氨基酸含量测定
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
氨基酸含量测定
茚三酮比色测定氨基酸含量一、实验原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。
生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。
二、实验试剂（1）1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2▪H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。
滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。
（2）pH 8.04磷酸缓冲液：Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。
Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。
（3）氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。
三、实验方法及步骤（1）标准曲线绘制准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为 4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于90℃水浴上加热至显色恒定为止（该加热过程至少需要25分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。
静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A ；若生成的化合物呈黄色，则在350nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A 。
氨基酸含量测定
氨基酸含量测定一、前言氨基酸是构成蛋白质必不可少的基本单位，对于食品、药物等行业来说，氨基酸含量的测定是一项重要的质量控制工作。
氨基酸含量测定可以用于判断蛋白质的含量、质量以及不同品种之间的比较等方面。
因此，本文旨在介绍氨基酸含量测定的原理、方法及其在实际应用中的应用。
二、原理氨基酸含量测定的原理是利用氨基酸的吸光度和该氨基酸与特定试剂的反应，通过测定吸收光度计的吸光度来计算氨基酸的含量。
一般常见的试剂为二氧化硫，根据氧化剂配合体法，氨基酸与二氧化硫反应生成配位物，该配位物具有明显的吸收峰，通过测定这个吸收峰的强度来计算氨基酸的含量。
三、方法1.试剂和仪器试剂：1) 二氧化硫（SO2）2) 酸性亚硫酸钠（NaHSO3）3) 酸性氯化亚铜（CuCl2）溶液4) 氢氧化钠（NaOH）仪器：1) UV-Visible分光光度计2) 恒温取样器3) 小型离心机2.操作步骤样品的制备：1) 将样品细碎并过筛，取适量的样品称入瓶中；2) 加入1ml 6M HCl和氧化氢，使样品完全溶解；3) 将样品续滴2M NaOH至pH7~7.5。
标准溶液制备：将前列腺酸溶液定为含有氨基酸100μg/ml的标准溶液，并用氢氧化钠调至pH7~7.5。
反应溶液的制备：1) 取1ml标准溶液，加入2ml0.1M NaHSO3溶液，均匀混合；2) 加入0.05ml 0.3% w/v CuCl2溶液，混合，并加入2ml3M NaOH；3) 用恒温取样器将反应溶液恒温于37℃。
反应光谱测定：1) 以反应溶液A0的吸光度为零点，在325nm波长处记录各个样品的吸光度；2) 在温度控制下，对反应溶液建立光谱，以每分钟一个波长的扫描模式记录吸光度；3) 在反应6~8分钟时，将反应液离心，将清液移出，并过滤。
数据处理：得到的吸光度值（A）除以样品的光程，得到透过率（T），以此计算出氨基酸的含量。
四、应用氨基酸含量测定对于食品、药物等行业的质量控制非常重要。
氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）
氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）原理凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
仪器药品721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥研钵容量瓶移液管烧杯试管架试管0.2mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.0（见附表2）80%乙醇10mmol/L KCN：称取0.1638gKCN溶于蒸馏水中，稀释至250ml备用（注意：KCN剧毒！）KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液*：称取1.25g重结晶茚三酮溶于25ml 经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5%溶液。
将2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125ml充分混合。
然后将125mlKCN—乙二醇甲醚溶与25ml茚三酮－乙二醇甲醚溶液相混合，置试剂瓶待用，正常情况下应为浅黄色。
标准氨基酸溶液：称取亮氨酸20mg溶于10ml蒸馏水中，则得浓度为200μg/ml的母液。
上述所有试剂必须放在草酸保护的干燥器中，以免被空气中的NH3所污染。
乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的处理：将5g硫酸亚铁加在500g乙二醇甲醚中，振摇1─2小时。
过滤除去硫酸亚铁（若滤液混浊没有关系），再在蒸馏瓶中蒸馏，收集沸点121─125℃部分，此时应为透明无色液体。
KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液配制后必须隔夜才能应用。
配制后1星期内稳定，若超过1星期则灵敏度降低，不宜作定量。
茚三酮重结晶：即使AR级的茚三酮，由于保管不当，常带微红色，配成溶液后也带红色，影响比色测定，故需重结晶一次方可应用。
5g茚三酮溶于15ml热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，若溶液太稠不易操作，可酌量加水5─10ml，30分钟后用滤纸过滤，滤液放冰箱中过液，次晨即见微黄色结晶出现，过滤，再以1ml冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色试剂瓶中保存。
氨基酸含量的测定茚三酮比色法
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、 氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三 酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基 酸含量成正比，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
2. 实验材料、仪器与试剂 材料：酱油 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量 瓶，移液管，具塞刻度试管。 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、 磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴15min，取出冷却至室 温后加水至10mL刻度线，静置15min后，在570nm处测定吸光度， 以氨基酸含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
（3）样品测定
管号
8 9 10 11
样品溶液/mL 0 0.5 0.5 0.5
水/mL
1.6 1.1 1.1 1.1
3. 实验步骤
（1）样品的处理：准确吸取0.5mL酱油于100mL 烧杯中，加入5g活性炭和50mL蒸馏水，置于80℃ 水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣 清洗数遍，收集滤液于100mL容量瓶中，定容至 刻线，摇匀备用。
（2）标准曲线的绘制
管号
12 3 4 56 7
氨基酸标准溶液 /mL
求职应注意的礼仪求职时最礼貌的修饰是淡妆面试时最关键的神情是郑重无论站还是坐不能摇动和抖动对话时目光不能游弋不定要控制小动作不要为掩饰紧张情绪而散淡最优雅的礼仪修养是体现自然以一种修养面对两种结果必须首先学会面对的一种结果被拒绝仍然感谢这次机会因为被拒绝是面试后的两种结果之一
实验九 氨基酸含量的测定 （茚三酮比色法）
各是什么？
0 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
叶面肥标准—氨基酸含量的测定
1氨基酸含量的测定原理试样用磺基水杨酸沉淀蛋白质后，用EDTA络合金属元素释放氨基酸，各种氨基酸经分离后分别与茚三酮显色，在pH2.2条件下用氨基酸自动分析仪测定各种氨基酸含量，各种氨基酸的总和，即为氨基酸叶面肥料氨基酸的含量。
1.1试剂（1）混合氨基酸标准液（仪器制造公司出售），0.00250mol/L。
（2）乙二胺四乙酸二钠溶液（EDTA）溶液：1%溶液，称1gEDTA溶于100mL 水中。
（3）磺基水杨酸溶液：称取5g磺基水杨酸溶于100mL水中。
（4）盐酸。
（5）盐酸溶液：0.06mol/L。
（6）氢氧化钠溶液：称取50g氢氧化钠溶于100mL水中。
（7）PH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）和16.5mL盐酸1.1.(4)加水稀释到1000mL，用盐酸和氢氧化钠溶液1.1.（6）调节PH 至2.2。
（8）PH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL盐酸1.1.(4)加水稀释至1000mL，用盐酸1.1.(4)和氢氧化钠1.1.(6)调节PH至3.3。
（9）PH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL盐酸1.1.(4)加水稀释至1000mL，用盐酸1.1.(4)和氢氧化钠1.1.(6)调节PH至4.0。
（10）PH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释至1000mL，用盐酸1.1.(4)和氢氧化钠1.1.(6)调节PH至6.4。
（11）茚三酮溶液：a)PH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiO H〃H2O）168g，加入冰乙酸（优级纯）279g，加水稀释到1000mL，用盐酸1.1.(4)和氢氧化钠1.1.(6)调节PH到5.2。
b）茚三酮溶液：称取150mL二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液a）50mL 加4g水合茚三酮（C9H4O 3·H2O）和0.12g还原茚三酮（C18H10O 6·2H2O）搅拌至完全溶解。
氨基酸测定
茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3 mmol/L 溶液（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取0.5g 茚三酮，用12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将0.5g 维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。
