第二章植物组织培养基本操作

教学目的：了解植物组织培养培养的培养基种类、成分及其特点，学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条件，以及炼苗移栽基本方法。

职业技能教学点：具有植物组织培养基本操作程序的认知。

能够识别各类培养基特点，熟悉MS培养基成分；具有制作培养基能力，具有选择外植体、表面灭菌、无菌接种等基本能力；具有植物组织培养条件控制基本能力；有进行组培苗驯化练苗的基本能力。

教学时间：10学时教学重点：各类培养基特点，固体培养基制作，外植体的选择及表面灭菌，外植体培养条件，组培苗驯化原则及常规移栽方法。

教学难点：各类培养基特点，培养基制作及高压灭菌操作，外植体的表面灭菌，外植体培养中易出现的问题及其解决办法，试管苗的特点。

教学内容：第一节培养基成分、种类及特点植物生长必需16种基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。

离体培养条件下，各种元素主要从培养基中获得：H 和O来源于水，C来源于添加的糖类，其它矿质元素来源于组成培养基的无机盐。

培养基是根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。

一、培养基的成分不同植物组织器官所需要的营养条件不完全一样，培养基营养成分也有差异，但总的来说，培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调节剂三大基本组成成分。

1、无机盐类离体组织生长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两类：大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十-几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。

微量元素—植物所需元素的浓度小于10-5～10-7mol/L，Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。

除C、H、O外，其它矿质元素通常以一定浓度的无机化合物形式，按一定比例配制而成，溶于水中以离子态被吸收，N有硝态氮KNO3和铵态氮（NH4）2SO4两类提供。

2、有机化合物培养基中只有无机盐叫做基本培养基，为使培养物更好的生长，还需添加有机成分，常用有糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等。

⑴糖类离体培养物生长与发育不可缺少的有机成分，即作为碳源，又维持培养基的渗透压在1.5-4.1MPa。

多使用蔗糖，试管苗生长与繁殖浓度2-3%，幼胚培养4-6%，某些特殊培养中用8-10%。

细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖。

⑵维生素类参与酶的形成、蛋白质、脂肪代谢，明显的促进离体培养物的生长。

盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、生物素-VH、维生素C-Vc。

⑶肌醇促进糖的转化、维生素和激素的利用，对胚状体和芽的形成有良好影响。

用量一般50-100mg/L。

⑷腺嘌呤合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细胞分裂，促进芽的形成和生长。

⑸氨基酸蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。

⑹其它复合成分成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。

3、生长调节物质组织培养中常用：⑴生长素类-生长素主要促进细胞分裂的生长，促进细胞脱分化，有利于诱导愈伤组织的产生，生长素与细胞分裂素同时使用有协调作用，在离体培养分化调节中，生长素促进根的形成抑制芽的形成，液体培养中利于体细胞胚胎发生。

常用IAA、IBA、NAA、2,4-D。

⑵细胞分裂素类-促进细胞分裂和扩大，调解器官分化，延缓组织衰老，增强蛋白质合成，能改善其它激素作用，离体培养中，促进不定芽的发生，与生长素协调作用可有效控制培养物的生长与分化。

常用6-BA、ZT、KT、2iP。

⑶赤霉素类-促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠以及诱导单。

离体培养下，还与生长素协调作用性结实等生理功能。

目前主要是赤霉酸GA3对形成层分化有影响，刺激体细胞胚进一步发育成植株。

4、水一切生命活动不可缺少的重要成分，离体培养中，级是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。

天然水或自来水不能直接用于培养基配制，原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用双蒸水或超纯水，大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净水。

5、其它附加成分⑴琼脂来自海藻的多糖类物质，组织培养中最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支持物，常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。

⑵活性炭常用的吸附剂，某些培养类型中，可以吸附培养过程中产生的一些有毒物质，有利于培养物的生长。

常用浓度0.5%左右，其吸附作用选择性较差，常受温度影响，低温吸附效果好，高温吸附能力降低甚至解吸附。

二、常用培养基的种类、配方及特点（一）培养基种类1、根据态相分：固体培养基-加凝固剂的培养基液体培养基-不加凝固剂的培养基。

2、根据培养过程分：初代培养基-初次接种外植体的培养基。

继代培养基-接种初代培养之后培养物的培养基。

3、根据作用分：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基。

4、根据营养水平分：基本培养基、完全培养基。

（二）几种常用培养基、组织培养常用的基本培养基有：MS、MT、White、Nitsch、Blaydes、N6B、NT、SH、Miller、Heller等。

5（三）几种常见培养基的特点1、富盐平衡培养基无机盐浓度高，元素比例适当，离子平衡好，具有较强的缓冲性，培养中维持较好的稳定性，含高量氮、钾，营养丰富，元素种类齐全，MS培养基使用最广泛。

2、低盐培养基无机盐浓度低，有机成分含量低，多数作为生根培养基、胚胎培养使用，常用White培养基。

3、高硝态盐培养基较低铵盐，高硝酸盐和盐酸硫胺素B5培养基适合双子叶植物特别是木本植物的生长。

N6培养基为水稻等禾谷类花药培养设计，KNO3和（NH4）2SO4含量高,不含钼。

SH培养基 (NH4)H2PO4代替（NH4）2SO4,矿质浓度较高，多数单子叶和双子叶植物上使用较好。

4、中盐培养基大量元素无机盐为MS的1/2，微量元素种类减少含量增高，无肌醇维生素种类多，增加生物素、叶酸，有H、Hitsch、Miller、Blaydes等培养基，适用于特殊细胞培养。

