基因敲除技术研究进展

兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练Ⅰ——文献综述

题目：基因敲除技术研究进展

作者：王振宇

学号：201207744

指导教师：谢放

完成日期：2014-7-16

基因敲除技术研究进展

摘要基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。在总结已有研究成果的基础上，本文对基因敲除技术的概况、原理方法应用以及近年来基因敲除技术的研究进展作一个简单的综述。

关键词基因敲除 RNA i生物模型基因置换基因打靶同源重组1. 基因敲除技术简介

基因敲除(Gene knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,使特定基因失活,以研究该基因的功能；或者通过外源基因来替换宿主基因组中相应部分,以便测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲除是揭示基因功能最直接的手段之一。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段(即基因打靶),从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了基因打靶技术外,近年来新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有RNA干扰技术,同样也可以达到基因敲除的目的。简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、

可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。

举一个简单的例子[1]：比如有一段"序列":"1234567890"(原基因),敲除后为：“123 7890”,一般一个敲除载体还会在其中插入一段外源基因,如“ABC”,则新的基因为:“123ABC7890”；或者不插入基因直接连接，则为“1237890”。

基因敲除的细胞基础——胚胎干细胞：胚胎干细胞（Embryoonic stem cells，ESC）是早期胚胎细胞经体外抑制分化培养建立的多能性细胞系，体外培养时保持了未分化状态，可以传代增值，在发育上类似于动物早起胚胎的内细胞团细胞，具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型。ESC是进行基因敲除研究不可替代的材料。目前，虽然体外培养乳腺细胞、胎儿成纤维细胞等细胞类型的技术都已相当成熟，对这些类型的细胞进行基因组修饰也是完全可能的，但ESC 的另一特性是其他任何类型的细胞都不具备的，那就是当将一定数目的ESC注入囊胚期小鼠的囊胚腔后这些细胞就可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成，在此基础上，通过检测和选配，筛选出基因组中正常基因被破坏的动物个体，通过行为观察、生理生化指标检测等手段可以揭示该基因的作用。

迄今为止，只有小鼠干细胞的建系方法最成熟、效果最稳定，因此小鼠是基因敲除研究的唯一的实验动物模型。

2. 实现基因敲除的多种原理和方法：

2.1利用基因同源重组进行基因敲除

基因敲除是应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES 细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础[2]。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[6]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。2.1.1条件性基因敲除法

条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cr e介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因

修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。利用Cr e／Lox P 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上lox P 的ES 细胞产生“loxP floxed”小鼠,然后，通过将“lox P floxed”小鼠与Cr e 转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cr e重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“lox P floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个lox P，但靶基因并没有发生其他的变化，故“1oxP no xed”小鼠表型仍同野生型的一样。但当它与Cr e转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“lox P floxed”靶基因和Cr e基因。Cr e基因表达产生的Cr e 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生切除反应，结果将一个lox P 和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以Cr e的表达为前提的。Cr e的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cr e在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cr e的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cr e的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。

2.1.2 诱导性基因敲除法

诱导性基因敲除也是以Cr e/lox p 系统为基础，但却是利用控制Cr e表达的启动子的活性或所表达的Cr e 酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cr e 基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。诱导性基因敲除优点：

①.诱导基因突变的时间可人为控制；

②.可避免因基因突变而致死胎的问题

③.在2 个lox P 位点之间的重组率较高；