测定氨基酸的方法以及试剂
一采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸1.氨基酸测定原理：食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。
2.测定氨基酸所用仪器:真空泵;恒温干燥箱;水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30mL。
用去离子水冲洗干净并烘干;真空干燥器(温度可调节);氨基酸自动分析仪。
3.测定氨基酸所用试剂及其配制方法:3.1试剂：全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。
浓盐酸(优级纯);苯酚(须重蒸馏); 混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售)：0.00250mol/L; 不同pH值柠檬酸钠缓冲液；氢氧化锂(LiOH·H2O)；冰乙酸(优级纯)；二甲基亚砜(C2H6OS)；水合茚三酮(C9H4O3·H2O)；还原茚三酮(C18H10O6·2H2O);NaOH；高纯氮气（纯度99.99%）；冷冻剂：市售食盐与冰按1∶3混合。
3.2试剂配制方法：3.2.1. 6mol/L盐酸∶浓盐酸(3.1)与水1∶1混合而成。
3.2.2. pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)和16.5mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。
pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.3。
pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。
3.2.3. 茚三酮溶液pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至5.2。
测定氨基酸的方法以及试剂
一采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸1.氨基酸测定原理：食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。
2.测定氨基酸所用仪器:真空泵;恒温干燥箱;水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30mL。
用去离子水冲洗干净并烘干;真空干燥器(温度可调节);氨基酸自动分析仪。
3.测定氨基酸所用试剂及其配制方法:3.1试剂：全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。
浓盐酸(优级纯);苯酚(须重蒸馏); 混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售)：0.00250mol/L; 不同pH值柠檬酸钠缓冲液；氢氧化锂(LiOH·H2O)；冰乙酸(优级纯)；二甲基亚砜(C2H6OS)；水合茚三酮(C9H4O3·H2O)；还原茚三酮(C18H10O6·2H2O);NaOH；高纯氮气（纯度99.99%）；冷冻剂：市售食盐与冰按1∶3混合。
3.2试剂配制方法：3.2.1. 6mol/L盐酸∶浓盐酸(3.1)与水1∶1混合而成。
3.2.2. pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)和16.5mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。
pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.3。
pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。
3.2.3. 茚三酮溶液pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至5.2。
氨基酸测定方法
氨基酸测定方法一、引言氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，对于生命体的生长和发育起着重要的作用。
因此，准确测定氨基酸的含量和组成对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。
本文将介绍一些常用的氨基酸测定方法，包括色谱法、光谱法和化学法等。
二、色谱法测定氨基酸2.1 气相色谱法气相色谱法是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。
该方法通过将氨基酸样品转化为易挥发的衍生物，然后使用气相色谱仪进行分析。
气相色谱法具有分离效果好、灵敏度高和操作简便等优点。
2.1.1 衍生化反应在气相色谱法中，常用的氨基酸衍生化反应包括酯化、酰化和取代反应等。
这些反应能够将氨基酸转化为易挥发的衍生物，便于后续的气相色谱分析。
2.1.2 气相色谱仪气相色谱仪是进行气相色谱分析的关键设备。
它由进样系统、色谱柱和检测器等部分组成。
进样系统用于将样品引入色谱柱，色谱柱用于分离氨基酸衍生物，检测器用于检测分离后的化合物。
2.2 液相色谱法液相色谱法也是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。
该方法通过将氨基酸样品溶解在溶剂中，然后使用液相色谱仪进行分析。
液相色谱法具有分离效果好、灵敏度高和选择性强等优点。
2.2.1 色谱柱选择在液相色谱法中，选择合适的色谱柱对于分离氨基酸非常重要。
常用的色谱柱包括离子交换柱、反相柱和手性柱等。
不同的色谱柱具有不同的分离机理和选择性，可以根据需要选择合适的色谱柱。
