新型钙调蛋白拮抗剂对CaM基因表达的影响

第14卷第1期2000年3月 山西师范大学学报(自然科学版)

Jour na l o f Sha nx i T eache r ′s U niv e rsity N atur al Science Editio n V o l.14No.1M a rch 2000收稿日期:1999-11-16作者简介:段江燕(1965-),女,山西师范大学生物系讲师,硕士.文章编号:1009-4490(2000)01-0058-04

新型钙调蛋白拮抗剂(EBB 、BB 、B 0)

对CaM 基因表达的影响

段江燕1,　张金红2

(山西师范大学生物系,山西临汾　041004;2.南开大学分子生物学研究所,天津　300071)

摘要:本文初步探讨了小檗胺(B 0)及其衍生物(EBB 胺BB )对Ca M 基因表达的影响.结果表明三种化合物不仅能拮抗Ca M 的调控功能,而且对Ca M 基因表达系统亦有抑制作用.为进一步探讨CaM 拮抗剂的分子机制具有一定的参考价值.

关键词:小檗胺;衍生物;拮抗剂;基因表达

中图分类号　Q 756 文献标识码:A

随着钙调蛋白(CaM )在细胞内多种生理功能被认识,人们对它在细胞周期和增殖过程中的调控作用也越来越重视.随后进行的CaM 拮抗剂对多种瘤株体外增殖的抑制作用更证明了CaM 参予细胞增殖过程[1]

.研究中普遍存在的问题有二方面,(1)专一性不强.一些已知的CaM 拮抗剂除能影响CaM 的调节功能外,对非Ca M 调节的靶体亦有抑制作用;(2)Ca M 受抑制部位尚不明.即Ca M 拮抗剂拮抗Ca M 是在DN A 水平还是只拮抗CaM 的功能,至今尚无统一认识.因此大家努力寻找专一性强的CaM 拮抗剂用于抗肿瘤增殖的研究,以揭开拮抗剂抑制肿瘤细胞增殖的本质.

小檗胺类化合物是一种新型的钙调蛋白拮抗剂[2],酶学实验证明改性后的小檗胺衍生物拮抗CaM 的能力超过其母体小檗胺几倍至几十倍之多,且专一性系数增高[3].先期的细胞学实验结果表明小檗胺衍生物对脑恶性胶质瘤细胞[4]、人宫颈癌细胞[5]、腹小癌细胞以及黑色素瘤细胞等都有明显的抑制作用[6],且改性后的衍生物抑制肿瘤细胞增殖的作用比小檗胺强.此结果与酶学实验结果基本一致,说明这些化合物抑制细胞增殖与拮抗CaM 活性有关.为了进一步研究其可能的机理,我们以携带CaM 基因表达系统的大肠杆菌(Eco li k12U T481)为材料,观察了小檗胺(B 0)及其衍生物(BB 、EBB)对Ca M 表达的影响,其目的在于从分子水平探讨CaM 与肿瘤生长的关系,为Ca M 拮抗剂作为抗肿瘤药物应用的可行性提供科学依据.1　材料与方法

1.1　材料

小檗胺,北京东升制药厂;衍生物(BB 、EBB ),本室合成;携带CaM 基因表达系统的大肠杆菌(Eco li k 12U T481),来源:D ·M Ro berts 惠赠徐友涵老师;磷酸二酯酶:从牛心制备;钙调蛋白(Ca M):从牛脑制备,电泳均一纯;其他试剂均为国产或进口分析纯.

1.2　方法

1.2.1　小檗胺类化合物作用于大肠杆菌Eco li k 12U T 481生长曲线的制作　把携带CaM 基因的Eco li k 12UT 481播种于LB 培养基中(蛋白胨1%;酵母膏0.1%,牛肉膏0.5%,

Na Cl 0.5

%,p H =7.0～7.2)分为对照组和实验组,实验组中加入不同浓度的B 0、EBB 、BB ,于37

℃、140转/分摇床培养12小时,每隔2小时测OD 550,绘制其生长曲线,以确定小檗胺类化合物的用于基因表达的浓度范围.

