表达蛋白常见问题
His-Tag表达蛋白纯化原理、方法和问题分析
组氨酸标签蛋白的纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。
2．1IMAC(ImmobilizedMetal-ionaffinitychromatography)是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987年Smithetal.发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadexG-25作用力更强，此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadexG-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。
同年1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。
1986年Porathetal.还发现Fe3+-IDA-sephadexG-25可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种：2.2影响IMAC纯化结果的因素：2.2.1填料的种类：不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。
原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋白表达常见问题解析1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。
经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。
虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。
实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。
2、跨膜蛋白为什么很难表达？跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前众说纷纭很多种理论。
以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个原因：跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。
另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。
3、如何选择蛋白表达宿主菌？4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶回收三类。
1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，亲和纯化的方便快捷。
2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。
（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去工具酶。
此方法能快速得到蛋白。
（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。
蛋白不表达原因
蛋白质不表达：常见原因及分析1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQ E系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
见下图3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactam ase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。
C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。
蛋白质表达研究中的难点和挑战
蛋白质表达研究中的难点和挑战蛋白质是生物体中不可或缺的组成部分，它们在细胞中扮演着重要的功能角色。
研究蛋白质表达，即在生物体内合成蛋白质的过程，是生物医学科学领域中的一个重要研究方向。
然而，在进行蛋白质表达研究时，研究人员面临着一些难点和挑战。
本文将介绍蛋白质表达研究中的一些常见难点，并探讨如何应对这些挑战。
一、蛋白质结构复杂多样的挑战蛋白质的结构复杂多样，包括氨基酸序列、三维结构以及其所处的细胞环境等。
对于研究人员来说，了解蛋白质结构对于准确表达目标蛋白质至关重要。
然而，确定蛋白质的准确结构是一项相当困难的任务。
许多蛋白质的结构尚未被完全解析，或者存在变异和异常表达。
这为蛋白质表达研究带来了挑战，需要针对具体蛋白质结构的特点进行设计和优化。
二、蛋白质表达的低产量和不稳定性在蛋白质表达中，研究人员常常面临低产量和不稳定性的问题。
很多目标蛋白质在表达时难以得到足够的产量，甚至无法进行充分表达。
此外，有些蛋白质在表达过程中容易失去折叠或聚集成大量的非功能性物质，从而难以获取纯净的目标蛋白质。
这些问题不仅会延长研究时间，还会增加实验的复杂性和成本。
因此，提高蛋白质表达的产量和稳定性是一个重要的挑战。
三、选择适合的表达系统在蛋白质表达研究中，选择适合的表达系统是一个关键的决策。
常用的表达系统包括细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
不同的表达系统具有各自的特点和优势，因此选择合适的表达系统对于获得高效的目标蛋白质表达至关重要。
然而，确定适合的表达系统需要综合考虑蛋白质的生理特性、表达需求以及其它实验条件的限制。
这需要研究人员具备丰富的经验和专业知识。
四、后续处理和纯化的困难蛋白质表达的成功并不意味着表达的蛋白质已经满足研究的需求。
在蛋白质表达后，研究人员需要进行后续的处理和纯化步骤，以获得纯净的目标蛋白质。
这些步骤通常包括分离、浓缩、纯化和结晶等过程。
然而，这些步骤可能会影响蛋白质的结构和功能，导致实验结果的偏差。
重组蛋白表达技术的使用中常见问题
重组蛋白表达技术的使用中常见问题蛋白质是生命体内重要的组成部分，它们参与了几乎所有的生物过程。
为了研究和利用蛋白质的功能，科学家们通过重组蛋白表达技术来大量产生目标蛋白。
然而，在使用重组蛋白表达技术的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将详细探讨重组蛋白表达技术使用中的一些常见问题，并提供相应的解决方法。
1. 表达水平低在使用重组蛋白表达技术时，常常会遇到表达水平低的问题。
低表达水平可能由多种原因引起，包括启动子的活性不足、转录过程中的阻塞或降解、翻译后期的限制以及蛋白质的不稳定性等。
解决方法：- 优化启动子选择：选择活性较高的启动子，如T7、CMV或SP6启动子。
- 优化培养条件：优化培养基组分、培养温度、表达宿主菌的载体拷贝数等，以提高蛋白表达水平。
- 优化转化方法：尝试使用电转化、化学转化或峰值冲击转化等方法来提高表达宿主菌的转化效率。
- 优化培养时间：延长培养时间，以便提高目标蛋白的表达水平。
2. 目标蛋白形成包含体在表达过程中，目标蛋白常常形成包含体（inclusion body），即蛋白质以不溶性的聚集体形式存在。
解决方法：- 优化培养条件：调整培养温度、培养基成分，提高溶解蛋白的折叠效率。
- 引入辅助蛋白质：结合引入辅助蛋白质的策略，帮助目标蛋白的正确折叠和溶解。
- 进行亲和纯化：通过抗标签或亲和层析等技术，将包含体中包含的目标蛋白从非特异性蛋白质中进行纯化。
3. 目标蛋白磷酸化或糖基化不足重组蛋白质常常需要进行修饰，包括磷酸化和糖基化等。
然而，有时目标蛋白表达后，修饰的程度不足，影响功能和稳定性。
解决方法：- 优化培养条件：调整培养基中相关原料的浓度，如添加合适的磷酸盐或糖类物质，促进修饰的进行。
- 引入修饰相关基因：将相关调控基因引入到表达宿主菌中，提高修饰相关酶的表达水平。
- 转化进化系统：构建具有修饰相关基因的酵母或细菌转化进化系统，通过长时间的适应培养，提高修饰效率。
