单克隆抗体制备78581ppt课件
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单克隆抗体制备课件
单克隆抗体可以用于肿瘤免疫治疗，通过与肿瘤细胞表面的抗原结合，激活免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
肿瘤免疫治疗
单克隆抗体可以用于免疫调节治疗，通过与免疫细胞表面的受体或配体结合，调节免疫细胞的活性，治疗自身免疫性疾病和感染性疾病。
免疫调节治疗
单克隆抗体可以用于制备诊断试剂，通过与特定抗原或抗体结合，用于临床诊断和实验室检测。
单克隆抗体可以用于治疗疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病等。
单克隆抗体可以用于生物标记，如免疫荧光、免疫组化等。
03
02
01
02
CHAPTER
单克隆抗体的制备流程
根据实验需求，选择适当的抗原作为免疫原，如蛋白质、多肽、细胞或组织等。
确定免疫原
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
对免疫原进行纯化，去除杂质，提高免疫效果。
免疫原的纯化
将免疫原与佐剂混合，增强免疫反应。
THANKS
感谢您的观看。
单克隆抗体由单一B细胞克隆产生，因此其结构和特性高度均一，具有很高的特异性。
高度均一
单克隆抗体与抗原的亲和力很高，可以检测出低浓度的抗原。
高亲和力
单克隆抗体可以在长期保存过程中保持稳定，便于长期保存和使用。
长期稳定
单克隆抗体可以用于诊断疾病，如免疫组化、酶联免疫吸附试验等。
诊断试剂
生物药物
生物标记
利用离心、过滤等方法去除细胞碎片和杂质，获得较为纯净的抗体溶液。
初步纯化
利用凝胶颗粒的孔径大小分离不同大小的抗体分子，去除杂蛋白和其他杂质。
凝胶过滤层析
利用抗体分子的电荷性质分离不同电荷状态的抗体分子，进一步提高纯度。
离子交换层析
04
CHAPTER
单克隆抗体的质量控制
肿瘤免疫治疗
单克隆抗体可以用于免疫调节治疗，通过与免疫细胞表面的受体或配体结合，调节免疫细胞的活性，治疗自身免疫性疾病和感染性疾病。
免疫调节治疗
单克隆抗体可以用于制备诊断试剂，通过与特定抗原或抗体结合，用于临床诊断和实验室检测。
单克隆抗体可以用于治疗疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病等。
单克隆抗体可以用于生物标记，如免疫荧光、免疫组化等。
03
02
01
02
CHAPTER
单克隆抗体的制备流程
根据实验需求，选择适当的抗原作为免疫原，如蛋白质、多肽、细胞或组织等。
确定免疫原
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
对免疫原进行纯化，去除杂质，提高免疫效果。
免疫原的纯化
将免疫原与佐剂混合，增强免疫反应。
THANKS
感谢您的观看。
单克隆抗体由单一B细胞克隆产生，因此其结构和特性高度均一，具有很高的特异性。
高度均一
单克隆抗体与抗原的亲和力很高，可以检测出低浓度的抗原。
高亲和力
单克隆抗体可以在长期保存过程中保持稳定，便于长期保存和使用。
长期稳定
单克隆抗体可以用于诊断疾病，如免疫组化、酶联免疫吸附试验等。
诊断试剂
生物药物
生物标记
利用离心、过滤等方法去除细胞碎片和杂质，获得较为纯净的抗体溶液。
初步纯化
利用凝胶颗粒的孔径大小分离不同大小的抗体分子，去除杂蛋白和其他杂质。
凝胶过滤层析
利用抗体分子的电荷性质分离不同电荷状态的抗体分子，进一步提高纯度。
离子交换层析
04
CHAPTER
单克隆抗体的质量控制
高二生物选修三《单克隆抗体的制备》精品PPT课件
Thinking In Other People‘S Speeches，Growing Up In Your Own Story
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
单克隆抗体
1、抗体
1.1 概念： 抗体是机体受抗原刺激
后产生的、并能与该抗原发 生特异性结合的具有免疫功 能的球蛋白 。 1.2 来源：
浆细胞（B淋巴细胞）
传统血清抗体的制备
特异性差、纯度低； 产量低、反应不够灵敏
抗原 刺激 动物体 抗原不纯
浆细胞 抗体
Байду номын сангаас抗体不纯
每个浆细胞（Ｂ淋巴细胞）只能分泌一种抗体，由一个 Ｂ淋巴细胞增殖产生的细胞群分泌的抗体化学成份是单一 的。
写在最后
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
You Know, The More Powerful You Will Be
Thank You
在别人的演说中思考，在自己的故事里成长
如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？
体外培养单个Ｂ淋巴细胞，提取分泌的抗体
体外培养淋巴细胞能无限增殖吗? 怎样解决这个问题？
二、单克隆抗体
设计方案： 一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体 小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖
杂种细胞
注射抗原的目的是什么
诱导其融合的方法有哪些？ 融合后培养液中有几种细胞
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性 细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞融合的步骤
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
单克隆抗体
1、抗体
1.1 概念： 抗体是机体受抗原刺激
后产生的、并能与该抗原发 生特异性结合的具有免疫功 能的球蛋白 。 1.2 来源：
浆细胞（B淋巴细胞）
传统血清抗体的制备
特异性差、纯度低； 产量低、反应不够灵敏
抗原 刺激 动物体 抗原不纯
浆细胞 抗体
Байду номын сангаас抗体不纯
每个浆细胞（Ｂ淋巴细胞）只能分泌一种抗体，由一个 Ｂ淋巴细胞增殖产生的细胞群分泌的抗体化学成份是单一 的。
写在最后
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
