生物工程下游技术 第四章节 沉淀法文档

胶体的定义
胶体是一种尺寸在1～100 nm以 至1000 nm的分散体。它既非大 块固体，又不是分子分散的液体， 而是具有两相的微不均匀分散体 系。
-《被遗忘了尺寸的世界》
Wilhelm Friedrich Ostwald (1853 – 1932)
蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球 体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成 的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体 颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的 凝聚和絮凝现象相似。
lgS lgS
2
pH6.6
2
25℃
1
1
0℃
o
25℃
2
3I
o
4
2
pH 7.43
7.17
6.05
6.80 6.60
3I
4
温度和pH对碳氧血红蛋白的磷酸盐盐析曲线的影响
I
三、盐析常用的盐
常用的盐析用盐主要有硫酸铵、硫酸钠、 氯化钠、磷酸钠、磷酸钾等。
（NH4）2SO4 最常用： ① 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，
形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥 作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。
中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了 水化膜，使其沉淀。
Cohn方程式
现在常用 Cohn经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间 的关系：
㏒ S= β－ ＫsＩ 式中S——蛋白质的溶解度，g/L;

第二节 蛋白质的表面特性
蛋白质组成 20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水
性氨基酸和亲水性氨基酸 蛋白质折叠趋势
疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势 结果
在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残 基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区
蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区构成。
-0.50 -1.00
0
拟球蛋白
血清白 蛋白
碳氧肌 红蛋白
血纤维 蛋白原
碳氧血 红蛋白
2
4
6
8
10
μ
（三）蛋白质浓度的影响
在Байду номын сангаас同的盐析条件下，蛋
10
白质浓度越大越易沉淀，但蛋 9
白质的浓度愈高，其它蛋白质 8 7
的共沉作用也愈强，从而使分 6
dS dP
-
辨率降低，
5
4
30g/L 3g/L
3
2
1
0 40
Na2SO4
4.9 18.9 43.3 42.2
NaH2PO4
1.6 7.8
93.8 101
② 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析， 一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
③ 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L的（NH4）2SO4保存 可达数年之久。
（Ks盐析：固定pH, 温度，改变盐浓度）
⑵在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达 到沉淀的目的，称为“β”分级盐析法。
（β盐析：固定离子强度，改变pH及温度。）
当离子强度较高时，溶解度的对数与离子 强度呈线性关系
优点
①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用，不易引起 蛋白质变性
I－一离子强度等于 I=1/2∑mizi2;

mi——离子 i的摩尔浓度；

Zi——所带电荷；

β——常数，与盐的种类无关，但与温度、pH和蛋白质种类有 关;
Ks——盐析常数，与温度和PH无关，但与蛋白质和盐的种类有 关。
用盐析法分离蛋白质的二种方法
⑴在一定的 pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即 离子强度）达到沉淀的目的，称为“Ｋs”分级盐 析法。
沉淀方法
改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂
第三节 盐析法
定义： 蛋白质在高离子强度的溶液
中溶解度降低、发生沉淀的 现象称为“盐析”。
两种现象：
盐溶：低盐情况，盐离子强 度的增高，蛋白质溶解度 增大。
盐析：高盐，盐离子强度增 加，蛋白质溶解度减小。
logS
蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、 构象以及分子周围的环境所决定。
一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分 子蛋白质更易溶解。
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell) 可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。
⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）
为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在 的。
DLVO理论
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗 粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势 垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现 为吸引位能。
沉淀策略及方法 策略
破坏蛋白质周围的水化层 降低双电层厚度（ζ电位）
（2）直接加固体硫酸铵：工业上常采用这种方法，加 入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完 全溶解和防止局部浓度过高；
常用“饱和度”来表征硫酸铵在溶液中 的最终浓度，25℃时(NH4)2SO4的饱和浓度 为4.1 mol／L，定义它为100%饱和度。
盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据
β 2.5
2.0
1.5 S0
1.0
0.5
0
-0.5
-1.0
-1.5
123456 μ
应用：
蛋白质和酶分离提纯 多肽、多糖和核酸也可以用盐析法进行沉淀分
离 20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉
淀 43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，
而tRNA保留在上清。
一、盐析法的原理及特点 原理
缺点
盐析法分辨率不高，适合于生化物质粗提纯 阶段，需和其它方法交替使用。
二、影响盐析的因素
（一）离子强度和类型
一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。 在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强 度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或 冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和 度，使另一种蛋白质组分盐析出来。
④ 价格便宜，废液不污染环境。
但硫酸铵具腐蚀性且缓冲能力差，饱和溶液 的pH值在4.5～5.5之间，使用时多用浓氨水 调整到pH7左右。
四、盐析操作（以硫酸铵为例）
盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式：
（1）加硫酸铵的饱和溶液：在实验室和小规模生产中， 或(NH4)2SO4 浓度不需太高时，可采用这种方式，它 可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。
可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。 具体操作方法如下：
①取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分
离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH 值。
②计算饱和度达到20%-100%所需加入的硫酸铵量，
边搅拌边加入，放置1h以上，使沉淀达到平衡
盐析操作-溶解度曲线确定
③离心分 离沉淀物 并重新溶 解测定其 中总蛋白 和目标蛋 白的浓度
◆沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况 下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为初 级分离技术加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉 淀分离得到目标产品的工业实例。
基本原理：
根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离 的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶 质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的 大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分 的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子 强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
④以饱和 度为横坐 标，上清 液中总蛋 白和目标 蛋白浓度 为纵坐标， 得到蛋白 质溶解度 曲线
第三节 有机溶剂沉淀法
定义：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶 剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离 纯化方法。
一、有机溶剂沉淀法的原理和特点 原理
沉淀法的特点和应用
◆沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用 于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分 离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用 的方法。
◆通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分 相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；
◆沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存 或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的， 即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。
（五）PH的影响：
蛋白质所带净电荷越多，
8
β
７
它的溶解度就越大。改变pH
６
值可改变蛋白质的带电性质，
５
因而就改变了蛋白质的溶解
４
OA-卵清蛋白
COHb-碳氧血红蛋白 OA
度。
３
COHb
3 4 5 67８
以磷酸盐沉淀COHb和以硫酸铵
沉淀OA时，β随 pH的变化
在等电点处溶解度小（值最小）。
因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该 蛋白质的等电点附近
⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃 至几千种化合物。
⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离 纯化的步骤繁多，流程长。
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时 就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活， 就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各 种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
沉淀的分类
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：