4. 目标蛋白的折叠和稳定性问题有些目标蛋白在表达和纯化过程中容易失去活性或不稳定。
蛋白质表达与纯化常见问题解答
蛋白质表达与纯化常见问题解答蛋白质表达与纯化是生物科学研究中常见的实验技术，用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用等。
然而，在进行蛋白质表达与纯化实验时，常常会遇到一些问题。
本文将针对蛋白质表达与纯化过程中的常见问题进行解答，帮助读者更好地进行实验和解决实验中可能遇到的困难。
一、蛋白质表达问题解答1. 为什么我的目的蛋白质在大肠杆菌中表达得不好？蛋白质表达的成功与多种因素相关，包括宿主菌的选择、启动子的选择、表达载体的构建等。
首先，确认宿主菌是否合适，某些蛋白质可能需要使用其他细菌或真核细胞进行表达。
其次，选择合适的启动子和表达载体，确保表达水平能够满足需求。
另外，光照条件、温度、培养基的选择等也会对表达效果产生影响。
2. 我应该选择哪种表达载体？选择表达载体应根据实验需求来定。
一般来说，常用的表达载体有质粒和病毒载体。
质粒表达系统适用于小规模表达和纯化，而病毒载体表达系统适用于大规模表达和高效表达。
另外，如果需要对蛋白质进行特定修饰，如标记或融合蛋白表达，可选择相应的表达载体。
3. 如何对表达后的蛋白质进行检测？常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE、Western blot和质谱分析等。
SDS-PAGE能够分析蛋白质的分子量和纯度，Western blot可以检测特定蛋白质的表达水平，质谱则可以确定蛋白质的分子量和结构。
根据实验需求选择合适的方法进行检测。
二、蛋白质纯化问题解答1. 我应该选择哪种纯化方法？选择纯化方法取决于蛋白质的性质和需求。
常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
亲和层析适用于具有特异结合能力的配体，离子交换层析适用于根据蛋白质电荷差异进行分离，凝胶过滤层析适用于根据蛋白质的分子量进行分离。
根据蛋白质的特性选择合适的纯化方法。
2. 如何确定纯化效果？纯化效果可通过测定蛋白质的比活性、比强度和纯度来确定。
比活性和比强度分别指的是单位反应物质的相应活性或强度，纯度则指的是蛋白质在总样品中所占的比例。
毕式酵母表达常见问题及解析
毕式酵母表达常见问题及解析点击次数：433 作者：佚名发表于：2008-08-27 15:20转载请注明来自丁香园1、问：我用毕式酵母表达一个27KD的蛋白，小量表达并做SDS－PAGE有一条类似三聚体的条带。
用大量表达，表达上清用镍柱进行亲和层析，在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，为什么呢？请赐教参考见解：你在大量表达后有没有跑电泳检测?表达上清用镍柱亲和层析后洗脱液有没有电泳检测?你首先要做的是:1,确定你的蛋白确实有表达;2,亲和层析是表达的蛋白确实被洗脱下来了.然后再考虑FPLC的事.在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，可能的原因有：1，上样时没有目的蛋白，可能是1)没表达2)亲和层析时没洗脱或是穿透了；2，目的蛋白结合在FP LC柱子上没被洗脱；3，目的蛋白穿透FPLC柱子，你在FPLC上看到的大峰可能是盐分峰；4，电泳时没跑好,目的蛋白没被检测到.FPLC大峰也可能是目的蛋白峰，它的吸收值有多少？不要看与基线相比的高度,要看吸收值，如果吸收值不高的话就是蛋白的浓度太低,浓缩后再跑电泳。
2、问：我现在做的是裂殖酵母表达，表达载体pesp-2,酵母菌珠sp-q01.说明只提供用化学转化法，但我转化了好几次都没有结果，是否也可以用电转化，在多克隆位点把质粒线性化？参考见解：其实无论是那种类型的酵母表达，转化方法基本是一制的。
化学转化法对酵母转化讲就不是很高，这里你可以用电转的。
查一下以前别人的讨论，看看电转化方法，效率提高了，筛选的希望就大些了由于筛选表达酵母的时间比较长，两个方案同时做应该来的及的至于线性化，对于电转是要做的步骤，这是为了后面定位重组整合。
