细胞与分子遗传学

细胞和分子遗传学

第一章绪论

1. 遗传：生物信息从上代往下代传递

2. 遗传学：研究遗传规律的科学

3. 基因组Genome : 一整套染色体上的所有遗传物质

4. 基因组学Genomics: 研究基因组的科学，包括研究分析核酸序列、基因成分、基因结构和基因数目.

5. 细胞遗传学: 从细胞学和遗传学发展起来的交叉学科，它涉及染色体的形态、结构、数目、功能和运动等特征，以及这些特征的各种变异对遗传传递、重组、表达与调控的作用和影响，也涉及染色体外的遗传因子。以染色体遗传为研究核心。

6. FISH(fluorescent in situ hybridization):荧光原位杂交

7. 原位杂交：是一项利用标记的DNA或RNA探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术。

8. FISH工作原理：用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点。

9. FISH的应用：⑴位点特异性探针：能与染色体的特定部位杂交；已经分离出一段基因的一小部分，若要确定这段基因位于哪个染色体，就准备这段基因的探针并观察该探针与哪个染色体杂交。⑵整个染色体探针：能分别与染色体纵轴的不同序列杂交的很短的探针的集合。用这些探针库能画出全部染色体并产生核型谱带，再进行核型分析，用于检测染色体异常10.原位杂交的种类：⑴GISH（Genomic in situ hybirdization)——以基因组为探针（整个染色体）。⑵FISH（Fragment in situ hybridization)——以特定的基因为探针（基因片段）。⑶mFISH (multicolor FISH)——利用不同颜色的荧光素标记不同的探针。⑷Fiber-FISH——利用化学方法对染色体进行线性化，再以此线性化的染色体DNA纤维为载体进行FISH（提高分辨率）。第二章基因组作图与基因定位

1. 结构基因组的研究策略：测序路线——作图（遗传图和物理图）、测序（图谱测序和随机测序）、组装（骨架图和空隙图）。

2. 为何要绘制遗传图与物理图？1)基因组太大,必需分散测序,然后将分散的顺序按原来位

置组装,需要图谱进行指导. 2)每次仅能读取1000bp，已知最小的细菌为580kb.3)基因组存在大量重复顺序,会干扰排序,因此要高密度基因组图. 4)遗传图和物理图各有优缺点,必须相互整合校正.

3. 遗传图与物理图：⑴遗传作图（Genetic mapping）采用遗传学分析方法将基因或其它DNA 顺序标定在染色体上构建连锁图。包括杂交实验，家系分析。遗传图距单位为厘摩(cM), 每单位厘摩定义为1%交换率。⑵物理作图（Physical mapping）采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种（radiation hybrid）作图的计算单位为厘镭(cR), 限制性片段作图与克隆作图的图距为DNA的分子长度，即碱基对(bp, kb)。

4. 基因组测序的策略：Clone-by-clone测序（基因克隆）、鸟枪法测序（全基因组）、混合法测序。基本流程：随机酶切成小片段（不完全酶切）——亚克隆（酶切片段+载体）——亚克隆测序（两端测序）——组装。关键：酶选择，片段大小，数量（库大小）。

5. 基因组路标(landmarker)：染色体上的基因和DNA顺序均可作为路标, 路标具有物理属性,他们由特定的DNA顺序组成. 路标位于染色体上的位置是固定的, 不会更改的, 因而提供了作图的依据。

6.RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）：指基因型之间限制性片段长度的差异（同种酶），这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。

7. RFLP的特点：⑴处于染色体上的位置相对固定; ⑵同一亲本及其子代相同位点上的多态性片段特征不变; ⑶同一凝胶电泳可显示不同多态性片段, 表现为共显性（双亲的性状同时在F1个体上表现出来）——一个酶切位点突变，则两条同源染色体跑出的胶共有3段，下面两段相加等于上面那段.

8. 如何寻找RFLP标记（即酶切位点）: ⑴随机克隆筛选; ⑵将其它方法获得的DNA标记, 如RAPD (random amplified polymorphism DNA)标记转换为RFLP标记; ⑶从cDNA 中寻找RFLP. ⑷计算机筛选.

9. AFLP(amplified fragment length polymorphism, 放大的片段长度多态性)：⑴这是一种筛选RFLP分子标记的方法. 先将DNA样品采用选定的限制性内切酶(如EcoRI, Sau3A)消化, 然后加上接头PCR引物（补平粘性末端并额外延伸1-3个碱基）. ⑵接头PCR引物设计: 根据限制酶接头添加数个向外延伸的碱基（补平末端）, 然后向3’方向延伸1-3个不同的碱基（共有41-43种不同的引物）. ⑶选择不同的引物对扩放样品DNA（PCR）, 经聚丙烯胺

凝胶电泳分离标记的（就是用那多出的1-3个碱基作为标记）PCR产物.

10.SSLP（simple sequence length polymorphism，简单序列长度多态性）：⑴可变排列的简单重复顺序, 即重复次数不一, 在染色体的同一座位重复顺序拷贝数不同(导致多态性); ⑵SSLP的类型:小卫星序列(minisatellite), 重复单位较长；微卫星序列(microsatellite), 重复单位较短, 在1-6个核苷酸之间。

11.SSR（简单重复序列，即微卫星序列）: 其串联重复的核心序列为1-6 bp，其中最常见是双核苷酸重复(CA,TG), 重复单位数目10-60个。

12. 如何寻找微卫星序列标记? ⑴1982年Hamada等首次报道microsatellite现象(PNAS, 79:6564, 1982)。⑵1989年Weber等从GenBank中发现人类基因组的8个位点中, 有7个位点存在(CA)n拷贝数的变化(Am. J. Hum. Genet., 44:388, 1989).⑶现已证实人和老鼠基因组中平均每18-28 kb含有一个多态性(CA)n.⑷获取方法: a) 机算机搜寻; b) 用Sau3A, RsaI, HaeIII或AluI 限制酶酶切基因组DNA, 构建DNA文库.合成简单寡聚重复核苷酸作为探针从库中筛选.⑸根据简单重复顺序两侧的序列设计引物, 用同位素标记PCR扩增样品, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳分辩.

13. SNP (single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)：指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。

14. SNP的一些特点：⑴理论上同一碱基位置SNP等位型式最多为4. ⑵直接从STS (sequence-tagged site，序列标志位点)测序中可寻找到SNP. ⑶MIT Whitehead Institute 经分析证实, 人类基因组平均每1 kb含有一个SNP. 估计人类基因组有300万个SNP. ⑷SNP与人类易感性疾病有关, 涉及药物基因组学. ⑸编码区SNP主要分布在密码子的摇摆位置（第3个碱基），表现为沉默突变而被保留下来.

15. ★遗传图绘制-分子标记的等位型式及F2基因型分析，计算重组率，从而绘制遗传图（Aa/Bb，其中A/B连锁）（图-42）

16. ★物理图绘制：⑴限制性作图（Restriction mapping）它是将限制性酶切位点标定在DNA 分子的相对位置。⑵依靠克隆的基因组作图(Clone-based mapping) 根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群(Contig), 绘制物理连锁图。⑶荧光标记原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。⑷顺序标签位点（Sequence tagged site, STS）作图通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中（小段DNA序列已知，两端设计引物，利用PCR进行扩增）。

㈠限制性作图（Restriction mapping）：将限制性酶切位点标定在DNA分子（一般为小分子