You Know, The More Powerful You Will Be
Thank You
在别人的演说中思考，在自己的故事里成长
如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？
体外培养单个Ｂ淋巴细胞，提取分泌的抗体
体外培养淋巴细胞能无限增殖吗? 怎样解决这个问题？
二、单克隆抗体
设计方案： 一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体 小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖
杂种细胞
注射抗原的目的是什么
诱导其融合的方法有哪些？ 融合后培养液中有几种细胞
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞膜的流动性 细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞融合的步骤
(培训课件)单克隆抗体PPT幻灯片
• 种类：氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多 糖、细胞因子、明矾等，其中弗氏不完全佐 剂（羊毛脂：石蜡油=1:5）和弗氏完全佐剂 （弗氏不完全佐剂＋灭活的分枝结核杆菌） 是目前动物实验中最常用佐剂。
4
• 抗体：机体免疫细胞被激活后，由分化成熟的 B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。
5
6
脾脏与B淋巴细胞(B lymphocytes)
淀）。
18
（2）HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
19
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)的选择原则
①克隆效应高，能在体外连续生长，倍增期短于24小时； ②缺乏HGPRT酶和TK酶； ③本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。 ④与小鼠淋巴细胞融合率相当高；
脾细胞的选择
由于目前常用的骨髓瘤细胞普遍来自Bal b/c小鼠，因此应尽 量选择同源的Bal b/c健康小鼠（8-12周）作为免疫动物。
死亡
20
3、阳性杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）
• 检测时间：杂交瘤细胞布满孔底1／10时开 始检测特异性抗体，进行筛选。
• 检测方法：最常用酶联免疫吸附法(ELISA) 间接免疫荧光法(IFA) 放射免疫法(RIA) 双相扩散法
3）离心，弃上清，加15mL HAT培养基，混匀，转入96孔 板（预先有HAT培养基培养的饲养细胞），每孔100 ul。
4
• 抗体：机体免疫细胞被激活后，由分化成熟的 B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。
5
6
脾脏与B淋巴细胞(B lymphocytes)
淀）。
18
（2）HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
19
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)的选择原则
①克隆效应高，能在体外连续生长，倍增期短于24小时； ②缺乏HGPRT酶和TK酶； ③本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。 ④与小鼠淋巴细胞融合率相当高；
脾细胞的选择
由于目前常用的骨髓瘤细胞普遍来自Bal b/c小鼠，因此应尽 量选择同源的Bal b/c健康小鼠（8-12周）作为免疫动物。
死亡
20
3、阳性杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）
• 检测时间：杂交瘤细胞布满孔底1／10时开 始检测特异性抗体，进行筛选。
• 检测方法：最常用酶联免疫吸附法(ELISA) 间接免疫荧光法(IFA) 放射免疫法(RIA) 双相扩散法
3）离心，弃上清，加15mL HAT培养基，混匀，转入96孔 板（预先有HAT培养基培养的饲养细胞），每孔100 ul。
单克隆抗体制备 ppt课件
实验研究的目的性 — 功能、形态、数量 实验设计的科学性 — 全面、动态、鲜明、对应、对照 实验方法的合理性 — 确切、先进 实验原理的内涵性 — 意义、要点 实验操作的规范性 — 准备、严格、准确、重复
单克隆抗体制备
1
免疫血清和单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备
2
一、免疫血清的制备
1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人
单克隆抗体制备
4
4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂
（1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载
2. 种类
1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂
多糖（LPS）、细胞因子；
2）氢氧化铝、明矾；
3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双
链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）；
4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
（ISCOMs）、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
6
3. 弗氏完全佐剂
1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2，也可1：1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
单克隆抗体制备