3、问：我做毕赤酵母分泌表达,想问做阴性对照的是应该用加甲醇前的上清还是用一直不加甲醇摇瓶同样时间的上清呢?参考见解：对于阴性对照我一般都用转了不含基因的原始质粒（比如９K等）的菌作为对照，诱导过程中同样加入甲醇，诱导的时间均一样，每次样品都会有一个对照。
蛋白质表达的常见问题及其解决办法
蛋白质表达的常见问题及其解决办法蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤，它涉及到将基因信息转化为具有功能性蛋白质的过程。
然而，在蛋白质表达的过程中，常常会遇到一些问题，这些问题可能会影响到研究的进展和结果。
本文将介绍蛋白质表达中常见的问题，并提供相应的解决办法。
一、表达系统选择不当在蛋白质表达过程中，选择合适的表达系统是至关重要的。
不同的表达系统在表达效率、折叠状态和产量等方面存在差异。
常见的表达系统包括大肠杆菌（E. coli）、酵母、哺乳动物细胞等。
找到适合自己研究目的的表达系统是解决表达问题的第一步。
解决办法：根据研究的目的和所需蛋白质的特性选择合适的表达系统。
对于简单蛋白质，E. coli系统往往是一个不错的选择。
对于复杂的蛋白质，可以考虑使用酵母或哺乳动物细胞系统。
此外，还可以尝试使用不同的表达载体和宿主菌株，优化表达条件来提高表达效率和产量。
二、蛋白质无法正确折叠蛋白质的折叠状态是其功能的基础，如果无法正确地折叠，可能导致蛋白质无法发挥预期的功能。
在某些情况下，蛋白质可能会出现聚集、形成夹心态或夹杂体等异常折叠状态。
解决办法：针对无法正确折叠的蛋白质，可以考虑使用分子伴侣（chaperone）辅助折叠。
分子伴侣是一类在细胞中参与蛋白质正确折叠的分子，通过与目标蛋白质相互作用，帮助其正确折叠，并防止其异常聚集。
此外，还可以优化表达条件，如温度、培养基成分等，以提供适合蛋白质折叠的环境。
三、蛋白质表达产量较低蛋白质表达的产量是一个关键指标，特别是对于需要大量蛋白质进行后续实验的研究。
然而，很多时候表达产量较低，难以满足研究需求。
解决办法：提高蛋白质表达产量可以从多个方面入手。
首先，可以优化表达载体和宿主菌株的选择，采用高效表达载体和具有高表达能力的宿主菌株。
其次，可以优化表达条件，如诱导条件、培养温度、培养时间等。
此外，还可以使用辅助表达因子，如融合标签或信号肽，来提高表达产量。
四、目标蛋白质的纯化困难在蛋白质表达之后，需要对目标蛋白质进行纯化，以获取高纯度的蛋白质进行后续实验。
蛋白系列常见问题及解决方法
蛋白免疫学系列常见问题及解决方法ECL1)、膜上无目的条带a)、目的蛋白未表达：可更换细胞重新表达。
b)、蛋白质被降解：提取蛋白时必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性，并且提取过程应在冰上操作。
c)、转膜过程出现失误。
d)、抗体或酶失活：选择在有效期内的试剂。
e)、抗体不能识别目的蛋白：确认该抗体是否适用于western。
2)、目的条带很弱a)、蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成：可适当加大蛋白上样量。
b)、蛋白没有充分转移到膜上：转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。
c)、抗体效价不高，用量不足，孵育时间太短，或抗体反复使用保存不当而失活：可考虑更换效价更高的抗体，或提高抗体稀释度，延长抗体孵育时间；若怀疑抗体失活，可用斑点杂交实验确定抗体活性。
d)、曝光时间太短：可适当延长曝光时间。
3)、目的条带很浓a)、可减少蛋白上样量。
b)、降低一抗二抗稀释度，减少抗体孵育时间。
c)、如果背景深的话，则要把发光液沥干些再压片；如果背景不深则需减少发光时间和显影时间。
4)、有非特异性条带a)、蛋白上样量过大：降低蛋白上样量。
b)、一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高：可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。
