人表皮干细胞的分离培养

人表皮干细胞的分离培养【摘要】目的探索人表皮干细胞原代培养方法。

方法将皮肤标本进行分离，用DispaseⅡ酶消化表皮皮片后，重悬细胞，接种于铺有Ⅳ型胶原的培养瓶进行培养。

表皮干细胞的鉴定采用免疫细胞化学技术检测其表面标记物β1整合素、CK19的表达。

对表皮干细胞与角质形成细胞的克隆形成情况进行比较。

结果倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况良好，表皮干细胞β1整合素及CK19角蛋白染色阳性。

表皮干细胞克隆形成率高于角质形成细胞（P＜0.05）。

结论采用本方法进行人表皮干细胞的培养较为理想。

【Abstract】Objective The present research was performed to find primary cell culture method of human epidermal stem cells. Methods The skin samples were isolated by Dispase Ⅱ，the cells were seeded in culture flask which was dealed with type IV collagen. The epidermal stem cells were identified by immunocytochemical technique for the detection of integrin β1 and CK19. The cell clone formation of epidermal stem cells and keratinocyte were compared. Results Cell morphology was observed under microscope and good growth status inverted，epidermal stem cells were positive reaction to integrin β1 and CK19 antibody. Epidermal stem cell clone formation rate is higher than that of keratinocytes （P＜0.05）.Conclusion Our results indicate that the method was effective for culture human epidermal stem cells.【Key words】Epidermal stem cell；Culture；Identification表皮干细胞具有无限增殖的能力，在组织工程皮肤的研究中具有重要的作用，本文就表皮干细胞的原代培养进行探讨。

1 材料与方法1. 1 主要试剂DMEM培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM），单克隆抗体β1整合素，单克隆抗体CK19，Ⅳ型胶原，DispaseⅡ酶，胎牛血清（FBS），表皮细胞生长因子，0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）。

1. 2 实验设备CO2恒温培养箱，无菌超净工作台，倒置相差显微镜，普通光学显微镜。

1. 3 方法1. 3. 1 原代培养严格无菌操作，切取5×5 mm2左右的皮肤标本，标本源自本院4月龄自愿引产胎儿包皮，切取前分离皮下组织，将分离得到的皮肤组织用含青-链霉素的PBS冲洗3次，切成小皮块后置于含2.5 mg/ml DispaseⅡ酶的DMEM培养基中4℃过夜，培养基中含有青霉素（100 U/ml）及链霉素（100 μg/ml），第二天分离表皮和真皮层，收集表皮皮片，37℃条件下0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化15 min，胎牛血清终止消化，轻轻吹打，200目筛网过滤，收集细胞悬液，1000 rpm离心5 min，弃上清，加入新鲜培养液（DMEM表皮干细胞完全培养液含10%的FBS，10 μg/L 的表皮细胞生长因子，L-谷氨酰胺0.1 mM，非必需氨基酸0.1 mM），重悬细胞，计数，调整细胞浓度至5×105个/ml，种植于铺有Ⅳ型胶原的培养瓶进行培养（37℃，5%CO2饱和湿度恒温培养箱），培养瓶及培养板等均用Ⅳ型胶原预先铺好，并用加有双抗的DMEM培养液轻轻清洗1次。

每3天换1次液，并在倒置显微镜下观察细胞生长状况及有无其他病原体污染，对于未贴壁的细胞轻轻吸出作为角质细胞对照组加入相同的培养液进行培养。

1. 3. 2 传代培养细胞长至80%融合以后，经0.25%胰蛋白酶消化5 min左右，终止消化，用吸管轻轻吹打贴壁细胞，收集细胞悬液，1000 rpm离心5 min，弃上清，重悬细胞，计数。

按1：3比例进行传代，于37℃5%CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。

定期在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，根据生长状况进行换液。

1. 3. 3 免疫化学染色细胞贴片，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定20 min，采用SP法按照试剂的使用说明步骤进行β1整合素、CK19的免疫细胞化学染色检测，滴加一抗、二抗后，DAB显色，复染、脱水、透明、封片，镜下观察。

（三）导师制的作用大众化教育背景下本科生导师制的实施是否有必要？调查结果显示，在被调查的我院04、05级93人中，有79%的学生认为实行本科生导师制对于本科生培养教育具有重要的意义，82%的教师认为有利于因材施教和学生的个性发展；有利于教学与科研相结合；有利于充分发挥教师教书育人的主体作用；有利于密切师生关系，增进师生友谊。

可见，绝大多数师生对大众化教育背景下实施本科生导师制的认识具有高度的一致性。

（四）结论通过调查和比较分析，我院本科生导师制在实行过程中仍存在不少有待解决的问题，归纳为以下几点：一是本科生导师制形式化程度较浓厚，活动方式比较单一，师生比例不协调，师生间沟通交流较少，本科生导师制难于真正发挥作用。