5
佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或
预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
单克隆抗体制备
1
免疫血清和单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备
2
一、免疫血清的制备
1. 原理： 机体具有多种B细胞克隆，将适当的抗原物质注入人
单克隆抗体制备
4
4. 抗原的处理
1）颗粒性抗原：红细胞、菌体等制成悬液，不需佐 剂，直接免疫。菌体数1×1010个/ml 为宜。
2）可溶性蛋白质抗原（如人IgG）、病毒抗原、细菌 可溶性抗原组分等，可以直接与弗氏完全佐剂
（1：1 V/V）混合、乳化。 3）半抗原（多糖、多肽、激素、化学药品）需与载
2. 种类
1）卡介苗（BCG）、短小棒状杆菌（CP）、脂
多糖（LPS）、细胞因子；
2）氢氧化铝、明矾；
3）双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）和双
链多聚腺苷酸：鸟苷酸（poly A：U）；
4）矿物油、脂质体、免疫刺激复合物
（ISCOMs）、CPG单克寡隆抗核体制备苷酸。
6
3. 弗氏完全佐剂
1）成分：羊毛脂、液体石蜡和灭活卡介苗。 2）配方：羊毛脂：液体石蜡 为1：2，也可1：1。
体偶联。常用载体有牛血清白蛋白（BSA）、钥 孔嘁血蓝素(KLH)、鸡血清蛋白（OA）；偶联剂 有过碘酸钠、戊二醛和碳化二亚胺等。KLH是最 常用的载体蛋白，碳化二亚胺是最常用的偶联
剂。
单克隆抗体制备
5
佐剂
1. 概念
佐剂属非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或
预先注入机体时，可增强机体免疫应答或改变免疫应 答的类型。
高中生物单克隆抗体制备(共38张PPT)
2、它相当于植物体细胞杂交过 程的哪一步？ 3、它们的过程、基本原理、诱 导融合方法和意义是否相同？
1.1动物细胞融合的概念
鼠B淋巴细胞 鼠骨髓瘤细胞
人工诱导
动物细胞融合（细胞杂交）
是指（在一定的条件下）两
个或多个细胞结合形成一个
细胞（该单核细胞称为杂交
细胞）的过程。
杂交瘤细胞
问题：1、它相当于植物体细胞杂交过 程的哪一步？ 2、它们的过程、基本原理、诱 导融合方法和意义是否相同？
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
3.若细胞两两融合后， 有几种融合情况？
选择性培养基 筛选1 克隆化
多种杂 交细胞
抗原-抗体 杂交法
筛选2（有限稀释）
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
4.第一次筛选出的杂交瘤
细胞为何需进行克隆化培
选择性培养基 筛选1
养和专一抗体检测？
多种杂
（ 特异性强、灵敏度高，可大量制备）
（4）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的 迅速（ 大量增殖 ）特点，又具备淋巴细胞 的（ 分泌专一抗体）特点，经过选择性培养 的杂交瘤细胞，还需进行（ 克隆化培养 ） 和（ 抗体检测 ），经多次筛选，就可获得足
够数量的能分泌所需抗体的细胞。最后将杂 交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或小 鼠腹腔内增殖，从（ 细胞培养液 ）或 （ 小鼠的腹水 ）中，就可以提取出大量 的单克隆抗体了。
一个效应bb细胞只分泌一种特异性抗体杂交瘤细胞动物细胞培养技术44单克隆抗体的制备方案动物细胞融合技术单克隆抗体既能产生特异性抗体又能大量繁殖的细胞一个骨髓瘤细胞能无限增殖制备单克隆抗体1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验5单克隆抗体制备过程步骤注射抗原效应bb细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞选择性培养基筛选11抗原抗体杂交法克隆化单克隆抗体筛选22有限稀释1
1.1动物细胞融合的概念
鼠B淋巴细胞 鼠骨髓瘤细胞
人工诱导
动物细胞融合（细胞杂交）
是指（在一定的条件下）两
个或多个细胞结合形成一个
细胞（该单核细胞称为杂交
细胞）的过程。
杂交瘤细胞
问题：1、它相当于植物体细胞杂交过 程的哪一步？ 2、它们的过程、基本原理、诱 导融合方法和意义是否相同？
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
3.若细胞两两融合后， 有几种融合情况？
选择性培养基 筛选1 克隆化
多种杂 交细胞
抗原-抗体 杂交法
筛选2（有限稀释）
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
4.第一次筛选出的杂交瘤
细胞为何需进行克隆化培
选择性培养基 筛选1
养和专一抗体检测？
多种杂
（ 特异性强、灵敏度高，可大量制备）
（4）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的 迅速（ 大量增殖 ）特点，又具备淋巴细胞 的（ 分泌专一抗体）特点，经过选择性培养 的杂交瘤细胞，还需进行（ 克隆化培养 ） 和（ 抗体检测 ），经多次筛选，就可获得足
够数量的能分泌所需抗体的细胞。最后将杂 交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或小 鼠腹腔内增殖，从（ 细胞培养液 ）或 （ 小鼠的腹水 ）中，就可以提取出大量 的单克隆抗体了。
一个效应bb细胞只分泌一种特异性抗体杂交瘤细胞动物细胞培养技术44单克隆抗体的制备方案动物细胞融合技术单克隆抗体既能产生特异性抗体又能大量繁殖的细胞一个骨髓瘤细胞能无限增殖制备单克隆抗体1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验5单克隆抗体制备过程步骤注射抗原效应bb细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞选择性培养基筛选11抗原抗体杂交法克隆化单克隆抗体筛选22有限稀释1
单克隆抗体的制备演示文稿课件
疾病诊断
