生物工程下游技术 第四章节 沉淀法文档
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第四章 沉淀法
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎片分离
路线一A
溶解(加盐酸胍、脲)
粗分离(盐析、萃取、超过滤等)
复性
纯化(层析、电泳)
脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
第一节 概述
与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备 有以下主要特点：
为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在 的。
DLVO理论
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗 粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势 垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现 为吸引位能。
沉淀策略及方法 策略
破坏蛋白质周围的水化层 降低双电层厚度（ζ电位）
★静电斥力 ★吸引力
蛋白质/胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似
蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要 是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是 电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质 表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。
吸引力
颗粒间的相互作用 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 Van der Waals 力 Keeson 引力（偶极力） Debye 引力 （诱导力） London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，因
基本概念
通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以 固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化 技术称为固相析出技术。
结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体时称为 结晶法。
沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体 时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶 剂沉淀法和等电点沉淀法等。
lgS lgS
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
pH6.6
2
25℃
1
1
0℃
o
25℃
2
3I
o
4
2
pH 7.43
7.17
6.05
6.80 6.60
3I
4
温度和pH对碳氧血红蛋白的磷酸盐盐析曲线的影响
I
三、盐析常用的盐
常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸钠、 氯化钠、磷酸钠、磷酸钾等。
（NH4）2SO4 最常用： ① 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，
这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常 是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下 （0～4℃）进行。由下表可以看到，（NH4）2SO4在 0℃时仍有70.6％的溶解度，远远高于其它盐类：
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃ 20℃ 80℃ 100℃
(NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103
◆沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况 下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为初 级分离技术加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉 淀分离得到目标产品的工业实例。
基本原理：
根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离 的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶 质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的 大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分 的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子 强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
β 2.5
2.0
1.5 S0
1.0
0.5
0
-0.5
-1.0
-1.5
123456 μ
应用：
蛋白质和酶分离提纯 多肽、多糖和核酸也可以用盐析法进行沉淀分
离 20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉
淀 43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，
而tRNA保留在上清。
一、盐析法的原理及特点 原理
I－一离子强度等于 I=1/2∑mizi2;
mi——离子 i的摩尔浓度；
Zi——所带电荷；
β——常数，与盐的种类无关，但与温度、pH和蛋白质种类有 关;
Ks——盐析常数，与温度和PH无关，但与蛋白质和盐的种类有 关。
用盐析法分离蛋白质的二种方法
⑴在一定的 pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即 离子强度）达到沉淀的目的，称为“Ｋs”分级盐 析法。
可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。 具体操作方法如下：
①取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分
离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH 值。
②计算饱和度达到20%-100%所需加入的硫酸铵量，
边搅拌边加入，放置1h以上，使沉淀达到平衡
盐析操作-溶解度曲线确定
③离心分 离沉淀物 并重新溶 解测定其 中总蛋白 和目标蛋 白的浓度
第二节 蛋白质的表面特性
蛋白质组成 20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水
性氨基酸和亲水性氨基酸 蛋白质折叠趋势
疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势 结果
在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残 基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区构成。
50
60
70
80
P
一般常将蛋白质浓度控制在2～3％为宜。
相当于25 mg/mL～30mg/mL。
（四）温度的影响：
2 pH6.6
温度的变化会影响值。
log S
在无盐或稀盐溶液中，大
1
0℃
多数蛋白质溶解度是随温
度升高而增大的，但在高
0
25℃
盐溶液中常相反。
2
3
4
μ
对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下 操作，以避免活力丧失。但有的蛋白质（如血红蛋 白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25℃）比 0℃时溶解度低，更容易盐析。
缺点
盐析法分辨率不高，适合于生化物质粗提纯 阶段，需和其它方法交替使用。
二、影响盐析的因素
（一）离子强度和类型
一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。 在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强 度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或 冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和 度，使另一种蛋白质组分盐析出来。
Na2SO4
4.9 18.9 43.3 42.2
NaH2PO4
1.6 7.8
93.8 101
