糖凝胶的配造①加20ml 1×TBE慢冲液于三角瓶中，②透彻称与0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至真足熔化，③热却至60℃安排，2)琼脂糖凝胶电泳①沉慢倒进启佳二端战加上梳子的电泳胶板中，静置热却30分钟以上，②将胶板与消启胶戴，搁进电泳慢冲液（TBE）中，使电泳慢冲液刚刚佳出过凝胶约1mm，沉沉革除梳子，③与5μl量粒DNA及2μl GeneFinder混匀上样⑤蓝盾可睹光透射仪瞅察截止.3)回支产品①用搞净的刀片将需要的DNA条戴从凝胶上切下去，称与重量.②以0.1g凝胶对于应300μL的体积加进PN.③50℃火浴搁置10min，功夫出有竭温战上下翻动离心管至胶真足融解.④将上一步得到的溶液加进到一个吸附柱中，吸附柱再搁进支集管，13000rpm离心60s，弃掉兴液.⑤加进800μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉兴液.⑥加进500μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉兴液.⑦将离心吸附柱搁回支集管，13000rpm离心2min.⑧与出吸附柱，搁进一个搞净的离心管中，正在吸附膜的中间位子加进适量洗脱慢冲液EB 30μL，洗脱慢冲液先正在65℃火浴预热，室温搁置2min，13000rpm离心1min，而后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm离心1min.⑨置于－20℃保存.5.3 酶切及连交5.3.1 单酶切按如下单酶切体系（30μL）混同:表1 单酶切体系的配造反应物（μL）pEGFP-N3 pET-28a量粒1818BamH I 2 2Not I 2 210×buffer K 3 30.1%BSA慢冲液 3 3灭菌单蒸火至 30ul体系1)离心10s，混匀.2)37℃火浴酶切3-4h.3)配造1.0%（M/V）一般琼脂糖凝胶30ml.4)适合搁置热却，45℃安排倒于电泳胶板上，插佳梳子.5)待凝胶凝固佳以去，拨下梳子.6)酶切样品中加进5µl溴酚蓝-GeneFinder混同液混匀，上样.7)1×TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下电泳30min.8)荧光激励器瞅察量粒DNA条戴的酶切情况，并照像.5.3.2 回支酶切产品（采与DNA回支试剂盒举止回支）1)配30mL 1％进心琼脂糖凝胶，尽管少一些（用细梳子），对于酶切产品举止电泳分散；2)将酶切产品局部加进加样孔中3)跑胶，瞅察截止，而且拍照.4)用搞净的刀片将需要的DNA条戴从凝胶上切下去，称与重量.5)以0.1g凝胶对于应300μL的体积加进PN.6)50℃火浴搁置10min，功夫出有竭温战上下翻动离心管至胶真足融解.7)将上一步得到的溶液加进到一个吸附柱中，吸附柱再搁进支集管，13000rpm离心60s，弃掉兴液.8)加进800μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉兴液.9)加进500μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉兴液.10)将离心吸附柱搁回支集管，13000rpm离心2min.11)与出吸附柱，搁进一个搞净的离心管中，正在吸附膜的中间位子加进适量洗脱慢冲液EB 30μL，洗脱慢冲液先正在65℃火浴预热，室温搁置2min，13000rpm离心1min，而后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm离心1min.12)置于－20℃保存.5.3.3 连交依照连交体系举止，16℃连交过夜.表2 连交体系反应物体积/μL回支杂化的pET-28a量粒5gfp基果片段12T4连交酶 1慢冲液（10×） 25.4.1 LB（Luria-Bertain）液体战固体培植基的配造（参照附录）氨苄青霉素战卡那霉素等抗死素出有抗热，如果培植基温度过下，简单引导抗死素做兴，应使培植基降温至60℃安排后，再加进抗死素.但是也出有该使培植基的温度过矮，可则简单出现气泡.75mm曲径的培植皿约需15ml培植基.5.4.2．体验态细胞的造备 (CaCl2法)1)挑一大肠杆菌单菌降搁进3ml LB液体培植基（含Kan+），37℃培植过夜.2)活化大肠杆菌：与3ml新陈的LB液体培植基加进50-150μl的过夜菌，培植2-3个小时.3)将昨夜摇出去的DH5α或者BL21培植液转进离心管中,冰上搁置10min,而后于4℃下4000rpm离心5min.4)弃去上浑,用预热的0.1mol/L 的CaCl2溶液600μL沉沉悬浮细胞,冰上搁置20min, 4℃下4000rpm离心5min.5)弃去上浑,加进300μL预热的0.1mol/L的CaCl2溶液,沉沉悬浮细胞,冰上搁置5min,即成体验态细胞悬液，可-80℃少久保存.5.4.3 变化涂板1) 与2个无菌离心管，分别加进100μL BL21体验态细胞悬液，第1管加5μl 无菌火，第2管加进量粒DNA 溶液5μl,沉沉摇匀,冰上搁置30min.2)42℃火浴中热激90s,热激后赶快置于冰上热却5min. 3) 分别背管中加进100μL LB 液体培植基,混匀后正在37℃振荡培植30min.4) 从管1中与50μL 涂布于含抗死素战出有含抗死素的仄板上,从管2中与50μL 战100μL 涂布于含抗死素的仄板上.正里进与搁置约10分钟,待菌液真足被培植基吸支后倒置培植皿,37℃培植20小时.图2 变化涂板模式图5.5 GFP 蛋黑的诱导表黑1)与阳性克隆量粒DNA 变化BL21； 2)正在含有Kan ＋的固体培植基上，37℃培植20h ； 3)挑与单菌降，37℃振荡培植过夜； 4) 与4支无菌戴盖试管，加进新陈LB 液体培植基（含有Kan 管1 管1 管2 管250μL 50μL 50μL 100μL＋）5ml，按1：20密释比率加进过夜菌，37℃培植至死少久,约2-3小时.5)加进IPTG（1：1000）至末浓度1mmol/L，分别诱导0h，1h，2h，4h.6)分别与1.5ml，10000rpm离心5min，去除上浑，支集重淀，再重复一次支集重淀.7)分别与IPTG诱导培植液20μl涂布正在含Kan＋的固体培植基上，37℃培植20小时.8)瞅察蛋黑表黑：用紫中线映照菌体重淀及培植仄板，不妨瞅到绿色荧光.