c)、洗膜不充分：可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer 中添加终浓度0.05%的Tween-20。
d)、目的蛋白在体内存在多种修饰形式，如乙酰化，甲基化，磷酸化，糖基化等：可查阅文献，用合适的方法去除蛋白的修饰，或选择合适的抗体。
e)、目的蛋白降解：重新准备蛋白样品，并加入足够的蛋白酶抑制剂。
5)、高背景a)、膜没有均匀浸湿：转膜前应用100%甲醇将PVDF膜完全浸湿10秒，快速激活。
b)、膜或缓冲液污染：拿取膜与吸水纸时要戴手套，及时更换新鲜转膜缓冲液。
蛋白不表达常见原因及分析定稿版
蛋白不表达常见原因及分析HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】蛋白不表达：常见原因及分析根据自己体会和蛋白版的既往精华帖子，总结了没有发现蛋白质表达的原因，或者蛋白质不表达的原因，欢迎大家拍砖。
1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
见下图3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
但是有一点我可以有很大把握的说：对于真核表达，密码子优化只能起锦上添花的作用（确认有表达，以此来提高表达量），而不能雪中送炭（没有表达出来，通过密码子优化极有可能不奏效）。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
蛋白质不表达的原因分析
蛋白质不表达：常见原因及分析1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。
C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。
C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。
6、二级翻译起始位点。
这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点完全一致的序列。
那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白被截短，在电泳时看不到预期大小的片段。
蛋白不表达常见原因及分析
蛋白不表达常见原因及分析蛋白质是生物体内最基本的结构单位，它们在细胞的生物化学功能中起着至关重要的作用。
然而，在某些情况下，蛋白质的表达可能会受到抑制或受到其他因素的干扰，导致其无法正常表达。
本文将探讨蛋白不表达的常见原因及其分析。
1. 基因突变基因突变是导致蛋白质不表达的主要原因之一。
突变可能引起DNA序列的改变，进而使正常的转录和翻译过程受到影响。
例如，点突变可能会导致氨基酸序列发生变化，从而影响蛋白质的结构和功能。
这种突变可能会导致蛋白质在转录或翻译过程中发生错误，并最终导致其无法正常表达。
2. 转录调控异常蛋白质的表达通常受到转录的调控。
转录调控是指在基因转录过程中通过启动子和调控因子来控制基因表达水平的调节机制。
如果转录调控过程中发生异常，例如调控因子缺失或突变，将导致蛋白质无法正常表达。
此外，DNA甲基化也是一种常见的转录调控机制，它可以通过甲基化基因组区域来静默基因的表达。
3. 翻译后修饰异常翻译后修饰是蛋白质合成后的重要过程，它可以调节蛋白质的结构和功能。
然而，某些异常情况下，翻译后修饰可能无法正确进行，导致蛋白质无法正常表达。
例如，翻译后修饰酶的缺失或突变可能会导致磷酸化、甲基化、乙酰化等修饰无法进行，从而影响蛋白质的功能。
4. 细胞环境影响蛋白质的表达还受到细胞环境的影响。
细胞内环境的改变可能会影响蛋白质的产生和稳定性。
例如，异常的细胞应激反应、病毒感染、细胞内局部代谢物浓度的变化等都可能导致蛋白质无法正常表达。
5. 蛋白质降解异常蛋白质的降解也是影响蛋白质表达的重要因素。
异常的蛋白降解过程可能导致蛋白质无法稳定存在。
例如，异常的泛素化和蛋白酶体功能可能导致蛋白质的过早降解，从而影响其表达。
综上所述，蛋白质不表达的原因多种多样，包括基因突变、转录调控异常、翻译后修饰异常、细胞环境影响以及蛋白质降解异常等。