② 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析， 一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
③ 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L的（NH4）2SO4保存 可达数年之久。
形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥 作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。
中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了 水化膜，使其沉淀。
Cohn方程式
现在常用 Cohn经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间 的关系：
㏒ S= β－ ＫsＩ 式中S——蛋白质的溶解度，g/L;
沉淀法的特点和应用
◆沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用 于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分 离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用 的方法。
◆通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分 相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；
◆沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存 或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的， 即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。
（Ks盐析：固定pH, 温度，改变盐浓度）
⑵在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达 到沉淀的目的，称为“β”分级盐析法。
（β盐析：固定离子强度，改变pH及温度。）
当离子强度较高时，溶解度的对数与离子 强度呈线性关系
优点
①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用，不易引起 蛋白质变性
（五）PH的影响：
蛋白质所带净电荷越多，
8
β
７
它的溶解度就越大。改变pH
６
值可改变蛋白质的带电性质，
５
因而就改变了蛋白质的溶解
４
OA-卵清蛋白
COHb-碳氧血红蛋白 OA
度。
３
COHb
3 4 5 67８
以磷酸盐沉淀COHb和以硫酸铵
沉淀OA时，β随 pH的变化
在等电点处溶解度小（值最小）。
因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该 蛋白质的等电点附近
④ 价格便宜，废液不污染环境。
但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液 的pH值在4.5～5.5之间，使用时多用浓氨水 调整到pH7左右。
四、盐析操作（以硫酸铵为例）
盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：
（1）加硫酸铵的饱和溶液：在实验室和小规模生产中， 或(NH4)2SO4 浓度不需太高时，可采用这种方式，它 可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。
沉淀方法
改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂
第三节 盐析法
定义： 蛋白质在高离子强度的溶液
中溶解度降低、发生沉淀的 现象称为“盐析”。
两种现象：
盐溶：低盐情况，盐离子强 度的增高，蛋白质溶解度 增大。
盐析：高盐，盐离子强度增 加，蛋白质溶解度减小。
logS
沉淀的分类
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
⑴ 中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶 的分离纯化。 ⑵ 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸 以及生物小分子的分离纯化。 ⑶ 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多 用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂 蛋白。
⑷ 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物 质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合 使用。 ⑸ 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为 沉淀剂。
⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃 至几千种化合物。
⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离 纯化的步骤繁多，流程长。
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时 就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活， 就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各 种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
胶体的定义
胶体是一种尺寸在1～100 nm以 至1000 nm的分散体。它既非大 块固体，又不是分子分散的液体， 而是具有两相的微不均匀分散体 系。
-《被遗忘了尺寸的世界》
Wilhelm Friedrich Ostwald (1853 – 1932)
蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球 体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成 的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体 颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的 凝聚和絮凝现象相似。
蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、 构象以及分子周围的环境所决定。
一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分 子蛋白质更易溶解。
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell) 可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。
⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）
（2）直接加固体硫酸铵：工业上常采用这种方法，加 入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完 全溶解和防止局部浓度过高；
常用“饱和度”来表征硫酸铵在溶液中 的最终浓度，25℃时(NH4)2SO4的饱和浓度 为4.1 mol／L，定义它为100%饱和度。
盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据
盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用 较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以 高价阴离子更为明显。
PO4 3-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞I NH4+＞K+＞Na+＞Li+
盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵
(二）溶质（蛋白质等）种类的影响
log S
0.50 0
-0.50 -1.00
0
拟球蛋白
血清白 蛋白
碳氧肌 红蛋白
血纤维 蛋白原
碳氧血 红蛋白
2
4
6
8
10
μ
（三）蛋白质浓度的影响
在相同的盐析条件下，蛋
10
白质浓度越大越易沉淀，但蛋 9
白质的浓度愈高，其它蛋白质 8 7
的共沉作用也愈强，从而使分 6
dS dP
-
辨率降低，
5
4
30g/L 3g/L
3
2
1
0 40
④以饱和 度为横坐 标，上清 液中总蛋 白和目标 蛋白浓度 为纵坐标， 得到蛋白 质溶解度 曲线
第三节 有机溶剂沉淀法
定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶 剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离 纯化方法。
