荧光分光光度法
荧光分光光度法
在生物、医药、环境和石油工业等诸多 领域，荧光分析法都有广泛的应用。不仅能 直接或间接地分析众多的有机化合物，而且 还能利用与有机试剂间的反应进行许多无机 元素的测定。
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随着科技的发展进步，荧光这种光致发 光（photoluminescence）的本质被进一步揭 开。
❖ 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外 和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不 同波长光的照射之后，同样也有发光现象。 例如：X-荧光、红外荧光等。
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a. 直接比较法
设CX、CS分别为试样和标样溶液的浓度， FX、FS和FX0、FS0分别为试样、标样的荧光 值和试样、标样的本底荧光值，因为
FX - FX0=KCX、 FS - FS0=KCS, 所以： Cx/Cs=( FX - FX0)/( FS - FS0) 或
Cx =Cs( FX - FX0)/( FS - FS0) 直接比较法简单快速，它要求被测样品 浓度与其相应的荧光值必须处于线性范围内。
光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶 液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧 光。
但是，在某些情况下，金属螯合物却能 产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的 测定。
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不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
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3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱
荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
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a. 激发光谱：选择并固定发射波长EM和狭 缝宽度S，让激发单色器进行波长扫描，记 录荧光强度（F）随激发波长的变化而变化 的关系曲线，叫激发光谱。
6. 荧光分光光度法
芴 φ= 1.0 C H 2
3,4-苯并芘
( 强荧光物质)
刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶
剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素
和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚 酞却没有。
取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和 刚性会加强荧光:
COOH COOH
水杨酸
O C OH OH
OH OH
荧光灵敏 度（最大 吸收波长） 0.066
喹啉硫酸氢盐 (0.05mol· L-1H2SO4) 罗丹明B （酒精） 荧光素 （0.1mol· L-1NaOH 四 溴 荧 光 素 （0.1mol· L-1NaOH
544
571
0.17
0.88
490
515
0.20
1.0
518
540
0.18
0.19
硫堇 (0.05mol· L-1H2SO4)
芳香族化合物。共轭双键结构有利于发光。 共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大.
─(CH=CH)2─
φ=0.28
─(CH=CH)3─
φ=0.68
（3） 刚性平面结构
-O O -O O C O
C
COO-
COO-
酚酞(无荧光)
荧光素
O
N Mg N O
N O-
8－羟基喹啉(弱荧光)
红色荧光
联二苯 φ= 0.2
仪 器 光 路 图
15:41:25
• 激发光源 要求发射强度大,波长范围宽,而且在整个 波长范围内强度一致.常用高压汞灯和氙弧 灯. • 滤光片和分光器 干涉滤光片;分光器多采用光栅 • 样品室 样品室由样品池及样品转换器组成.其中 样品池用石英或低荧光的玻璃材料.
荧光分光光度法
∴随T变大碰撞变多，无辐射去激活 的几率增大。Kc增大。 大量实验证实：大多数分子，随T升 高。Ф f会变小。
2）信息多: 激发分光光谱（信 息同于 UV）、发射光光谱的发 光强度、发光寿命、量子效率、 荧光偏振等多种信息 ,定性更好;
3）工作曲线的线性范围宽（定量 更准） 应用范围也广微量元素的 分析、医药、环境,石油工业等能 直接或间接分析众多的有机物
4）专一性强：许多物质的测定采 用间接法.
伯乐公司的Labeled DNA 的荧光标 记物 Labeling kits.
? 一般来说系内交换的几率愈 大小取决于：
? 最低能量受激单一态与三重 态的能量间隔愈小;
? 最低能量受激单一态的寿命 愈长 ,(即发射光子愈慢 ) 几 率愈大。
7）磷光 phosphorescence 受激三重态上的粒子回到单一态 基态的形式是被禁戒的 .但还是可 发生的 原因：寿命很长(10-3S)及Δ E小.
2.荧光分析法主要应用范围
1）生物技术的分析 ,免疫技术的分 析,如DNA、抗体、抗原等; 2）痕量元素的分析，如 70多种无 机元素； 3）间接测定众多的有机物，包括 药物。
荧光分析一般分为三种：
1.X射线荧光分析（X射线） 2.原子荧光分析（激光） 3.分子荧光分析（汞弧灯）
3.优势
1）灵敏度高：比 UV高2~~3个 数量级.