2.2.2 梯度洗脱条件在液相色谱法中，通过调整洗脱溶剂的组成和流速等参数，可以实现对氨基酸的有效分离。
梯度洗脱条件可以根据氨基酸的亲水性和极性等特性进行优化。
三、光谱法测定氨基酸3.1 紫外-可见光谱法紫外-可见光谱法是测定氨基酸含量和组成的常用方法之一。
该方法通过测量氨基酸在紫外-可见光波段的吸收特性，来推断其含量和组成。
紫外-可见光谱法具有操作简便、灵敏度高和选择性强等优点。
3.1.1 吸收峰特征不同氨基酸在紫外-可见光谱中具有不同的吸收峰特征。
通过测量氨基酸的吸收峰强度和位置，可以推断其含量和组成。
植物组织内氨基酸组分和含量的测定
植物组织内氨基酸组分和含量的测定
植物组织内氨基酸组分和含量的测定方法主要有以下几种：
1. 纸层析法：首先将样品裂解提取，然后取一小部分样品在纸层析板上进行分离，根据氨基酸的pKa值和亲疏水性特征，通过比色法测定各氨基酸的含量。
2. 比色法：可利用具有特异性反应的氨基酸检测试剂在一定条件下，与氨基酸发生瞬时化学反应生成显色化合物，然后通过光度计测定各氨基酸的含量。
3. 气相色谱法：首先将样品裂解提取并酸水解成甲酯化产物，然后通过气相色谱仪进行分离和检测。
以上三种方法根据实验需要选择其中的一种或多种进行使用。
通过这些方法可以测定植物组织中各种氨基酸的组成及其含量，为了获得较准确的结果，需要在实验操作中严格按照相关要求执行。
氨基酸分析仪法测定氨基酸含量
• 评价作物的营养品质，指导作物育种和栽培
• 检测农作物中的氨基酸代谢产物，研究作物生长和抗逆性
检测农业生产中的肥料和饲料
• 测定肥料和饲料中的氨基酸含量，评估肥料和饲料的营养价值
• 检测肥料和饲料中的氨基酸代谢产物，评估肥料和饲料的使用效果
谢谢观看
THANK YOU FOR WATCHING
• 通过输液泵和色谱柱实现氨基酸的分离
• 使用检测器检测氨基酸的荧光或紫外吸收信号
⌛️
数据处理
• 使用计算机和软件处理实验数据
• 计算氨基酸的含量和相对含量
• 生成实验报告，总结实验结果
03
氨基酸分析仪法的实验操作
样品前处理及氨基酸提取
样品前处理
氨基酸提取
• 研磨样品，使其均匀分散
• 使用醋酸钠或醋酸铵溶液沉淀氨基酸
氨基酸分析仪法在食品检测中的应用
测定食品中的氨基酸含量
检测食品中的食品添加剂
• 评价食品的营养价值，指导食品配方和加工
• 测定食品添加剂中的氨基酸含量，评估食品添加剂的安
• 检测食品中的氨基酸代谢产物，评估食品的新鲜度和品
全性
质
• 检测食品添加剂中的氨基酸代谢产物，评估食品添加剂
的使用效果
氨基酸分析仪法在生物医药领域的应用
谢产物，评估食品的新鲜
度和品质
农业领域
• 测定农作物中的氨基酸
生物医药领域
含量，评价作物的营养品
质
• 检测农作物中的氨基酸
代谢产物，研究作物生长
和抗逆性
• 测定生物体液中的氨基
酸含量，评价生理功能和
疾病状态
• 检测生物组织中的氨基
氨基酸含量的测定
氨基酸含量的测定标准曲线绘制准确吸取200ug/ml的氨基酸标准溶液0.0，0.6，0.8，1.0,1.2，1.5，2.0 ml，分别置于25ml容量瓶或比色管中，各加水补充至溶剂为4.0ml，然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各1ml，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，再摇匀，加水至标线25ml，摇匀。
静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液夨订其余各溶液的吸光度A。
以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
样品的测定：将虾研磨冷却过滤后稀释10倍，吸取澄清的样品溶液1.5ml，平行三次，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，用测得的A值在标准曲线上即可查得氨基酸的微克数。
公式：氨基酸总量（ug/100g）=(c/m*1000)*100*10式中c是指从标准曲线上查得的氨基酸的ug数；M是指测定的样品溶液相当于样品的质量g；PH计酸度计测量ph的方法：(1)拿下笔帽(2)按on/off键，机器显示运作(3)将ph计放入待测液中(4)轻轻晃动ph计，保证内气泡逸出，使之于溶液充分接触，勿碰撞杯壁(5)ph计会立即显示数值，将笔置入待测液待数值稳定，30秒内将显示正确数值，(特：ph计数值上下浮动或不稳定是正常现象)(6)按hold键锁定数值，可在待测溶液外记录读取，继续按hold键解除锁定(7)按on/off键关闭ph计(8)轻甩PH计测试笔上多于的水，用蒸馏水或脱离子水冲洗，盖上笔帽测量温度方法在测试模式下，温度数值与ph数值同步显示在液晶面板上，但在校准模式下不显示，数值默认为摄氏温度。
（一）挥发性盐基氮（TVB-N）的测定半微量定氮法（1）原理：蛋白质在酶和细菌的作用下分解后产生碱性含氮物质，有氨、伯胺、仲胺等，此类物质具有挥发性，可在碱性溶液中被蒸馏出来，用标准酸滴定，计算含量。
（2）试剂①氧化镁混悬液(10g/L) 称取1.0g氧化镁，加100ml水，振摇成混悬液。
(整理)氨基酸含量的测定
氨基酸含量的测定标准曲线绘制准确吸取200ug/ml的氨基酸标准溶液0.0，0.6，0.8，1.0,1.2，1.5，2.0 ml，分别置于25ml容量瓶或比色管中，各加水补充至溶剂为4.0ml，然后加入茚三酮和磷酸缓冲溶液各1ml，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，再摇匀，加水至标线25ml，摇匀。
静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液夨订其余各溶液的吸光度A。
以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。