分别对于匀称涂布的仄板以及表黑蛋黑的样品管照相，保存照片.5.6 绿色荧光蛋黑的细提与1)挑与上述审定透彻的单菌降交进5 mL 液体LB 培植基( 含50μg/mL 卡那霉素) , 37 ℃振荡培植过夜,2)将过夜培植菌以1: 500 体积比交种进新的LB 液体培植基夸大培植, 37 ℃培植1 h 后, 加进0.1 mmol/L IPTG 诱导表黑3 h.3)将上述诱导表黑菌液4 ℃、5 000×g 离心10 min 支集菌体,4)用提与慢冲液(2 mmol/L Tris, pH 8.0, 0.5 mmol/L PMSF,0.2mmol/L NaN3)洗涤菌体一遍,5)将菌体超声破碎( 50 %功率, 超声20 s, 共20 次,二次超声隔断40 s) 后, 10 000 ×g离心20 min.6)与离心后的上浑，即为细提与绿色荧光蛋黑.参照文件[1] Shimomura O,Johnson FH,Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, abioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea [J]. J Cell Como Physiok, 1962, 59: 223-239.[2] Kain SR,AdamsM, Kondepudi A, et al. Green fluorescent p rotein as a reporter of gene exp ression and p rotein localization. biotechniques, 1995, 19 (4) : 650[3] Phillip s GJ. Green fluorescent p rotein - a bright idea for the study of bacterial p rotein localization. FEMSmicrobial Lett, 2001, 204 (1) : 9[4] ChalfieM, Tu, EKivchen G, et al. Green fluorescent p rotein as a marker forgene exp ression. Science, 1994, 263(5148) : 802[5] ChalfieM. Green fluorescent p rotein. Photochem Photobiol, 1995, 62 (4) : 651[6] Larrick JW, Balint RF, Youvan DC. Green fluorescent protein: untapped potential in immunotechnology. Immunotechnology, 1995, 1 (2) : 83[7] 萨姆布鲁克 J，弗里偶 E F，曼僧阿蒂斯 T. 分子克隆真验指北[M]. 金冬雁，黎孟枫，译. 2版. 北京：科教出版，1995.[8] 杜祯, 马海利, 陈瑞芳.工程菌DH-5α体验态细胞的造备及量粒pGEM的变化钻研华夏畜牧兽医,2007 年第34卷第5期[9] Nuc P. Nuc K. Recombinant protein production in Escherichia coli[J].Postepy Biochem,2006,52 (4):448-456.[10] Dong X,Tang B,Li J,et al.Expression and Purification of Intact and Functional Soybean (Glycine max)Seed Ferritin Complex in Escherichia coli [J].J Microbiol Biotechnol,2008,18 (2):299-307. [11] 吕素芳，刘峥，郭广君，蔡永萍，邱德文大肠杆菌中表黑中源重组蛋黑的钻研[12] 魏秋黑，李毅主编本核细胞中中源基果的表黑战收端杂化，新颖分子死物教技能，下等培养出版社，2006.7:95-97附录1 LB培植基的配造：组成液体固体蛋黑胨（Trypton）10g10g酵母提与物（Yeast Extract）5g5gNaCl10g10g琼脂（Agar）15g蒸馏火定容至1000ml定容至1000ml2. 溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖25mM Tris-HCl（pH8.0）10mM EDTA3. 溶液Ⅱ（现用现配）：0.2N NaOH1% SDS（先加火，再加NaOH战SDS）4. 溶液Ⅲ（100ml）：5M KAc 60ml5. DNase-free RNase A：溶解RNase A于TE慢冲液中，浓度为10mg/ml，煮沸10-30min，与消DNase活性，-20℃贮存.6.TE慢冲液（pH8.0）[10mM Tris-HCl；1mM EDTA]的配造：药品称呼1M Tris-HCl（pH8.0）10ml1ml0.5M EDTA2mlddH2O定容至1000ml定容至100ml7. 20×TBE：216g Tris碱，110g硼酸，80ml 0.5M EDTA （pH8.0），定容至1000ml.8. GeneFinder-溴酚蓝上样慢冲液6×loading buffer：0.25%溴酚兰，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖火溶液.配造佳后不妨按50：1的比率密释GeneFinder.9．PEGFP-N3量粒齐图谱真验使用的EGFP蛋黑与自本核-真核脱梭量粒pEGFP-NB3B的蛋黑量编码序列.此量粒本本被安排于正在本核系统中举止扩删，并可正在真核哺乳动物细胞中举止表黑.真量粒主要包罗位于PCMV真核开用子与SV40 真核多散腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位面；一个由SV40 早期开用子开用的卡那霉素/新霉素抗性基果，以及上游的细菌开用子可开用正在本核系统中的复造与卡那抗性.正在EGFP编码序列上下游，存留特同的BamH I及Not I节造性内切酶位面，可切下整段EGFP编码序列.10．pET-28a量粒齐图谱表黑EGFP 蛋黑使用的pET-28 本核载体包罗有正在多克隆位面二侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表黑蛋黑的T7 开用子，T7 转录起初物以及T7 末止子；采用性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 开用子，以及为爆收单链DNA 产品的f1 开用子.。