第二节培养基的制备一、培养基母液的配制制作一升培养基所需药品20多种，在实际制作时如果每次制作都称量20多次，浪费时间和精力；同时每升培养基所用药品有的很少，如盐酸硫胺素只需0.025mg，即使是电子天平也不可能感量那么小的单位。

因此，为节省时间和配制的准确，需将各种药品浓缩成一定倍数，并且混合成一定母液，进行保存。

制作培养基时根据需制培养基数量取用母液。

（一）营养成分的配制根据药品性质将母液配制成以下四类：1、大量元素可以混在一起配制成10—20倍液，硫酸镁和氯化钙Ca２+和Mg2+会与磷酸盐混合，产生不溶性沉淀，要分别单独配制Ca２+与PO4-一起混合易沉淀，定容后消失。

2、微量元素可配成100—200倍混合母液，KI可单独配。

3、铁盐硫酸亚铁和EDTA钠盐易沉淀，需单独配制，配成100—200倍鳌合剂不易沉淀。

4、有机化合物维生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或200液，也可分别配制。

（二）植物生长调节物质的配制植物生长调节物质分别配成母液储于冰箱，浓度一般为0.5－1mg/ml。

1、IAA、NAA先用少量95%酒精使之充分溶解，2、2,4－D可用少量0.1mol/L的NaOH溶液充分溶解，再缓缓加蒸馏水定容至需要的体积。

3、KT和BA等细胞分裂素类，先用少量0.1mol/L 的HCl溶解，再用蒸馏水定容至需要的体积。

（三）药品用量的计算：配制母液时药品用量(mg)=配方用量(mg)×浓缩倍数×制备容量（L）（四）保存1、各类母液写上标签，标签上注明母液名称及制备1L培养基的母液取用量。

2、2-4℃冰箱保存。

二、培养基的制备配制好培养基母液后，要用于植物的离体培养，还需制作成一定的培养基质—培养基，才能进行植物的离体培养。

（一）母液取用量的计算制备培养基时母液取用量（ml）=1000÷浓缩倍数×制备培养基数量（L）（二）培养基制作程序1、按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分顺序将母液取出，混合。

2、适量蒸馏水放入加热容器，蒸馏水应少于所制培养基数量，约终体积的2/3-3/4，接通电源加热。

3、向加热容器中加入称量好的琼脂（0.6-0.8%），搅拌加热，至完全溶化。

4、琼脂熬化后，称取相应量的蔗糖（2-3%），加入加热容器中至溶解。

5、将母液混合液加入到加热容器中，混匀。

6、蒸馏水定容至所需体积。

7、测试培养基溶液的PH值(5.8-6.0)，过高滴加0.1mol/L的HCL调整，过低滴加0.1mol/L的NaOH调整。

8、迅速分装到培养瓶中，备用。

培养基是离体培养物赖以生存和生长的人工环境的重要组成部分，常用的培养基依据其物理状态的不同分为固态培养基和液态培养基。

固态培养基一般使用琼脂为凝固剂，也有使用卡拉胶或魔芋粉为凝固剂的。

液态培养基不使用凝固剂，但需要在容器中置入适当的支撑物，试管为培养容器的支撑物可用滤纸桥，底面积较大的培养容器，支撑物可选用脱脂棉以及某些性质稳定的高分子材料。

三、培养基及培养器械的灭菌制备好的培养基如果带菌，会导致植物离体培养失败，因而还要对培养基进行灭菌处理。

（一）高压蒸汽灭菌培养基的灭菌一般采用湿热灭菌法：1、培养瓶及培养器械放入高压灭菌锅。

2、灭菌锅加水至淹没电热丝3、封闭高压灭菌锅各出气口。

4、接通电源加压至49kPa（0.5MPa）5、打开排气阀，排冷气至压力为0 kPa。

6、继续加压至108kPa（1.1mPa-1.2Mpa，即121℃）7、当压力至108kPa（1.1mPa-1.2Mpa，即121℃）时，稳压在此压力15-20min。

8、关闭电源，自然冷却至压力为0 kPa。

9、取出培养基和器械冷却，贮存于30℃以下室内。

（二）干热灭菌培养瓶、三角瓶、试管等玻璃器皿及接种器械，可以进行干热灭菌。

即将洗涤干净的玻璃器皿放到烘箱中，在150℃温度下，干热灭菌1小时，或120℃下灭菌2小时。

灭菌完毕冷却后取出器械贮存。

贮存室要保持无菌、干燥、以免造成培养基的二次污染。

灭菌后的培养基一般应在2周内使用，时间过长易造成潜在的污染。

此外，培养基灭菌后如果出现过多沉淀或琼脂不凝固等现象，该培养基不能继续使用，应查明原因重新配制。

LAA、ZTA、BA及维生素遇热不稳定，有条件最好进行过滤灭菌。

第三节外植体无菌接种一般来说，无论何种类型的组织培养技术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种与培养等基本过程。

现在对这一共同过程进行介绍。

一、植物材料的培养与取材外植体—是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料，是植物离体培养的基础材料。

外植体来源的环境以及外植体的类型，均会影响将来培养的效果，而灭菌、接种和培养条件的选择与控制，也与外植体的来源和类型有关。