用于检测疾病标志物，协助医生对疾病进行 早期诊断和预后评估。
药物开发
作为药物载体或治疗性抗体，用于疾病的诊 断和治疗。
免疫治疗
作为免疫治疗药物，用于治疗癌症、自身免 疫性疾病等。
02
单克隆抗体的制备过程
免疫原的制备
免疫原的纯度
确保免疫原的纯度高，无杂质和其他蛋白质的污染， 以提高免疫反应的特异性。
阳性细胞的筛选
筛选出能产生所需抗体的 阳性细胞株。
克隆化筛选
对阳性细胞株进行克隆化 筛选，确保其具有稳定的 遗传特性。
抗体的大量制备
细胞培养扩增
将筛选得到的杂交瘤细胞进行扩 增培养，以获得大量的抗体。
抗体纯化
采用适当的纯化方法，如凝胶过 滤、离子交换或亲和层析，去除 细胞培养上清中的杂质，获得高 纯度的抗体。
单克隆抗体的制 备演示文稿课件
目录
• 单克隆抗体的基本概念 • 单克隆抗体的制备过程 • 单克隆抗体的质量控制 • 单克隆抗体的应用实例 • 单克隆抗体的未来发展
01
单克隆抗体的基本概念
单克隆抗体的定义
单克隆抗体（Monoclonal Antibody, mAb）：是由单一B细胞克隆产生的高度均 一、具有特异性的抗体。
抗体纯度的检测
蛋白含量
通过电泳、质谱等技术，检测单克隆抗体中的杂质成分，确保产品的纯度和安全性。
04
单克隆抗体的应用实例
在医学诊断中的应用
肿瘤诊断与治疗监测
单克隆抗体可以特异结合肿瘤相关抗原，用于肿瘤的早期诊断、分型、病情监测和预后评估。例如， 针对癌胚抗原（CEA）的单克隆抗体在结直肠癌、乳腺癌等肿瘤的诊断和治疗中广泛应用。
05
单克隆抗体的未来发展
用于检测疾病标志物，协助医生对疾病进行 早期诊断和预后评估。
药物开发
作为药物载体或治疗性抗体，用于疾病的诊 断和治疗。
免疫治疗
作为免疫治疗药物，用于治疗癌症、自身免 疫性疾病等。
02
单克隆抗体的制备过程
免疫原的制备
免疫原的纯度
确保免疫原的纯度高，无杂质和其他蛋白质的污染， 以提高免疫反应的特异性。
阳性细胞的筛选
筛选出能产生所需抗体的 阳性细胞株。
克隆化筛选
对阳性细胞株进行克隆化 筛选，确保其具有稳定的 遗传特性。
抗体的大量制备
细胞培养扩增
将筛选得到的杂交瘤细胞进行扩 增培养，以获得大量的抗体。
抗体纯化
采用适当的纯化方法，如凝胶过 滤、离子交换或亲和层析，去除 细胞培养上清中的杂质，获得高 纯度的抗体。
单克隆抗体的制 备演示文稿课件
目录
• 单克隆抗体的基本概念 • 单克隆抗体的制备过程 • 单克隆抗体的质量控制 • 单克隆抗体的应用实例 • 单克隆抗体的未来发展
01
单克隆抗体的基本概念
单克隆抗体的定义
单克隆抗体（Monoclonal Antibody, mAb）：是由单一B细胞克隆产生的高度均 一、具有特异性的抗体。
抗体纯度的检测
蛋白含量
通过电泳、质谱等技术，检测单克隆抗体中的杂质成分，确保产品的纯度和安全性。
04
单克隆抗体的应用实例
在医学诊断中的应用
肿瘤诊断与治疗监测
单克隆抗体可以特异结合肿瘤相关抗原，用于肿瘤的早期诊断、分型、病情监测和预后评估。例如， 针对癌胚抗原（CEA）的单克隆抗体在结直肠癌、乳腺癌等肿瘤的诊断和治疗中广泛应用。
05
单克隆抗体的未来发展
《单克隆抗体的制备》课件
总结与参考文献
单克隆抗体是当代生物医学研究的重要手段，具有广泛的应用前景。参考： 参考文献1，参考文献2，参考文献3。
筛选合适的杂交瘤细胞， 增加培养和传代条件的 控制。
在单克隆抗体筛选过程 中，严格控制细胞数目， 避免细胞混合。
单克隆抗体的应用领域
癌症治疗
自身免疫疾病
单克隆抗体可用于靶向癌细胞， 抑制肿瘤生长和扩散。
单克隆抗体可以干预异常的免 疫反应，调节免疫系统功能。
传染病防治
单克隆抗体用于抵御病原体， 增强人体免疫力。
2
免疫动物注射
将免疫原注射到小鼠或兔子等动物体内，激发免疫反应。
3
细胞融合
从免疫动物体内取出脾细胞和骨髓细胞，与癌细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4
单克隆抗体筛选
通过筛选，选择具有特异性并高亲和力的单克隆抗体。
单克隆抗体制备中常见问题及解决方法
1 低抗体产量
优化免疫动物的免疫方 案和细胞培养条件。
2 杂交瘤细胞稳定性 3 克隆混杂
《单克隆抗体的制备》
单克隆抗体是生物医学研究和临床应用中的重要工具，能够精确靶向病理标 志物，具有巨大的应用潜力。
单克隆抗体的定义和作用
单克隆抗体是由一种特定的细胞克隆产生的抗体，能够与特定抗原高度特异性地结合。它在疾病诊断、 治疗和研究中发挥着重要作用。
制备单克隆抗体的步骤
1
免疫原制备
选择合适的免疫原，如蛋白质或多肽，制备免疫原样品。
单克隆抗体的市场前景
市场规模
预计未来几年内，单克隆抗体市场将继续增长。
新兴应用
单克隆抗体在精准医疗和个性化治疗领域有着广阔的市场前景。
技术进步
随着技术的不断进步，单克隆抗体的制备和应用将变得更加高效和便捷。
《单克隆抗体制备》课件
单克隆抗体制备流程
1
免疫原选择
选择合适的免疫原，如细胞、蛋白或多肽。
2
免疫动物免疫
将免疫原注射到小鼠或其他动物中，激发其产生抗体。
3
融合细胞制备
将免疫细胞与癌细胞融细胞与癌细胞融合， 形成杂交瘤细胞，从而制备 出单克隆抗体。
重链变异法
通过重链基因的变异和筛选， 获得带有特定抗原亲和性的 单克隆抗体。
转基因动物法
通过将人类抗体基因转入小 鼠等动物，使其产生人类单 克隆抗体。
单克隆抗体制备的应用
在疾病的早期诊断中起重要作用 治疗癌症、自身免疫疾病等疾病 用于药物研发和生物学研究
单克隆抗体制备与疾病治疗
单克隆抗体在疾病治疗中发挥着重要的作用。它们可以通过靶向特定抗原或信号通路来抑制疾病的发展，为患 者提供更加个体化和有效的治疗方案。
单克隆抗体制备
欢迎来到《单克隆抗体制备》的PPT课件！本课程将介绍单克隆抗体的概念、 制备流程、方法、应用、与疾病治疗的关系，以及制备过程中的挑战。让我 们一起开始探索这个令人兴奋的领域吧！
什么是单克隆抗体
单克隆抗体是由一种单一的抗体细胞克隆所产生的抗体，具有高度专一性和 亲和性。它们被广泛应用于疾病的诊断和治疗领域。
单克隆抗体制备的挑战
• 免疫原选择的挑战 • 克隆纯化的困难 • 制备时间和成本的考虑
结论和总结
单克隆抗体制备是一项复杂而重要的技术，它为研究和治疗领域提供了丰富 的工具和机会。通过深入了解单克隆抗体的制备流程和应用，我们能够更好 地应对疾病挑战，为人类的健康保驾护航。
单克隆抗体的制备.ppt