样品的测定：将虾研磨冷却过滤后稀释10倍，吸取澄清的样品溶液1.5ml，平行三次，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，用测得的A值在标准曲线上即可查得氨基酸的微克数。
公式：氨基酸总量（ug/100g）=(c/m*1000)*100*10式中c是指从标准曲线上查得的氨基酸的ug数；M是指测定的样品溶液相当于样品的质量g；PH计酸度计测量ph的方法：(1)拿下笔帽(2)按on/off键，机器显示运作(3)将ph计放入待测液中(4)轻轻晃动ph计，保证内气泡逸出，使之于溶液充分接触，勿碰撞杯壁(5)ph计会立即显示数值，将笔置入待测液待数值稳定，30秒内将显示正确数值，(特：ph计数值上下浮动或不稳定是正常现象)(6)按hold键锁定数值，可在待测溶液外记录读取，继续按hold键解除锁定(7)按on/off键关闭ph计(8)轻甩PH计测试笔上多于的水，用蒸馏水或脱离子水冲洗，盖上笔帽测量温度方法在测试模式下，温度数值与ph数值同步显示在液晶面板上，但在校准模式下不显示，数值默认为摄氏温度。
（一）挥发性盐基氮（TVB-N）的测定半微量定氮法（1）原理：蛋白质在酶和细菌的作用下分解后产生碱性含氮物质，有氨、伯胺、仲胺等，此类物质具有挥发性，可在碱性溶液中被蒸馏出来，用标准酸滴定，计算含量。
（2）试剂①氧化镁混悬液(10g/L) 称取1.0g氧化镁，加100ml水，振摇成混悬液。
氨基酸的含量测定方法
氨基酸的含量测定方法
氨基酸的含量可以用不同的方法进行测定，以下是其中几种常用的方法：
1. 紫外吸收法（UV法）：氨基酸分子中存在芳香族环和烯烃键，可以吸收紫外光，根据吸收的强度来确定氨基酸的浓度。
2. 高效液相色谱法（HPLC法）：这是一种常用的测定氨基酸含量的方法，通过将样品中的氨基酸溶解后注入液相色谱仪中，利用氨基酸在不同条件下的保留时间和峰面积来测定其含量。
3. 伯里特法：伯里特试剂能与氨基酸发生比色反应，该方法适用于测定含有酪蛋白、皮质素等色泽较重的氨基酸的含量。
4. 显色法：该方法将氨基酸和特定试剂反应，生成显色产物，根据产物的颜色深浅来测定氨基酸含量。
常用的显色试剂有二。
氨基酸含量测定
茚三酮比色测定氨基酸含量一、实验原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。
生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。
二、实验试剂（1）1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2▪H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。
滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。
（2）pH 8.04磷酸缓冲液：Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。
Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。
（3）氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。
三、实验方法及步骤（1）标准曲线绘制准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为 4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于90℃水浴上加热至显色恒定为止（该加热过程至少需要25分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。
静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A ；若生成的化合物呈黄色，则在350nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A 。
简述血液中氨基酸含量的测定方法
简述血液中氨基酸含量的测定方法摘要：氨基酸是组成蛋白质的基本物质，当人体出现病理性改变，血液中的氨基酸含量也会随之变化，因此具有一定的诊断价值。
本文综合现有研究报道，阐述了毛细管电泳法、色谱法、仪器法在血液中氨基酸含量测定中的应用，以供同业人员参考。
关键词：血液；氨基酸；理化性质；测定方法血液中的氨基酸，主要来源于三个途径：一是蛋白质消化吸收形成，二是体内组织蛋白降解产生，三是机体合成的非必须氨基酸。
在人体代谢过程中，氨基酸能合成组织蛋白质，变为含氨物质、碳水化合物和脂肪，氧化后为机体提供能量[1]。
从目前研究看，血液中的氨基酸种类较多，且处于稳定状态，测定其含量有助于对疾病进行早期诊断，为后续治疗干预提供数据支持。
1．毛细管电泳法测定血液中的氨基酸含量毛细管电泳，是用具有弹性的毛细管作为分离通道，在高压直流电场的驱动下促使液相分离，优点在于速度快、效率高，在氨基酸检测中应用广泛。
另外，该方法的缺点在于进样量少，因此制备能力差；毛细管的直径小，导致灵敏度较低；而且电渗会影响分离重现性。
为了弥补这些缺点，有学者提出毛细管电泳-质谱联用法，仅需要较少的血液样本，就能对蛋氨酸、谷氨酸、高半胱氨酸、半胱氨酸进行定量检测，不仅检测结果准确，而且重现性较好[2]。
2．色谱法测定血液中的氨基酸含量2.1 气相色谱法气相色谱法使用气体作为流动相，样品组分在固定相和流动相之间，能瞬间达到平衡状态，具有分离效率高、分析速度快的优点。
该方法测定血液中的氨基酸，要将其转变为易气化的衍生物。
国外学者研究称，对血样中的氨基酸先使用甲醇溶液酯化，再加入酸酐酰胺化，最后采用气相色谱法进行测定，其灵敏度高、分离时间短[3]。
但是，由于前处理步骤复杂，且衍生物的干扰因素多，因此实际工作中并不多见。
2.2 高效液相色谱法高效液相色谱法是对液相色谱法的改进，用液体作为流动相，在高压系统作用下流动相进入色谱柱，分离后完成检测，具有高效、高速、高灵敏度的特点。
