单克隆抗体制备78581ppt课件

37℃的MEM培养基加至融合管中
6 37℃水浴5min
7 室温下500g离心10min，弃上清
8 在融合管内加入HAT培养基20mL，将沉
淀悬浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加
入HAT培养基30mL，后加入10-15mL饲
养细胞悬液
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9 将细胞悬液加至96孔细胞培养板中，每孔23滴，约0.1-0.15mL
分泌特异性抗体的杂交瘤细胞更少，故需要筛 选。筛选抗体分泌细胞有多种方法，如HA-HI、 IFA、ELISA等。其中间接ELISA应用最广。
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注意事项：
1 因单抗是鼠源的，故酶标记抗抗体常用酶标 羊抗鼠或兔抗鼠抗体，包括抗IgG、IgM的抗 体。如 单用酶标记抗IgG抗体，则IgM类单抗 就不能被筛选出来。
活细胞 （哺乳动物细胞）
105-7CFU
活癌源细胞
104-6CFU
糖类（多糖、糖蛋白）
100-200μg
核酸
100-200μg
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二、骨髓瘤细胞的培养
1 在液氮罐中取保存的SP2/0细胞，以 MEM培养基复苏，37℃ CO2 培养箱中培养
2 在对数生长期收获107-108CFU的 SP2/0细胞
3 500 g离心5min，弃上清 4 轻轻振动离心管以松动细胞，重悬于20
位置，重新吸取细胞液
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四、脾细胞的制备
1 取Balb/c小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min
2 将小鼠四肢固定，腹部朝上 3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹腔 4 小心分离出脾脏，置含有7mLMEM营养液的培
养皿内
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5 用针头刺破脾脏，并用弯针头挤压脾脏，将脾 细胞分离出来
单克隆抗体制备
Monoclonal antibody
单个B淋巴细胞克隆所产生的针对同一个 抗 原决定簇的抗体。分三个阶段： （1）免疫Balb/c小鼠 （2）建立筛选方法和程序 （3）杂交瘤的生成
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一、动物免疫
1 Balb/c小鼠 6-8周龄，25g左右，雌性较佳 2 免疫方法 （1）首次腹腔免疫0.5 ml抗原与福氏完全佐剂
应选用备用小鼠的脾脏
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五、细胞融合及培养
1 以2：1混合脾脏细胞和SP2/0细胞，加至细 胞融合管中
2 在室温下500g离心10min，弃上清 3轻轻振动离心管以松动和混合细胞，后置
37℃水浴 4 在60S内用巴氏吸管将0.8mL预热至37℃
PEG1500缓慢加至细胞内，并轻轻抽吸两次
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5 在90S内，用移液管轻轻将30mL预热至
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5 轻轻挤压小鼠腹腔，并用注射器来回抽吸几 次， 将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出，置细胞 瓶内待用
6 将饲养细胞转至50mL离心管内，500g离心 5min，以HAT培养基重悬细胞，转至细胞培 养瓶内待用
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注意事项： 1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒 2 吸取腹腔饲养细胞时，不能将肠道刺破，否
则会造成污染 3 如腹腔里的脂肪块堵塞针头，应调整针头的
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注意事项：
1 脾脏细胞与SP2/0细胞的比例在2：1— 5：1最好
2 细胞融合是关键步骤，避免用力吸打 3 细胞融合后3天要注意检查是否污染，包括
细菌和真菌，一发现污染，要尽快弃去
4 换液时不要影响孔底的杂交瘤细胞，不要吸 出或冲散
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六、杂交瘤细胞的筛选 大约有10%的杂交瘤细胞能分泌抗体，而
1：1的混和液，一般2-3只鼠 （2）30天后加强免疫，用福氏不完全佐剂
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（3）15天后，尾静脉注射0.1mL水剂抗原，免疫 3天后，去脾脏融合 对于抗原性弱的抗原，可增加免疫次数，具体
程序依抗原性质而定。
.Hale Waihona Puke Baidu
可溶性蛋白（提取或表达的蛋白） 50-100μg
颗粒性蛋白（病毒）
50-100μg
细菌
106CFU
6将细胞培养板置37℃ 饱和湿度的CO2 培养箱中 培养10天左右，注意观察
7 大约3-4天在倒置显微镜下可见细胞克隆，5-7 天换液一次，
8 10天左右克隆长满，可以检测上清
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注意事项：
1 上清液要在24 h内测定
2 细胞计数时只计活细胞（淡蓝色），死细胞 为深蓝色，且没有光泽
10 将细胞培养板置37℃ 饱和湿度的CO2 培养 箱中培养
11 培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观 察细胞融合情况
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12 培养置第5天时用HAT培养基换液，换1/2 13 7-8天用HT培养基换液，全部换液 14 10-14天后，杂交瘤细胞占孔底1/3以上，
细胞上清变黄，可以检测融合细胞上清里 的抗体。
6 用吸管吹打细胞团块，将细胞悬液吸置50mL离 心管中，沉降5min
7 将细胞悬液吸置另外一支离心管中，500g离心 5min，弃上清，沉淀以20mL MEM培养基重悬
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注意事项： 1 严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒 2 取脾脏时，如果脾脏被脂肪粘连，需小心， 不能撕裂或撕碎脾脏，更不能将肠道撕破 3 如果脾脏没用肿胀，表明免疫效果不好，
mL MEM营养液中
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注意要点： 1 如细胞外观不健康，或生长密度不好，应 检测是否
有支原体污染 2 一次用一个冻存管里的细胞融合，应避免 长期培养 3 融合的细胞要处于对数生长期
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三、饲养细胞的制备
1 取清洁级ICR小鼠2只，断颈椎杀死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡10min
2 将小鼠四肢固定，腹部朝上 3 在生物安全柜内，无菌打开小鼠腹部皮肤 4 用20mL注射器吸取15mLMEM营养液，注入 小鼠腹腔
2 阳性克隆转移到24孔细胞培养板中，细胞长 满后，上清再检测一次
3 筛选方法应在细胞融合前建立好，一部筛选 特异单抗的方法最好
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七、杂交瘤细胞克隆
在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中，可能混 有不分泌单抗的细胞克隆；另外分泌单抗的克隆 在初代不稳定，有一部分细胞染色体常丢失，为 了防止不分泌抗体的细胞过度生长，在早期应对 细胞进行克隆。常用有限稀释法，一般来说，杂 交瘤经过3-4次克隆后就稳定了。
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1 在克隆的前一天，准备数块含有0.1mL饲 养细胞的96孔板
2 将24孔板里的待克隆细胞悬浮，取0.1mL 细胞悬液加入0.9mL台盼蓝染色液，混匀
3 血液计数板计数
4 在24孔培养板上，对待克隆细胞悬液进行 10倍比稀释
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5 当稀释至100CFU/mL时，取1mL细胞悬液至 装有10mLHT培养基的瓶中，再分别加至96孔板 中（预先加有饲养细胞），0.1mL/孔