单克隆抗体制备
总结
单克隆抗体是由单一B淋巴细胞克隆所产生 的、只作用于一个特定抗原表位的均一抗体。
动物免疫 细胞融合 HAT选择性培养
阳性杂交瘤细胞的筛选
克隆化培养
建系与冻存
单克隆抗体的大量制备
谢 谢！
Balb/c 6-8周龄
3天
免疫脾细胞
单克隆抗体制备
制备流程 细胞融合
免疫脾细胞
+
PEG
SP2/0
骨髓瘤细胞（HGPRT-/TK-）
几种细胞类型？ ？
单克隆抗体制备
制备流程 选择性培养：HAT培养基
HGPRT－/ TK－ 不能生长
死亡
HGPRT+, TK+ 能够长期生长
生长繁殖
单克隆抗体制备
制备流程
单克隆抗体制备
单克隆抗体
(monoclonal antibody, McAb)
由单一B淋巴细胞克隆所产生的、只作 用于一个特定抗原表位的均一抗体。
三个“一”
单克隆抗体制备
制备原理
致敏的B淋巴细胞 骨髓瘤细胞
杂交瘤
杂交瘤技术
单克隆抗体制备
制备流程
动物免疫
1 23
采用与骨髓瘤细胞系来源相同的品系动物。
单克隆抗体制备
制备流程 杂交瘤细胞的建系与冻存
1、连续两次克隆化阳性率达100%； 2、体外连续传代三个月以上仍能稳定分泌抗体。
单克隆抗体制备
制备流程 单克隆抗体的大量制备
体外培养法（产量10-100μg/ml）
单克隆抗体制备
制备流程
单克隆抗体的大量制备 动物体内诱生法 （产量3-10mg/ml）
临床免疫学检验技术
单克隆抗体的制备 PPT课件
单克隆抗体的制备
五、应用
这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性 问题，可用于探讨
用于疾病诊断方面
用于疾病的治疗
用作研究工具
单克隆抗体的制备
可用以检测淋巴细胞表面分子, 以区分不同分化阶段的淋巴细胞, 用于 鉴别淋巴细胞。
可用于鉴定病原体, 准确诊断感染性疾病。 可以用于肿瘤的诊断和分型。
1946年--1995年
米尔斯坦 César Milstein（英国） 英国医学研究委员会 分子生物实验室 1927年--
单克隆抗体的制备
1994年Winter等创建了以噬菌体抗体库技术为代表的基因工程 抗体，是单克隆抗体技术的又一重要进步，该技术是按人工设 计所重新组装的新型抗体分了，使不经免疫既可获得任何一种 动物(包括人)的特异性抗体成为可能，目前基因工程抗体在疾 病的预防、诊断、及治疗方面已获得广泛应用。
三、分类：
非人源抗体
人-鼠嵌合抗体
人源化抗体
全人源抗体 抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最
终同的阶 段。
单克隆抗体的制备
四、优缺点：
1、优点
具有特异性高、效价高、纯度高、 理化性状均一、重复性强且来源稳 定可大量生产等优点。
单克隆抗体的制备
二、制备原理
1. 致敏淋巴细胞 2. 骨髓瘤细胞 3. 饲养层细胞 4. 细胞融合 5. 选择性培养 6. 特异性抗体的检测 7. 杂交瘤细胞的克隆化 8. 杂交瘤的冻存和复苏 9. 单克隆抗体的大量制取 10.单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针
单克隆抗体制备(共44张PPT)
单克隆抗体制备流程图
亲本细胞的选择与制备
骨髓瘤细胞 (NS-1)
骨髓瘤细胞需定期用
细胞株稳定，易传代培养；
细胞株本身不产生Ig
是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖 转换酶 缺陷株
(hypoxanthine-guanine phos phoribosyl transferase ,HGPRT)
最常用的骨髓瘤细胞是NS-1 和SP2/0细胞株
PEG可导致细胞膜上 脂类物质的物理结构 重排，使细胞膜容易 打开而有助于细胞融 合。
常见的几种融合形式
细胞DNA合成途经
HAT选择培养基
三种关键成分：
次黄嘌呤（hypoxanthine,H）
氨基蝶呤（aminopterin,A）
胸腺嘧啶（thymidine ，T）
◆是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的 生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞
因此在传统抗血清中，都含有许多种不同的抗体，分别针对这些不同的eptope。
每 mL 含有100 个 但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍采用传统方法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应是最可靠的。
单克隆抗体的制备流程和应用
细胞，若只要取一个 试采血 确定有抗体产生后，即可取出 脾脏以收集脾脏细胞(大多为B 细胞) 与骨髓瘤细胞进行 细胞融合。
2)体外增量培养法： 把杂交瘤细胞在大型培养槽 中培养，收集培养液上清即得抗体，但每 mL 只得 约数 mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细 胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极 为昂贵 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。
单克隆抗体的性质鉴定
种抗体；因此在传统抗血清中， 都含有许多种不同的抗体，分
单克隆抗体制备课件
细胞培养：选择合适的细胞 系进行培养
克隆化：将杂交瘤细胞进行 克隆化培养
抗体纯化：通过亲和层析法 纯化抗体
抗体鉴定：通过ELISA法鉴 定抗体的特异性和亲和力
PART FOUR
单克隆抗体在诊断试剂中的应用 单克隆抗体在免疫诊断中的应用 单克隆抗体在肿瘤诊断中的应用 单克隆抗体在传染病诊断中的应用
PPT,a click to unlimited possibilities
汇报人：PPT
CONTENTS
PART ONE
PART TWO
单克隆抗体：由 单一B细胞克隆产 生的抗体
特性：特异性强， 只识别一种抗原
制备方法：杂交 瘤技术、基因工 程等
应用：疾病诊断、 治疗、科学研究 等
制备过程：通过细胞融合技术， 将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融 合，形成杂交瘤细胞