二是导师制指导内容不够规范。

导师对自身职责和工作目标不够明确，部分导师难于做到尽职尽责。

三是导师制考评机制缺乏科学性，且与之配套的制度不健全和不完善，这在很大程度上影响了本科生导师制的实施效果及导师的工作积极性。

三、完善本科生导师制的对策和建议（一）结合实际，加强针对性指导指导方式应结合我院师资条件、教学科研状况、学生素质、班主任和辅导员制度等实际，选择不同类型。

目前，本科生导师制基本上分为综合导师制、年级导师制、英才导师制等不同类型。

由于我院班主任和辅导员制度的存在，与综合导师制必然产生职能上的重复，难于协调两种制度的职能，加之生师比问题突出，因而不适宜采用。

而英才导师制由于其覆盖面过小，闲置和浪费了导师资源，因而也不适宜采用。

相对而言，年级导师制由于主要是针对低年级学生的大学生活适应、学习方法、专业发展和职业规划的指导，可以有效地克服供需不平衡的问题，加之高年级的学生已经具备了较强的独立自主能力，就不再需要配备导师了，因而比较适宜。

同时，为求得导师制的良好效果，应加强指导的针对性和多样性，如利用电话相互联系或网上交流、导师经常下寝室、学生经常登门请教等加强学生与导师间的交流与了解，为导师制的顺利实施奠定基础；导师应根据学生的专业特长、学习兴趣和个性特征，制订并实施具体计划，通过导师论坛、专题讲座、谈心交流、学业辅导等形式，采取集中和个别相结合的方式，开展经常性的、有针对性的教育活动；此外，在指导要求上，既要倡导导师找学生，也要要求学生主动找导师，发挥两方面的积极性，形成良性互动，以增强指导实效。

（二）强化导师队伍，明确导师职责在进行导师筛选的过程中，挑选专业业务好、政治素质高、责任心强的老师担当本科生的导师是本科生导师制在实施过程中的一个重要环节。

近几年，随着我校扩大招生，学生数量急剧增加，但与此相对应的师资队伍建设却严重滞后，最突出的问题就是本科生导师的数量不能适应本科生导师制发展的要求。

为此，我们认为一方面应严格控制学生规模，加强师资队伍建设，提高教师工资福利待遇，以稳定导师队伍，激发导师工作的积极性；另一方面可适当招收部分在读研究生来充实导师队伍，使师生比保持在理想状态。

此外，应明确导师职责，这既是加强导师工作管理的必要手段。

也是衡量和考评导师工作的客观依据。

具体而言，本科生导师的职责大概分为以下几项：一是根据人才培养目标和专业培养计划，对学生的专业学习、选课过程给予指导。

二是定期组织学习讨论，让学生参与科学研究，培养学生理论联系实际的能力和创新思维能力，引导学生了解学科前沿情况，对学生的发展方向提出建议。

三是及时了解学生的思想动态，对学生进行思想品德教育，让学生树立正确的人生观和价值观，促进学生个性健康、充分地发展。

（三）加强制度建设，完善考评体系一是学院应建立导师培训制度，提供有关信息，使导师懂得如何去导。

如为保证导师能有效地指导学生选课，教学管理部门可利用课余时间让导师集中学习学分制的有关管理规定，使导师了解学分制的管理模式、选课过程的操作；学院和各系可组织导师学习，使其了解本专业培养计划，熟悉公共基础课、专业基础课和专业课与选修课等课程的安排情况；学院可为导师提供所指导学生的有关信息，如学习、奖惩、家庭情况，以便于导师因材施教；学工部门应向导师发布毕业生就业行情及市场信息，以方便导师为学生就业出谋划策。

二是完善导师岗位目标责任制和具体考评办法，对导师在任期内的德、能、勤、绩定期进行考核并记入档案，对导师的考核要充分听取学生的意见，要把考核结果与教师年度考核、专业技术职称、职务晋升、岗位聘任和奖酬金结合起来。

学校可设立本科生导师奖励基金，对工作突出的优秀导师进行表彰奖励，对不认真履行导师职责、考核不合格的导师加强教育管理，甚至取消其导师资格。

三是建立健全监督体制，采取灵活多样的监督方式，如在学工或教科办设立意见箱，向广大学生做定期导师成果调查，接受学生提出的建议和批评；加强监督网络，拓宽监督渠道，保障言路畅通等。

［参考文献］［1］李达轩，曾凡东.本科生导师制的探索与实践［N］.光明日报，2003-06-06.［2］周萍，樊如放.我国本科生导师制实行过程中存在的问题及对策［J］.教学研究，2002（4）.。