第六章微生物解析

第六章

纯培养(pure culture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.

纯培养的方法：见PPT第七章里的第七张

稀释倒平板法

首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物.

这种方法适合于细胞较大的微生物.

平板划线分离法

分区划线（适用于浓度较大的样品）

连续划线（适用于浓度较小的样品）

选择培养基分离法

倾注平板法

平板涂布分离法

简单易行，但易造成机械损伤

单细胞（单孢子）分离法

要在显微镜下进行

倾注平板法

比较常用的方法,但对热敏感菌及严格耗氧菌不太适合.

典型的生长曲线：课本153

典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等4个时期

延滞期：延滞期又称停滞期、调整期或适应期。指少量单细胞微生物接种到新鲜培养液中后,在开始培养的一段时间内,因代谢系统适应新环境的需要,细胞数目没有增加的一段时期。

该期的特点为:

①生长速率常数为零;②细胞形态变大或增长,许多杆菌可长成丝状③细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高,原生质呈嗜碱性;④合成代谢十分活跃,核糖体、酶类和ATP的合成加速,易产生各种诱导酶;⑤对外界不良条件如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏感。

影响延滞期长短的因素很多,除菌种外,主要有3种:

1.接种龄指接种物或种子的生长年龄, 即它生长到生长曲线上哪一阶段时用来作种子的。这是指某一群体的生理年龄。实验证明,如果以对数期接种龄的种子接种,则子代培养物的延滞期就短;反之,如以延滞期或衰亡期的种子接种则子代培养物的延滞期就长; 如果以稳定期的种子接种, 则延滞期居中。

2.接种量接种量的大小明显影响延滞期的长短。一般说来,接种量大,则延滞期短,反之则长因此,在发酵工业上,为缩短延滞期以缩短生产周期,通常都采用较大的接种量(种子∶发酵培养基= 1∶10 ,V/ V)。

3.培养基成分接种到营养丰富的天然培养基中的微生物,要比接种到营养单调的组合培养基中的延滞期短。所以,一般要求发酵培养基的成分与种子培养基的成分尽量接近,且应适当丰富些。

出现延滞期的原因,是由于接种到新鲜培养液的种子细胞中,一时还缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶,或是缺乏充足的中间代谢物。为产生诱导酶或合成有关的中间代谢物,就需要有一段用于适应的时间,此即延滞期。

指数期：指数期又称对数期( logarithmic phase ) ,指在生长曲线中,紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。

指数期的特点是:①生长速率常数R最大,因而细胞每分裂一次所需的时间--代时，或原生质增加一倍所需的倍增时间最短; ②细胞进行平衡生长, 故菌体各部分的成分十分均匀;③酶系活跃,代谢旺盛。

影响指数期微生物代时长短的因素很多,主要是:

①菌种:不同菌种其代时差别极大,

②营养成分:同一种微生物,在营养丰富的培养基上生长时,其代时较短,反之则长

③营养物浓度:营养物的浓度既可影响微生物的生长速率,又可影响它的生长总量，只有在营养物浓度很低( 0.1～2.0 mg/ mL) 时, 才会影响微生物的生长速率。随着营养物浓度的逐步

提高( 2.0～8.0 mg/ mL ) ,生长速率不受影响,而仅影响到最终的菌体产量。如进一步提高营养物浓度,则已不再影响生长速率和菌体产量了。凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物,就称生长限制因子

④培养温度:温度对微生物的生长速率有明显的影响

指数期的微生物因其具有整个群体的生理特性较一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点,故是用作代谢、生理等研究的良好材料,是增殖噬菌体的最适宿主,也是发酵工业中用作种子的最佳材料

稳定期

稳定期又称恒定期或最高生长期。

其特点是生长速率常数R等于零,即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等,或正生长与负生长相等的动态平衡之中。这时的菌体产量达到了最高点,而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系,

进入稳定期时,细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物;芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢;有的微生物在这时开始以初生代谢物作前体,通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物。所以,次生代谢物又称稳定期产物。由此还可对生长期进行另一种分类,即以指数期为主的菌体生长期和以稳定期为主的代谢产物合成期。

稳定期到来的原因是:①营养物尤其是生长限制因子的耗尽;②营养物的比例失调

稳定期的生长规律对生产实践有着重要的指导意义,例如,对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸等)为目的的某些发酵生产来说,稳定期是产物的最佳收获期;对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定(bioassay)来说,稳定期是最佳测定时期;此外,通过对稳定期到来原因的研究,还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建

衰亡期( decline phase 或death phase)

在衰亡期中,微生物的个体死亡速度超过新生速度,整个群体呈现负生长状态。这时,细胞形态

发生多形化,例如会发生膨大或不规则的退化形态;有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶( autolysis) ;有的微生物在这期会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物;而在芽孢杆菌中,往往在此期释放芽孢;等等。

产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利,从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢,继而导致大量菌体死亡。

恒浊与恒化培养的区别

装置控制对象培养基培养基流速生长速率产物应用范围

恒浊器菌体密度无限制生

不恒定最高速率

大量菌体或与菌体相平

生产为主( 内控制)长因子行的代谢产物

恒化器培养基流

速有限制生

恒定

低于最高速

不同生长速率的菌体实验室为主( 外控制)长因子率

厌氧菌因不能合成SOD,所以根本无法使O2·歧化成H2O2,因此,在有氧存在时,细胞内形成的O2·就使自身受到毒害

PH调节：

过酸时:加NaOH、Na2CO3等碱液中和

“治标”

过碱时:加H2SO4、HCl等酸液中和

过酸时加适当氮源: 加尿素、NaNO3、NH4 OH

或蛋白质等

提高通气量

“治本”

过碱时加适当碳源: 加糖、乳酸、醋酸、柠檬酸或油脂等