产生来源：单克隆抗体是由 B淋巴细胞产生的
筛选：通过筛选，得到能够产 生特异性抗体的杂交瘤细胞
培养：将杂交瘤细胞进行培养， 使其大量增殖，产生大量的单 克隆抗体
PART THREE
确定抗原：选择合 适的抗原，如蛋白 质、多肽等
纯化抗原：通过离 心、层析等方法纯 化抗原
抗原处理：对纯化 后的抗原进行化学 修饰，如偶联、标 记等
PART FIVE
特异性强：能够识别并结合特异性 抗原
稳定性好：不易受环境因素影响
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
灵敏度高：能够检测低浓度的抗原
应用广泛：可用于疾病诊断、治疗 和预防
制备过程复杂，需要较高 的技术水平
成本较高，需要大量的资 金投入
制备周期较长，需要较长 的时间才能得到结果
存在一定的风险，如免疫 反应、过敏反应等
克隆化：将杂交瘤细胞进行 克隆化培养
抗体纯化：通过亲和层析法 纯化抗体
抗体鉴定：通过ELISA法鉴 定抗体的特异性和亲和力
PART FOUR
单克隆抗体在诊断试剂中的应用 单克隆抗体在免疫诊断中的应用 单克隆抗体在肿瘤诊断中的应用 单克隆抗体在传染病诊断中的应用
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汇报人：PPT
CONTENTS
PART ONE
PART TWO
单克隆抗体：由 单一B细胞克隆产 生的抗体
特性：特异性强， 只识别一种抗原
制备方法：杂交 瘤技术、基因工 程等
应用：疾病诊断、 治疗、科学研究 等
制备过程：通过细胞融合技术， 将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融 合，形成杂交瘤细胞
产生来源：单克隆抗体是由 B淋巴细胞产生的
筛选：通过筛选，得到能够产 生特异性抗体的杂交瘤细胞
培养：将杂交瘤细胞进行培养， 使其大量增殖，产生大量的单 克隆抗体
PART THREE
确定抗原：选择合 适的抗原，如蛋白 质、多肽等
纯化抗原：通过离 心、层析等方法纯 化抗原
抗原处理：对纯化 后的抗原进行化学 修饰，如偶联、标 记等
PART FIVE
特异性强：能够识别并结合特异性 抗原
稳定性好：不易受环境因素影响
添加标题
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灵敏度高：能够检测低浓度的抗原
应用广泛：可用于疾病诊断、治疗 和预防
制备过程复杂，需要较高 的技术水平
成本较高，需要大量的资 金投入
制备周期较长，需要较长 的时间才能得到结果
存在一定的风险，如免疫 反应、过敏反应等
《单克隆抗体制备》课件
02
单克隆抗体制备的流程
免疫动物
免疫动物选择
选择适合的动物作为免疫原注 射的宿主，如小鼠、大鼠等。
免疫方案设计
根据免疫原的性质和目的，设 计合适的免疫方案，包括免疫 途径、免疫次数、免疫剂量等 。
免疫原注射
将免疫原物质注射到选定的动 物体内，激发免疫反应。
杂交瘤细胞的培养
脾细胞与骨髓瘤细胞融合
免疫学研究
细胞生物学研究
单克隆抗体可以用于标记、分离和鉴定细胞，研究 细胞的生长、分化和凋亡等过程。
单克隆抗体是免疫学研究的重要工具，可用 于研究抗原、抗体和免疫反应的机制。
蛋白质组学研究
单克隆抗体可以用于蛋白质的检测、纯化和 相互作用研究，推动蛋白质组学的发展。
单克隆抗体的未来发展与挑战
技术创新
单克隆抗体的应用
01
02
03
04
生物研究
用于免疫学、细胞生物学和分 子生物学等领域的基础研究， 如检测、分离和纯化等。
医学诊断
用于疾病诊断和治疗监测，如 免疫组织化学、酶联免疫吸附 试验和放射免疫分析等。
生物制药
用于药物研发和生产，如治疗 性抗体、诊断试剂和疫苗等。
生物安全
用于检测和预防生物恐怖袭击 和传染病爆发，如检测生物武 器和病原微生物等。
特点
单克隆抗体在结构和功能上均具有高 度一致性，使其在生物研究和医学诊 断治疗中具有广泛应用。
单克隆抗体的特性
80%
高度特异性
单克隆抗体能够特异性识别和结 合抗原，具有极高的选择性。
100%
高纯度
单克隆抗体由单一B细胞克隆产 生，纯度高，避免了多克隆抗体 中不同抗体的交叉反应。
80%
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10 将细胞培养板置37℃ 饱和湿度的CO2 培养 箱中培养
11 培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观 察细胞融合情况
.
12 培养置第5天时用HAT培养基换液，换1/2 13 7-8天用HT培养基换液，全部换液 14 10-14天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上，
细胞上清变黄，可以检测融合细胞上清里 的抗体。
.
注意事项：
1 脾脏细胞与SP2/0细胞的比例在2：1— 5：1最好
2 细胞融合是关键步骤，避免用力吸打 3 细胞融合后3天要注意检查是否污染，包括
细菌和真菌，一发现污染，要尽快弃去
4 换液时不要影响孔底的杂交瘤细胞，不要吸 出或冲散
.
六、杂交瘤细胞的筛选 大约有10%的杂交瘤细胞能分泌抗体，而
37℃的MEM培养基加至融合管中
6 37℃水浴5min
7 室温下500g离心10min，弃上清
8 在融合管内加入HAT培养基20mL，将沉
淀悬浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加
入HAT培养基30mL，后加入10-15mL饲
养细胞悬液
.
9 将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔23滴，约0.1-0.15mL
mL MEM营养液中
.
注意要点： 1 如细胞外观不健康，或生长密度不好，应 检测是否
有支原体污染 2 一次用一个冻存管里的细胞融合，应避免 长期培养 3 融合的细胞要处于对取清洁级ICR小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min
2 将小鼠四肢固定，腹部朝上 3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤 4 用20mL注射器吸取15mLMEM营养液，注入 小鼠腹腔
.