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茚三酮比色测定氨基酸含量
一、实验原理
氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色或黄色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。
生成的蓝紫色或黄色化合物颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长分别为570nm或350nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。
二、实验试剂
（1）1.2%茚三酮溶液：称取茚三酮1g于盛有35mL热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2▪H2O），搅拌过滤（作防腐剂）。
滤液置冷暗处过夜，加水至50mL，摇匀备用。
（2）pH 8.04磷酸缓冲液：
Ⅰ、准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）4.5350g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀备用。
Ⅱ、准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）11.9380g于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转入500mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀备用。
Ⅲ、取上述配好的磷酸二氢钾溶液10.0mL与190mL磷酸氢二钠溶液混合均匀即为pH8.04的磷酸缓冲溶液。
（3）氨基酸标准溶液：准确称取干燥的氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100mL容量瓶中，用水稀释到标线，摇匀，准确吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中，加水到标线，摇匀，此为200μg/mL 氨基酸标准溶液。
三、实验方法及步骤
（1）标准曲线绘制
准确吸取200μg/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL （相当于0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分别置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为 4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，混合均匀，于90℃水浴上加热至显色恒定为止（该加热过程至少需要25分钟），取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。
静置15min后，若生成蓝紫色化合物，在570nm波长下，以试剂空白为
参比液测定其余各溶液的吸光度A ；若生成的化合物呈黄色，则在350nm 波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A 。
以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。
y = 0.000935x + 0.002679
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40 0.50
0.60 0.70
0100200300400
500600700光度值/A 氨基酸含量/μg
图1 350nm 波长下氨基酸与吸光度线性关系图（雷恩，2016）
（2）提取样品
称取1.0-2.0g 植物样品（新鲜样或干样），加5mL 10%醋酸，在研钵中研碎，用水洗移入100mL 容量瓶，水定容，过滤到三角瓶中，取滤液测定。
该样品提取液可继续用来测定可溶性蛋白质含量（考马斯亮蓝G-250法）
（3）样品测定
吸取澄清的样品溶液4mL ，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A 值，测得的A 值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。
（4）结果计算
氨基酸含量（μg /100g ）=
式中：
c —从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，μg ；
m —测定的样品溶液相当于样品的质量，g 。
四、说明及注意事项
（1）茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化，方法如下：取10g 茚三酮溶于40mL 热水中，加入1g 活性
炭，摇动1分钟，静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，装瓶备用。
（2）应控制反应溶液的pH才能得到重现性好的结果，反应液pH在6.2 - 6.4之间为宜，所加试液和缓冲液的量的比例可为2:1或1:1。
（3）要控制加热温度和时间，温度过高容易褪色，温度低发色不全。
沸水浴中加热发色快，但可能受热不均匀及容易褪色，可以降低温度（80℃），延长加热时间，使发色均匀。
也可以在烘箱中加热，105℃烘10分钟。
（4）茚三酮与氨基酸反应生成的颜色在1小时内稳定，浓度高时褪色较快，应在发色稳定、加水定容后，在半小时内比色。
（5）明显带色的试样，可以用活性炭脱色，但某些氨基酸（酪氨酸等）也被活性炭吸附，会使结果降低。
（6）茚三酮与氨、胺类、氨基糖类、尿素、蛋白质等也发生反应，这些物质会干扰测定。
（7）植物样品处理方法不同，游离氨基酸组成会有变化，应用分析结果时应说明样品处理。