1.2.2　高表达CaM 的大肠杆菌(Ecoli k 12U T 481)中CaM 水平的测定　E coli k 12U T 481播种在LB 培养基中,37℃,140转/分摇床上培养,分为对照组和实验组,待菌液的O D 550值为0.4—0.5时,实验组中加入不同浓度的B 0,BB,EBB,表达2小时后收集菌体,处理细胞进行CaM 含量测定,以对照组CaM 含量/总蛋白为100%,计算不同药物对CaM 基因表达的抑制率.

相对抑制率=(对照组-实验组)CaM 含量对照组CaM 含量

×100%1.2.3　CaM 含量测定

(1)细胞样品处理;

(2)PDE 法测CaM 含量.

3　结果与讨论

3.1　结果

B 0,EBB,BB 三种药物对Ecoli 生长曲线的影响如图1、2、3所示,结果表明:在本实验条件下,药物对Ecoli 的生长有一定的影响.但Eco li 在LB 培养基中培养6小时,B 0低于100μmo l /L 、BB 低于50μmo l /L 、EBB 低于20μm ol /L 时均不影响Eco li 正常生长,Eco li 一直处于对数生长期.因此选择上述浓度作为被检最高浓度

.

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第1期 段江燕　张金红:新型钙调蛋白拮抗剂(EBB 、BB 、B 0)对CaM 基因表达的影响

Ecoli 在LB 培养基中培养,当菌液中菌的密度达OD 550nm 0.4

—0.5时,加入不同浓度的B 0,BB ,EBB 继续培养表达2小时,用PDE 法测CaM 含量.实验发现B 0、BB 、EBB 对CaM 基因的表达都有一定的抑制作用(如图4,以对照组CaM 表达率为100%)表现出同种化合物浓度的增加,其抑制CaM 表达作用增强;不同化合物因其化学结构的不同表现出的抑制效果不同,100μmo l /L 的B 0其抑制率为30%;20μmol /L EBB 的抑制率为55%;50μm ol /L BB 的抑制率为50%,可见烷氧基化的小檗胺(EBB)和酰基化的小檗胺的抑制作用比小檗胺强.烷氧基化的EBB 与酰基化的BB 相比,EBB 作用更强

.

3.2　讨论

CaM 是存在于一切真核细胞中的多功能调节剂,为研究钙调蛋白拮抗剂拮抗CaM 的机理问题,我们选用了CaM 缺乏,具有简便、经济、高效等优点的原核Ecoli 表达系统进行研究分析,D.M Rober ts 等人于1985年将合成的Ca M 基因在大肠杆菌中进行了克隆和表达,并对该基因进行了序列分析和活性测定,其结果表明大肠杆菌表达系统中所表达的CaM 与牛脑CaM 对PDE 激活相似,为我们今天对CaM 基因表达调控的研究提供了方便.

在本实验条件下,CaM 基因在Ecoli 中能得到高效表达22%,钙调蛋白拮抗剂(EBB,B 0,BB)不仅拮抗CaM 的活性而且对CaM 基因表达系统亦有抑制作用.表现在带有CaM 基因的Ecoli 在LB 培养基中培养至OD 550在0.4—0.5时,加入药物立即进行CaM 测定,发现5μM 的EBB 可使CaM 表达率降低19%,20μm EBB 可使CaM 表达率降低26%,说明加入的药物与CaM 形成了复合物致使CaM 活性降低,在与药物一起培养2小时,CaM 的表达率发生改变,5μm,EBB 的CaM 表达率由19%降低至36%,20μm EBB 由26%降低至55%,可见除EBB 与CaM 形成复合物拮抗CaM 活性外,还有15%(5μm EBB)或29%(20μM EBB),使CaM 表达率降低的原因来源于抑制了CaM 基因表达系统,此作用结果使CaM 基因的转译受到影响,但具体是因为CaM 含量降低,而影响Ecoli 自身的DN A 复制和表达(包括Ca M 基因的表达);还是仅仅拮抗了携带的CaM 基因,致使体系内CaM 表达率降低的问题还有待于进一步的研究.尽管结果证明钙调蛋白拮抗剂对Ecoli Ca M 表达系统有一定影响,但由于真核细胞60

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