1 在克隆的前一天，准备数块含有0.1mL饲 养细胞的96孔板
2 将24孔板里的待克隆细胞悬浮，取0.1mL 细胞悬液加入0.9mL台盼蓝染色液，混匀
3 血液计数板计数
4 在24孔培养板上，对待克隆细胞悬液进行 10倍比稀释
.
5 当稀释至100CFU/mL时，取1mL细胞悬液至 装有10mLHT培养基的瓶中，再分别加至96孔板 中（预先加有饲养细胞），0.1mL/孔
分泌特异性抗体的杂交瘤细胞更少，故需要筛 选。筛选抗体分泌细胞有多种方法，如HA-HI、 IFA、ELISA等。其中间接ELISA应用最广。
.
注意事项：
1 因单抗是鼠源的，故酶标记抗抗体常用酶标 羊抗鼠或兔抗鼠抗体，包括抗IgG、IgM的抗 体。如 单用酶标记抗IgG抗体，则IgM类单抗 就不能被筛选出来。
6 用吸管吹打细胞团块，将细胞悬液吸置50mL离 心管中，沉降5min
7 将细胞悬液吸置另外一支离心管中，500g离心 5min，弃上清，沉淀以20mL MEM培养基重悬
.
注意事项： 1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒 2 取脾脏时，如果脾脏被脂肪粘连，需小心， 不能撕裂或撕碎脾脏，更不能将肠道撕破 3 如果脾脏没用肿胀，表明免疫效果不好，
.
5 轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器来回抽吸几 次， 将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出，置细胞 瓶内待用
6 将饲养细胞转至50mL离心管内，500g离心 5min，以HAT培养基重悬细胞，转至细胞培 养瓶内待用
.
注意事项： 1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒 2 吸取腹腔饲养细胞时，不能将肠道刺破，否
则会造成污染 3 如腹腔里的脂肪块堵塞针头，应调整针头的
单克隆抗体制备
Monoclonal antibody
单个B淋巴细胞克隆所产生的针对同一个 抗 原决定簇的抗体。分三个阶段： （1）免疫Balb/c小鼠 （2）建立筛选方法和程序 （3）杂交瘤的生成
.
一、动物免疫
1 Balb/c小鼠 6-8周龄，25g左右，雌性较佳 2 免疫方法 （1）首次腹腔免疫0.5 ml抗原与福氏完全佐剂
2 阳性克隆转移到24孔细胞培养板中，细胞长 满后，上清再检测一次
3 筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选 特异单抗的方法最好
.
七、杂交瘤细胞克隆
在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中，可能混 有不分泌单抗的细胞克隆；另外分泌单抗的克隆 在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失，为 了防止不分泌抗体的细胞过度生长，在早期应对 细胞进行克隆。常用有限稀释法，一般来说，杂 交瘤经过3-4次克隆后就稳定了。
活细胞 （哺乳动物细胞）
105-7CFU
活癌源细胞
104-6CFU
糖类（多糖、糖蛋白）
100-200μg
核酸
100-200μg
.
二、骨髓瘤细胞的培养
1 在液氮罐中取保存的SP2/0细胞，以 MEM培养基复苏，37℃ CO2 培养箱中培养
2 在对数生长期收获107-108CFU的 SP2/0细胞
3 500 g离心5min，弃上清 4 轻轻振动离心管以松动细胞，重悬于20
应选用备用小鼠的脾脏
.
五、细胞融合及培养
1 以2：1混合脾脏细胞和SP2/0细胞，加至细 胞融合管中
2 在室温下500g离心10min，弃上清 3轻轻振动离心管以松动和混合细胞，后置
37℃水浴 4 在60S内用巴氏吸管将0.8mL预热至37℃
PEG1500缓慢加至细胞内，并轻轻抽吸两次
.
5 在90S内，用移液管轻轻将30mL预热至
位置，重新吸取细胞液
.
四、脾细胞的制备
1 取Balb/c小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min
2 将小鼠四肢固定，腹部朝上 3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹腔 4 小心分离出脾脏，置含有7mLMEM营养液的培
养皿内
.
5 用针头刺破脾脏，并用弯针头挤压脾脏，将脾 细胞分离出来
6将细胞培养板置37℃ 饱和湿度的CO2 培养箱中 培养10天左右，注意观察
7 大约3-4天在倒置显微镜下可见细胞克隆，5-7 天换液一次，
8 10天左右克隆长满，可以检测上清
.
注意事项：
1 上清液要在24 h内测定
2 细胞计数时只计活细胞（淡蓝色），死细胞 为深蓝色，且没有光泽
1：1的混和液，一般2-3只鼠 （2）30天后加强免疫，用福氏不完全佐剂
.
（3）15天后，尾静脉注射0.1mL水剂抗原，免疫 3天后，去脾脏融合 对于抗原性弱的抗原，可增加免疫次数，具体
程序依抗原性质而定。
.
可溶性蛋白（提取或表达的蛋白） 50-100μg
颗粒性蛋白（病毒）
50-100μg
细菌
106CFU
11 培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观 察细胞融合情况
.
12 培养置第5天时用HAT培养基换液，换1/2 13 7-8天用HT培养基换液，全部换液 14 10-14天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上，
细胞上清变黄，可以检测融合细胞上清里 的抗体。
.
注意事项：
1 脾脏细胞与SP2/0细胞的比例在2：1— 5：1最好
2 细胞融合是关键步骤，避免用力吸打 3 细胞融合后3天要注意检查是否污染，包括
细菌和真菌，一发现污染，要尽快弃去
4 换液时不要影响孔底的杂交瘤细胞，不要吸 出或冲散
.