了解这些原因并分析其影响是研究蛋白质功能和相关疾病的重要基础。
未来的研究应该继续深入探索这些问题，以促进我们对蛋白质表达机制的理解，并开发出新的疾病治疗策略。
蛋白质纯化常见问题及解决方案
蛋白质纯化常见问题及解决方案蛋白质纯化是生物化学研究中非常重要且常见的实验技术。
纯化蛋白质可以帮助科学家深入理解蛋白质的结构和功能，从而推动相关领域的研究进展。
然而，在进行蛋白质纯化的过程中，科学家们常常会遇到各种问题。
本文将介绍一些常见的问题，并提供解决方案，以帮助研究人员顺利进行蛋白质纯化实验。
常见问题一：蛋白质表达量太低在蛋白质纯化中，蛋白质的表达量是一个非常关键的因素。
然而，有时候我们会发现蛋白质的表达量过低，难以获得足够纯度的样品。
这可能有以下几个原因：1. 载体选择不当：选择适合的表达载体对蛋白质表达量有很大影响。
可以尝试使用高效表达载体，如pET系列载体，来提高蛋白质的表达量。
2. 菌株选择不当：不同菌株对蛋白质表达量有差异。
常用的菌株包括大肠杆菌（E.coli）和酵母菌等。
可以尝试不同菌株进行表达，找到最适合的菌株。
3. 条件优化不足：包括温度、培养基和诱导条件等。
合理优化这些条件有助于提高蛋白质的表达量。
解决方案：针对上述问题，可以尝试优化表达载体、菌株和条件，并进行系统的优化实验。
此外，还可以尝试使用其他表达系统，如哺乳动物细胞和昆虫细胞等。
常见问题二：蛋白质不稳定或易聚集蛋白质在纯化过程中可能会失去稳定性，因而导致降解、聚集或失活。
这种情况可能是由于多种因素造成的，例如温度、pH值、盐浓度和氧气等。
解决方案：对于易聚集和不稳定的蛋白质，可以采取以下一些措施：1. 降低温度：将温度降低到4℃以下，可以减缓蛋白质的降解和聚集速度。
2. 优化缓冲液：选择合适的缓冲液，并进行pH和离子强度的优化。
有时候添加一些辅助物质，如甘油、蔗糖或胰蛋白酶抑制剂，可以提高蛋白质的稳定性。
3. 使用小分子化合物：有时候可以加入一些小分子化合物，如L-辅酶A和聚氧乙烯醇等，来增强蛋白质的稳定性。
常见问题三：蛋白质纯化的污染蛋白质纯化过程中常常会伴随着各种污染物的存在，如其他蛋白质、核酸、有机化合物和盐等。
大肠杆菌蛋白未表达的原因
大肠杆菌是一种常见的细菌，常被用于表达蛋白质。
然而，有时候在表达蛋白质的过程中，可能会遇到一些问题导致大肠杆菌中目标蛋白未能成功表达。
以下是一些常见的原因：
1. 毒性效应：某些蛋白质可能对大肠杆菌有毒性，并导致细菌生长受阻或死亡。
这种毒性效应可能是由于蛋白质本身的性质，如聚集、结构不稳定或带有毒性域。
2. 结构不利：目标蛋白质的结构可能在大肠杆菌中很难正确折叠或稳定。
这可能是由于缺乏必要的辅助蛋白质、蛋白质太大或含有复杂的结构域等原因。
3. 转录/翻译问题：在大肠杆菌中，蛋白质的表达受到转录和翻译等多个层面的调控。
如果目标蛋白质的起始密码子或启动子序列存在问题，可能会导致表达受阻。
4. 不稳定的mRNA：在表达过程中，目标蛋白质的mRNA可能容易降解或被细菌的RNase 酶降解，从而影响蛋白质的表达。
5. 细胞环境问题：有时候，大肠杆菌的细胞环境可能对目标蛋白质的表达不利。
例如，蛋白质可能会被细胞内的蛋白酶降解，或者存在竞争性的表达和折叠过程。
针对以上的问题，科研人员通常采取一系列策略来提高目标蛋白质的表达成功率，例如优化表达载体、调节表达条件、使用表达辅助蛋白质等方法。
这些策略有助于克服大肠杆菌蛋白未表达的问题，并最终成功获得目标蛋白质。
昆虫细胞蛋白表达常见问题解析
昆虫细胞蛋白表达常见问题解析昆虫细胞蛋白表达常见问题解析1、昆虫细胞蛋白表达系统能否将两个基因共同表达？答：昆虫细胞可以同时表达多个基因,杆状病毒衣壳内可以容纳较大的外源DNA插入片段，可以分别构建2个质粒，然后一起转染昆虫细胞，这种方式的优点是可以分别优化两个蛋白的表达水平，可以控制两个蛋白的表达平衡，相对于一个质粒共表达的方式缺点是在蛋白表达之前质粒构建，质粒抽提，蛋白病毒包被工作及成本费用都是增加一倍的；另一种共表达的方式是pFastBac Dual载体上构建两个目的基因，就可以同时表达两个蛋白。