南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆

绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。

本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。

关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆2015- ~实验日期实验地点2015-合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。

2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。

3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。

4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。

5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。

6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。

7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理1.pEGFP-N1质粒2.T载体三、材料与方法：1.实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程1.获取外源基因1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒离心1300r pm,1min瞬时离心漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀颠倒数次离心放置3-5min 13000rpm,1min离心13000rpm,1min2)取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O 6μl质粒DNA（pEGFP-N1）2μl引物GFP1 (10μM) 1μl引物GFP2 (10μM) 1μlPremix Taq 10μl总体积20μl加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳生创编

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳德创编

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP 基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB 培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳家百创编

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳家百（2021.03.07）南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

南方医科大学 GFP基因克隆

GFP基因克隆XXX XX级临床XXX XXXXXXXXX摘要:目的将所需的GFP基因片段转入特定的受体细胞——pMDTM18-T Vector中。

方法用“重组质粒的提取”实验将所需的GFP基因片段从相应的细胞质粒——pEGFP-N1中提取出来，用“PCR扩增实验”将获得的DNA片段在体外扩增，进行“PCR产物的TA克隆”实验将获得的DNA片段与T载体——pMDTM18-T Vector连接，进行“大肠杆菌感受态细胞的制备及转化”将重组DNA导入感受态细菌中，进行“阳性重组体的筛选”实验将含有GFP 基因的感受态细菌从蓝白菌落中筛选出来，最后进行酶切实验对重组DNA进行鉴定。

结果经电泳实验发现在最后所得的四组转基因菌液中一组转基因成功。

结论GFP基因能够转入特定的感受态细菌中。

关键词：DNA片段、PCR、TA克隆、T载体、大肠杆菌感受态细胞、蓝白斑筛选、限制性酶切绿色荧光蛋白（GFP）最早由Osamu shimomura于１９６２年在水母中发现，这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激光下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子相互作用。

GFP由２３８个氨基酸碱基组成，GFP序列中的６５－６７位残基可自发形成荧光发色集团——对羟基苯咪唑啉酮。

基因克隆是指在体外将不同来源的DNA分子进行切割、重新连接，组装成一个新的重组DNA分子。

然后将重组DNA导入宿主细胞中进行扩增，获得大量同一DNA分子并表达相应蛋白质的过程。

实现分子克隆所采用的方法与相关的工作统称为重组DNA技术，又称基因工程。

１.材料方法１. １菌种大肠杆菌DH5α由本研究室保存。

１.２试剂Premix Taq ®Version 2.0（用作PCR扩增实验）购自TaKaRa公司，pMDTM18-T Vector连接试剂盒购自TaKaRa公司，琼脂凝胶电泳试剂盒、10× M 酶切缓冲液、Hind III、Eco R I。

绿色荧光蛋白(GFP)基因地克隆、表达和粗提取

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (7)5.3.1 双酶切 (7)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (9)5.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (12)6.TE缓冲液（P H8.0） (12)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达

分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达陶成秋20杨晨20一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。

荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。

荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，共27kD，由238个氨基酸构成。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。

基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。

采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。

在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。

研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。

通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。

根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。

二、实验流程三、具体实验方案实验一、质粒DNA的提取1.实验原理：1）质粒(Plasmid)是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。

质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。

它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。

2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (8)5.3.1 双酶切 (8)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (9)5.4.2．感受态细胞的制备(CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (13)6.TE缓冲液（P H8.0） (13)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳语创编

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP 基因的质粒转化到感受态细胞 E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的 E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP 基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳地创编

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳文创编

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳法创编

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB 培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液13 9．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳物创编

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI 和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。