一、有机溶剂沉淀法的原理和特点 原理
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎片分离
路线一A
溶解(加盐酸胍、脲)
粗分离(盐析、萃取、超过滤等)
复性
纯化(层析、电泳)
脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
第一节 概述
与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备 有以下主要特点：
为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在 的。
DLVO理论
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗 粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势 垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现 为吸引位能。
沉淀策略及方法 策略
破坏蛋白质周围的水化层 降低双电层厚度（ζ电位）
★静电斥力 ★吸引力
蛋白质/胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似
蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要 是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是 电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质 表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。
吸引力
颗粒间的相互作用 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 Van der Waals 力 Keeson 引力（偶极力） Debye 引力 （诱导力） London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，因
基本概念
通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以 固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化 技术称为固相析出技术。
结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体时称为 结晶法。
沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体 时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶 剂沉淀法和等电点沉淀法等。
lgS lgS
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
pH6.6
2
25℃
1
1
0℃
o
25℃
2
3I
o
4
2
pH 7.43
7.17
6.05
6.80 6.60
3I
4
温度和pH对碳氧血红蛋白的磷酸盐盐析曲线的影响
I
三、盐析常用的盐
常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸钠、 氯化钠、磷酸钠、磷酸钾等。
（NH4）2SO4 最常用： ① 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，
这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常 是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下 （0～4℃）进行。由下表可以看到，（NH4）2SO4在 0℃时仍有70.6％的溶解度，远远高于其它盐类：
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃ 20℃ 80℃ 100℃
(NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103
◆沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况 下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为初 级分离技术加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉 淀分离得到目标产品的工业实例。
基本原理：
根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离 的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶 质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的 大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分 的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子 强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
β 2.5
2.0
1.5 S0
1.0
0.5
0
-0.5
-1.0
-1.5
123456 μ
应用：
蛋白质和酶分离提纯 多肽、多糖和核酸也可以用盐析法进行沉淀分
离 20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉
淀 43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，
而tRNA保留在上清。
一、盐析法的原理及特点 原理
I－一离子强度等于 I=1/2∑mizi2;
mi——离子 i的摩尔浓度；
Zi——所带电荷；
β——常数，与盐的种类无关，但与温度、pH和蛋白质种类有 关;
Ks——盐析常数，与温度和PH无关，但与蛋白质和盐的种类有 关。
用盐析法分离蛋白质的二种方法
⑴在一定的 pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即 离子强度）达到沉淀的目的，称为“Ｋs”分级盐 析法。
可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。 具体操作方法如下：
①取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分
离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH 值。
②计算饱和度达到20%-100%所需加入的硫酸铵量，
边搅拌边加入，放置1h以上，使沉淀达到平衡
盐析操作-溶解度曲线确定
③离心分 离沉淀物 并重新溶 解测定其 中总蛋白 和目标蛋 白的浓度
第二节 蛋白质的表面特性
蛋白质组成 20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水
性氨基酸和亲水性氨基酸 蛋白质折叠趋势
疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势 结果
在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残 基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区构成。
50
60
70
80
P
一般常将蛋白质浓度控制在2～3％为宜。
相当于25 mg/mL～30mg/mL。
（四）温度的影响：
2 pH6.6
温度的变化会影响值。
log S
在无盐或稀盐溶液中，大
1
0℃
多数蛋白质溶解度是随温
度升高而增大的，但在高
0
25℃
盐溶液中常相反。
2
3
4
μ
对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下 操作，以避免活力丧失。但有的蛋白质（如血红蛋 白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25℃）比 0℃时溶解度低，更容易盐析。
缺点
盐析法分辨率不高，适合于生化物质粗提纯 阶段，需和其它方法交替使用。
二、影响盐析的因素
（一）离子强度和类型
一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。 在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强 度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或 冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和 度，使另一种蛋白质组分盐析出来。
Na2SO4
4.9 18.9 43.3 42.2
NaH2PO4
1.6 7.8
93.8 101
② 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析， 一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
