第九章_微生物与基因工程

第九章微生物与基因工程

计划学时：2

重点：基因工程的基本操作过程，基因工程的应用。

一、基因工程的发展历史

基因工程是在本世纪70年代初开始出现的。三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三项技术是：DNA的特异切割、DNA的分子克隆和DNA的快速测序。

早在50年代，阿尔伯（Arber）的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的噬菌体，60年代末进而证明大肠杆菌细胞内存在修饰–限制系统，即给宿主自身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬菌体DNA。1970年史密斯（Smith）等人从流感嗜血杆菌（Hemophilus influenzae）中分离出特异切割DNA的限制酶。次年，内森斯（Nathans）等人用该酶切割猴病毒SV40 DNA，最先绘制出DNA的限制图谱（restriction map）。1973年史密斯和内森斯提出修饰–限制酶的命名法。限制性核酸内切酶可用以在特定位点切割DNA，限制酶的发现使分离基因成为可能。为表彰上述科学家在发现和使用限制酶中的功绩，1978年的诺贝尔医学奖被授予阿尔伯、内森斯和史密斯。

1973年，科恩（Cohen）和博耶（Boyer）等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素和卡那霉素的抗性基因相融合，并将重组体DNA转化大肠杆菌，首次实现了DNA的分子克隆。

1975年桑格（Sanger）实验室建立了酶法快速测定DNA序列的技术。1977年吉尔伯特（Gilbert）实验室又建立了化学测定DNA序列的技术。分子克隆和测序方法的建立，使重组DNA技术系统得以产生。1980年诺贝尔化学奖被授予伯格、吉尔伯特和桑格，以肯定他们在发展DNA重组与测序技术中的贡献。

1977年板仓（Itakura）和博耶用人工合成的生长激素释放抑制素（Somatostatin, SMT）基因构建表达载体，并在大肠杆菌细胞内表达成功，得到第一个基因工程的产品。1982年，在建立转基因植物和转基因动物的技术上均获得重大突破。借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植物细胞内并发生整合，从而使植株获得新的遗传性状。同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中，然后移植到母鼠子宫内，由此培育出巨型小鼠。仅仅10年时间，基因工程在实践中迅速成熟，日趋完善。

二、基因工程的基本过程

生物的遗传性状是由基因（即一段DNA分子序列）所编码的遗传信息决定的。基因工程操作首先要获得基因，才能在体外用酶进行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体，并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞，使其复制（无性繁殖），由此获得基因克隆（clone，无性繁殖系的意思）。基因还可通过DNA聚合酶链式反应（PCR）在体外进行扩增，借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变和改造。克隆的基因需要进行鉴定或测序。控制适当的条件，使转入的基因在细胞内得到表达，即能产生出人们所需要的产品，或使生物体获得新的性状。这种获得新功能的微生物称为“工程菌”，新类型的动、植物分别称为“工程动物”和“工程植物”，或“转基因动物”和“转基因植物”。基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：

①分离或合成基因；

②通过体外重组将基因插入载体；

③将重组DNA导入细胞；

④扩增克隆的基因；

⑤筛选重组体克隆；

⑥对克隆的基因进行鉴定或测序；

⑦控制外源基因的表达；

⑧得到基因产物或转基因动物、转基因植物。上述步骤可用图10-1来表示。

基因工程是指在基因水平的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来，在离体条件下进行切割后，把它和作为载体的DNA分子连接起来，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。反以基因工程是人们的分子生物学理论指导下的一种自觉的、能象工程一样可事先设计和控制的育种新技术，是人工的、离体的、分子水平上的一种遗传重组的新技术，是一种可完成超远缘杂交的育种新技术，因而必然是一种最新、最有前途的定向育种新技术。

基因工程的主要操作步骤：

一、基因分离

(一)分别提取供体细胞(各种生物都可选用)的DNA与作为载体的松弛型细菌质粒 (也可用噬菌体或病毒作载体)。

(二)根据"工程蓝图"的要求，在供体DNA中，加入专一性很强的限制性酸内切酶，从而获得带有特定基因并露出称为粘接末端的DNA单链部分。必要时，这种粘接末端也可用人工方法进行合成。作为载体的细菌质粒等的DNA也可用同样的限制性核酸内切酶切断，露出其相应粘接末端。

二、体外重组

把供体细胞的DNA片段和质粒DNA片段放在试管中，在较低的温度(5-6℃)下混和"退火"。由于每一种限制性核酸内切酶所切断的双链DNA片段的粘接末端有相同的核苷酸组成，所以当两者混在一起时，凡粘接末端上碱基互补的片段，就会因氢键的作用而彼此吸引，重新形成双键。这时，在外加连接酶的作用下，供体体的DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被"缝合"，形成一个完整的有复制能力的环状重组体，即"杂种质粒"。

图10-1 基因工程基本操作过程示意图

三、载体传递

即通过载体把供体的遗传基因导入到受体细胞内。载体必须具有自主复制的能力。一般可以利用质粒的转化作用，将供体基因带入体细胞内；有时也可用特定的噬菌体(如大肠杆菌的λ噬菌体)或病毒(如在正常猴体内每殖的SV40球形病毒)作载体进行传递。

四、复制、表达

在理想情况下，上述这种"杂种质粒"进入受体细胞后，能通过处主复制而得到扩增，并使受体细胞表达出为供体细胞所固有的部分遗传性状，成为"工程菌"。

五、筛选、繁殖

当前，由于分离纯净的基因功能单位还，还较困难，所以通过重组后的"杂种质粒"的性状是否都符合原定"蓝图"，以及它能否在受体细胞内正常增殖和表达等能力还需经过仔细检查，以便能在大量个体中设法筛选出所需要性状的个性，然后才可加以繁殖和利用。

三、微生物学与基因工程的关系

微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因

工程操作都离不开微生物。从以下六个方面可以说明：