pFastBac Dual载体上两个启动子分别为PH和P10启动子，其中PH启动子蛋白表达效率要高于P10启动子。
2、昆虫细胞蛋白表达系统的优势（1）、可以表达大分子量的蛋白，目前做过250KD蛋白表达，依然稳定性较好，没有断裂或降解。
（2）、昆虫细胞相对哺乳动物细胞培养相对简单，27度培养，无需CO2补充，目前商业化的培养基细胞培养非常成熟，细胞密度能够达到15*10^6个/ml，昆虫表达系统成本较哺乳表达系统较低。
（3）、病毒一次包被，长期使用，稳定表达。
较哺乳瞬时表达系统而言，该系统放大表达较容易，不需要抽提大量的质粒，质粒的质量以及批次差异会影响蛋白表达。
昆虫表达系统只需要包被好病毒，做好表达小试即可稳定放大表达。
（4）、昆虫细胞体系能进行翻译后的加工修饰，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等；（5）、可以同时表达多个基因，比如抗体、 fab、互相结合作用的蛋白等；（6）、杆状病毒对脊椎动物无感染性。
（7）、可以表达有毒蛋白，比如抗菌肽。
3、昆虫病毒的保存方式对病毒有怎样的影响？答：制备病毒时添加2%的细胞培养级别的BSA或者胎牛血清，有助于保护病毒，如果忘记添加，在收货病毒后添加，放在4度或者负80保存，短期使用（一般半年左右）可以放在4度，长期使用建议负80保存，再次使用建议检测一下病毒滴度或者做个表达小试，防止病毒滴度降低或失效。
蛋白表达常见问题分析
蛋白表达常见问题分析影响蛋白表达有许多因素，如目的蛋白自身的特点，表达载体、表达菌株的组合，诱导表达的条件，培养基的选择等，都有可能对蛋白的表达产生影响。
针对蛋白表达中的一些常见问题，可尝试用如下方法加以解决。
一、蛋白不表达或表达量很低1．选择正确的表达载体与表达菌株基于T7 启动子的载体（如pET 系列载体）应选用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 等菌株不是基于T7 启动子的表达载体（如带有tac 启动子的pGEX、pMal 系列表达载体）应选用BL21 表达菌株。
对细胞有毒性的蛋白，应该选用背景表达低、严紧调控诱导的菌株，如BL21(DE3)pLysS 菌株。
对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白，应该选用Rosetta(DE3) 等菌株。
2．尝试不同的表达系统与菌株不同的蛋白，对不同载体与菌株的偏好不同，如果某一表达系统无法通过优化诱导表达条件得到明显改善，可以更换其它的菌株或表达载体。
3．表达条件的优化选择不同的培养基。
对于某些蛋白，在培养基中加入适量的葡萄糖（0.1%~0.5%），可以明显提高表达量。
较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间，一般可以加快表达的速度，促进目的蛋白的积累，从而提高表达量。
但是可能会降低可溶蛋白的表达量，形成包涵体。
菌体的生长状态对蛋白表达有很大的影响，可以通过测量菌液的OD 值监测生长状态。
对于大部分蛋白，应在菌液的对数生长期（OD ≈ 0.5）进行诱导。
二、目的蛋白不可溶，形成包涵体首先确认目的蛋白是否有表达。
裂解菌体并离心后，通过对全菌、上清、沉淀的检测，确认目的蛋白是否表达，还是形成了包涵体。
包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。
在无法改变蛋白自身结构的情况下，可以尝试不同的表达系统与菌株，增强其溶解能力，优化出适合特定蛋白的表达系统。
目前认为包涵体的形成是基于蛋白在菌体内积累速度过快，没有正确折叠而聚集沉淀。
蛋白不表达：常见原因及分析
蛋白不表达：常见原因及分析蛋白不表达：常见原因及分析根据自己体会和蛋白版的既往精华帖子，总结了没有发现蛋白质表达的原因，或者蛋白质不表达的原因，欢迎大家拍砖。
1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
见下图3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤10、转录终止子。