③ 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L的（NH4）2SO4保存 可达数年之久。
形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥 作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。
中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了 水化膜，使其沉淀。
Cohn方程式
现在常用 Cohn经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间 的关系：
㏒ S= β－ ＫsＩ 式中S——蛋白质的溶解度，g/L;
沉淀法的特点和应用
◆沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用 于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分 离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用 的方法。
◆通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分 相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；
◆沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存 或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的， 即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。
（Ks盐析：固定pH, 温度，改变盐浓度）
⑵在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达 到沉淀的目的，称为“β”分级盐析法。
（β盐析：固定离子强度，改变pH及温度。）
当离子强度较高时，溶解度的对数与离子 强度呈线性关系
优点
①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用，不易引起 蛋白质变性
（五）PH的影响：
蛋白质所带净电荷越多，
8
β
７
它的溶解度就越大。改变pH
６
值可改变蛋白质的带电性质，
５
因而就改变了蛋白质的溶解
４
OA-卵清蛋白
COHb-碳氧血红蛋白 OA
度。
３
COHb
3 4 5 67８
以磷酸盐沉淀COHb和以硫酸铵
沉淀OA时，β随 pH的变化
在等电点处溶解度小（值最小）。
因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该 蛋白质的等电点附近
④ 价格便宜，废液不污染环境。
但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液 的pH值在4.5～5.5之间，使用时多用浓氨水 调整到pH7左右。
四、盐析操作（以硫酸铵为例）
盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：
（1）加硫酸铵的饱和溶液：在实验室和小规模生产中， 或(NH4)2SO4 浓度不需太高时，可采用这种方式，它 可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。
沉淀方法
改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂
第三节 盐析法
定义： 蛋白质在高离子强度的溶液
中溶解度降低、发生沉淀的 现象称为“盐析”。
两种现象：
盐溶：低盐情况，盐离子强 度的增高，蛋白质溶解度 增大。
盐析：高盐，盐离子强度增 加，蛋白质溶解度减小。
logS
沉淀的分类
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
⑴ 中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶 的分离纯化。 ⑵ 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸 以及生物小分子的分离纯化。 ⑶ 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多 用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂 蛋白。
⑷ 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物 质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合 使用。 ⑸ 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为 沉淀剂。
⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃 至几千种化合物。
⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离 纯化的步骤繁多，流程长。
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时 就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活， 就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各 种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
胶体的定义
胶体是一种尺寸在1～100 nm以 至1000 nm的分散体。它既非大 块固体，又不是分子分散的液体， 而是具有两相的微不均匀分散体 系。
-《被遗忘了尺寸的世界》
Wilhelm Friedrich Ostwald (1853 – 1932)
蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球 体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成 的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体 颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的 凝聚和絮凝现象相似。
蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、 构象以及分子周围的环境所决定。
一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分 子蛋白质更易溶解。
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell) 可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。
⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）
（2）直接加固体硫酸铵：工业上常采用这种方法，加 入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完 全溶解和防止局部浓度过高；
常用“饱和度”来表征硫酸铵在溶液中 的最终浓度，25℃时(NH4)2SO4的饱和浓度 为4.1 mol／L，定义它为100%饱和度。
盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据
盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用 较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以 高价阴离子更为明显。
PO4 3-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞I NH4+＞K+＞Na+＞Li+
盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵
(二）溶质（蛋白质等）种类的影响
log S
0.50 0
-0.50 -1.00
0
拟球蛋白
血清白 蛋白
碳氧肌 红蛋白
血纤维 蛋白原
碳氧血 红蛋白
2
4
6
8
10
μ
（三）蛋白质浓度的影响
在相同的盐析条件下，蛋
10
白质浓度越大越易沉淀，但蛋 9
白质的浓度愈高，其它蛋白质 8 7
的共沉作用也愈强，从而使分 6
dS dP
-
辨率降低，
5
4
30g/L 3g/L
3
2
1
0 40
④以饱和 度为横坐 标，上清 液中总蛋 白和目标 蛋白浓度 为纵坐标， 得到蛋白 质溶解度 曲线
第三节 有机溶剂沉淀法
定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶 剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离 纯化方法。
一、有机溶剂沉淀法的原理和特点 原理