六、杂交瘤细胞的筛选 大约有10%的杂交瘤细胞能分泌抗体，而
37℃的MEM培养基加至融合管中
6 37℃水浴5min
7 室温下500g离心10min，弃上清
8 在融合管内加入HAT培养基20mL，将沉
淀悬浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加
入HAT培养基30mL，后加入10-15mL饲
养细胞悬液
.
9 将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔23滴，约0.1-0.15mL
mL MEM营养液中
.
注意要点： 1 如细胞外观不健康，或生长密度不好，应 检测是否
有支原体污染 2 一次用一个冻存管里的细胞融合，应避免 长期培养 3 融合的细胞要处于对取清洁级ICR小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min
2 将小鼠四肢固定，腹部朝上 3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤 4 用20mL注射器吸取15mLMEM营养液，注入 小鼠腹腔
.
1 在克隆的前一天，准备数块含有0.1mL饲 养细胞的96孔板
2 将24孔板里的待克隆细胞悬浮，取0.1mL 细胞悬液加入0.9mL台盼蓝染色液，混匀
3 血液计数板计数
4 在24孔培养板上，对待克隆细胞悬液进行 10倍比稀释
.
5 当稀释至100CFU/mL时，取1mL细胞悬液至 装有10mLHT培养基的瓶中，再分别加至96孔板 中（预先加有饲养细胞），0.1mL/孔
分泌特异性抗体的杂交瘤细胞更少，故需要筛 选。筛选抗体分泌细胞有多种方法，如HA-HI、 IFA、ELISA等。其中间接ELISA应用最广。
.
注意事项：
1 因单抗是鼠源的，故酶标记抗抗体常用酶标 羊抗鼠或兔抗鼠抗体，包括抗IgG、IgM的抗 体。如 单用酶标记抗IgG抗体，则IgM类单抗 就不能被筛选出来。
6 用吸管吹打细胞团块，将细胞悬液吸置50mL离 心管中，沉降5min
7 将细胞悬液吸置另外一支离心管中，500g离心 5min，弃上清，沉淀以20mL MEM培养基重悬
.
注意事项： 1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒 2 取脾脏时，如果脾脏被脂肪粘连，需小心， 不能撕裂或撕碎脾脏，更不能将肠道撕破 3 如果脾脏没用肿胀，表明免疫效果不好，
.
5 轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器来回抽吸几 次， 将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出，置细胞 瓶内待用
6 将饲养细胞转至50mL离心管内，500g离心 5min，以HAT培养基重悬细胞，转至细胞培 养瓶内待用
.
注意事项： 1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒 2 吸取腹腔饲养细胞时，不能将肠道刺破，否
则会造成污染 3 如腹腔里的脂肪块堵塞针头，应调整针头的
单克隆抗体制备
Monoclonal antibody
单个B淋巴细胞克隆所产生的针对同一个 抗 原决定簇的抗体。分三个阶段： （1）免疫Balb/c小鼠 （2）建立筛选方法和程序 （3）杂交瘤的生成
.
一、动物免疫
1 Balb/c小鼠 6-8周龄，25g左右，雌性较佳 2 免疫方法 （1）首次腹腔免疫0.5 ml抗原与福氏完全佐剂
2 阳性克隆转移到24孔细胞培养板中，细胞长 满后，上清再检测一次
3 筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选 特异单抗的方法最好
.
七、杂交瘤细胞克隆
在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中，可能混 有不分泌单抗的细胞克隆；另外分泌单抗的克隆 在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失，为 了防止不分泌抗体的细胞过度生长，在早期应对 细胞进行克隆。常用有限稀释法，一般来说，杂 交瘤经过3-4次克隆后就稳定了。
活细胞 （哺乳动物细胞）
105-7CFU
活癌源细胞
104-6CFU
糖类（多糖、糖蛋白）
100-200μg
核酸
100-200μg
.
二、骨髓瘤细胞的培养
1 在液氮罐中取保存的SP2/0细胞，以 MEM培养基复苏，37℃ CO2 培养箱中培养
2 在对数生长期收获107-108CFU的 SP2/0细胞
3 500 g离心5min，弃上清 4 轻轻振动离心管以松动细胞，重悬于20
应选用备用小鼠的脾脏
.
五、细胞融合及培养
1 以2：1混合脾脏细胞和SP2/0细胞，加至细 胞融合管中
2 在室温下500g离心10min，弃上清 3轻轻振动离心管以松动和混合细胞，后置
37℃水浴 4 在60S内用巴氏吸管将0.8mL预热至37℃
PEG1500缓慢加至细胞内，并轻轻抽吸两次
.
5 在90S内，用移液管轻轻将30mL预热至
位置，重新吸取细胞液
.
四、脾细胞的制备
1 取Balb/c小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min
2 将小鼠四肢固定，腹部朝上 3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹腔 4 小心分离出脾脏，置含有7mLMEM营养液的培
养皿内
.
5 用针头刺破脾脏，并用弯针头挤压脾脏，将脾 细胞分离出来
6将细胞培养板置37℃ 饱和湿度的CO2 培养箱中 培养10天左右，注意观察
7 大约3-4天在倒置显微镜下可见细胞克隆，5-7 天换液一次，
8 10天左右克隆长满，可以检测上清
.
注意事项：
1 上清液要在24 h内测定
2 细胞计数时只计活细胞（淡蓝色），死细胞 为深蓝色，且没有光泽
1：1的混和液，一般2-3只鼠 （2）30天后加强免疫，用福氏不完全佐剂
.
（3）15天后，尾静脉注射0.1mL水剂抗原，免疫 3天后，去脾脏融合 对于抗原性弱的抗原，可增加免疫次数，具体
程序依抗原性质而定。
.
可溶性蛋白（提取或表达的蛋白） 50-100μg
颗粒性蛋白（病毒）
50-100μg
细菌
106CFU