转录终止子的存在可以促进蛋白表达；但是缺少时就会造成“通读”，没完没了地读下去。
这在pET系统里不成问题，因为它在靶基因的相反方向有个选择性的标记基因。
如果你的靶基因正好和这个标记基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有个转录终止子。
如果没有的话，它们会竞争得天昏地暗，抢着生成mRNA和蛋白质。
11、mRNA的不稳定性。
靶基因的mRNA常聚集于细胞内。
但是大肠菌的mRNA及其不稳定。
如果在mRNA的5'-非翻译区和3‘-rho非依赖性终止子处插入稳定结构序列，可以促进mRNA的稳定性。
尤其是5'末端要是有个不带突出的发夹结构，能让mRNA 在胞浆内无生命之虞。
12、检测方法的可行性。
有时候，蛋白的确表达了，只是表达量特别低，或者和杂带靠得特别近，致使你错误地以为蛋白没有表达。
这时候，你可千万别忘记了生物学实验的两大黄金准则：对照和重复。
说到对照，有很多层意思。
最基本的意思是，要设立空载体对照。
在真核系统表达的蛋白，常常量特别低。
因此你不要老是想着WB和SDS-PAGE去检测。
这时候，你必须多看文献，另辟蹊径，从文献中找找看这个蛋白有米有很特别的性质----比如说如果它具有酶活性，那简直就是便宜你了。
体外表达的蛋白不稳定的原因
体外表达的蛋白不稳定的原因
体外表达的蛋白不稳定可能有多种原因，其中一些常见的原因包括：
1. 蛋白质本身的稳定性问题：某些蛋白质在体外环境中会容易受到热、酸碱性或氧化等因素的影响而变性或降解。
2. 不正确的折叠：蛋白质在体外表达过程中，由于折叠方式错误或未完全折叠而导致其失去稳定性。
3. 没有正确的后转录修饰：某些蛋白质需要经历后转录修饰，如磷酸化、甲基化等，以获得稳定的结构和功能，如果这些修饰不正确或不完全，蛋白质的稳定性可能会受到影响。
4. 没有正确的蛋白复合体形成：很多蛋白质需要与其他蛋白质（或其他配体）相互作用并形成复合体，在体外表达过程中，如果这些相互作用不正确或不稳定，蛋白质的稳定性可能会受到影响。
5. 优化条件不足：体外表达蛋白的条件，如温度、pH值、缓
冲液等，可能没有被充分优化，导致蛋白质的稳定性受到影响。
6. 细胞毒性：某些蛋白质在体外表达时对宿主细胞有毒性，这可能导致细胞死亡和蛋白质失活。
解决这些问题可以采取诸如调整表达条件、改变蛋白质结构、
进行以折叠、修饰或复合体形成等方面的优化，以增加目标蛋白的稳定性。
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没有活性可能存在两种原因：
1 his tag影响了活性，尝试切除his tag后再次测定酶活。
如果目前载体上没有酶切位点可以更换至有酶切位点的载体（例如pET28a N段his tag可以使用thrombin切除his tag）。
或者重新构建表达载体，自己引入酶切位点。
2 如果切除了标签还是没有活性那就是蛋白本身的问题了。
有些真核蛋白即使上清表达也是没有正确折叠的，或者没有进行表达后修饰，没有生物活性。
这种情况就比较杯具了。
2楼说的包涵体，我觉得有可能，
你的粗酶活性比较弱，产生包涵体之后就会更弱了。
当然到底是不是由于包涵体的原因，还得确定。
1.在N末端加入标签
这一系列载体的N末端加有标签，其中pQE-30、pQE-9带有6×组氨酸标签，pQE30系列中的三个载体的多克隆位点距离其实密码子而个相差一个碱基，pQE-9则是在多克隆位点处的设计较简单。
PQE40则是带有6×组氨酸二氢叶酸还原酶标签（6×His-DHFR），对于比较难表达的蛋白以及蛋白太小容易被降解的蛋白可以利用这种标签。
它可以保证蛋白的稳定性，同时不会对外源蛋白的免疫原性造成很大的影响，非常适合用于表位筛选。
2.在C末端加入标签
在蛋白的C末端加入标签的好处是显而易见的：可以利用基因本身的ATG作为起始密码子，保证了蛋白天然的N末端，这对于一些医药用的重组蛋白是相当重要的；同时可以纯化出那些完整表达的蛋白，一些在翻译过程中容易造成“暂停”现象的蛋白就不用怕纯化产物里含有不完整的产物。
融合了6×组氨酸标签的有pQE-60和pQE-70，融合了6×His-DHFR的有pQE-16。