荧光分光光度法
Flourescence 一. 简介 :
二.荧光发光的原理 : 三.量子效率 :
四. 荧光发光光谱仪的构造： 五. 荧光的定量分析：
六. 荧光光度计的发展
简介
1.和UV异同点 2.荧光分析法主要
荧光分光光度法
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
荧光分析法实验报告
荧光分光光度法一、实验目的1、学习荧光分光光度法的基本原理；2、学习荧光光谱仪的结构和操作方法；3、学习激发光谱、发射光谱曲线的绘制方法。
二、实验原理荧光分光光度法（fluorescence spectroscopy, FS）通常又叫荧光分析法，具有灵敏度高、选择性强、所需样品量少等特点，已成为一种重要的痕量分析技术。
荧光（fluorescence）是分子吸收了较短波长的光（通常是紫外光和可见光），在很短的时间内发射出比照射光波长较长的光。
由此可见，荧光是一种光致发光。
任何荧光物质都有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum）和发射光谱（emission spectrum）或称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。
绘制激发光谱时，将发射单色器固定在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度对激发波长的关系曲线，即为激发光谱，其形状与吸收光谱极为相似。
荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。
绘制荧光光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即为荧光光谱。
激发光谱和荧光光谱可用于鉴别荧光物质，而且是选择测定波长的依据。
荧光强度（F）是表征荧光发射的相对强弱的物理量。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，即FKc该式即荧光分光光度法定量分析的依据。
使用时要注意该关系式只适用于稀溶液。
三、仪器与试剂F-4500荧光光谱仪；比色管（10mL）；牛血清白蛋白（BSA）四、实验内容1、开机准备：接通电源，启动电脑。
打开光谱仪主机电源，预热15分钟。
2、运行FL solution软件，设定检测方法和测量参数：EX（激发波长）：280nmEM（发射波长）：340nmEX扫描范围：210nm～330nmEM扫描范围：290nm～450nmEX缝宽：2.5nm，EM缝宽：2.5nm扫描速度：240nm/minPMT电压：700V3、激发光谱和发射光谱的绘制：先固定激发波长为280nm，在290～450nm测定荧光强度，获得溶液的发射光谱，在343nm附近为最大发射波长λem；再固定发射波长为λem，测定激发波长为200nm～λem 时的荧光强度，获得溶液的激发光谱，在280nm附近为最大激发波长λex。
荧光分光光度法
问题（ ） 问题（1）不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同？ 的荧光光谱形状是否相同？ （2）不同波长的光照射物质所产生的荧 ） 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度? 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度 单色器 I0 λex λem 单色器 检测器 I
表面吸 光物质
3、激发光谱：荧光λex不变时，记录荧光 、激发光谱：荧光 不变时， 强度F与激发波长之间的关系 与激发波长之间的关系。 强度 与激发波长之间的关系。
定性、 ③TLC定性、定量 定性
§2 原理 一、分子荧光产生 1、分子的电子能级： 、分子的电子能级：
C = C −C = C
ψ4 π*
π*
ψ3 ψ2 ψ1
π
π
三线态与单线态比较： 三线态与单线态比较： UV 基态单线态 ① 单线态 ②三线态
激发态 E2<E1 ，ε2<ε1， ② 的寿命可达 秒，而①的 的寿命可达1秒 寿命为10 跃迁几率① 寿命为 -8，跃迁几率①是②的106倍。
三、荧光与分子结构的关系 荧光物质发生荧光的过程： 荧光物质发生荧光的过程： A 荧光物质对光的吸收 B通过无辐射跃迁，跃迁到第一电子激发态 通过无辐射跃迁， 通过无辐射跃迁 的最低振动能级。 的最低振动能级。 C 跃迁至基态各振动能级 D 各振动能级分子，通过无辐射跃迁回基 各振动能级分子， 态的最低振动能级。 态的最低振动能级。
引起荧光熄灭的形式： 引起荧光熄灭的形式： 碰撞熄灭： 碰撞熄灭：由于碰撞而损失能量 化学淬灭：荧光物与加入的物质发生反应， 化学淬灭：荧光物与加入的物质发生反应， 生成新的化合物。 生成新的化合物。 体系间跨越：单线态变成三线态。 体系间跨越：单线态变成三线态。 自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生。 自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生。
荧光分光光度法
第二节 分子荧光强度的影响因素
一、荧光与有机化合物的结构
1. 跃迁的类型 对于有机荧光物质: 对于有机荧光物质: n →π* εmax＜ 100 平均寿命10 平均寿命10-5~10-7sec π→π* εmax≥104 平均寿命10 平均寿命10-7~10-9sec kS → T小 π*→π 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。 强荧光的有机化合物具备下特征: 强荧光的有机化合物具备下特征 具有大的共轭π键结构 键结构； ①具有大的共轭 键结构； 具有刚性的平面结构； ②具有刚性的平面结构； ③具有最低的单重电子激发态为S1为π * →π型； 具有最低的单重电子激发态为 型 取代基团为给电子取代基。 ④取代基团为给电子取代基。
4 3 2 1
S0
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
λex =290nm (MAX)
λ
λem= 620nm(MAX) 620nm(MAX)
2. 三维荧光光谱 I F ∝f (λex 、λem) 固定发射波长、扫描激发波长 固定发射波长、
1−
It = 1 −T = 1 − e−2.303εbC I0
I0 − It = I0 ( 1− e−2.303εbC )
荧光强度（ 与相应的吸光分数成正比： 荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：
IF =φ( I0 − It ) = φI0 ( 1− e−2.303εbC )
按照级数展开式： 按照级数展开式：
C. 激发光谱与发射 光谱的镜像关系
4 3 2 1
IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
荧光分光光度法测定维生素 B2的含量
荧光分光光度法测定维生素 B2的含量维生素B2（核黄素）是一种黄色的水溶性维生素，参与人体多种代谢过程，如能量代谢、蛋白质合成及细胞呼吸等。
因此，对维生素B2的含量进行精确测量至关重要。
本文将介绍一种常用的荧光分光光度法测定维生素B2含量的方法。
一、测定原理荧光分光光度法是一种基于物质吸收光谱和荧光光谱的仪器分析法，它利用物质在受激光或外界光源激发下，发生荧光的特性来测定物质的含量。
维生素B2在紫外光530.0nm 处吸收，同时能在pH8.0的碳酸氢钠缓冲溶液中产生荧光。
因此，荧光分光光度法可以通过测定维生素B2产生的荧光强度来计算其含量。
二、测定步骤1.准备样品将要测定的维生素B2溶于50mL的碳酸氢钠缓冲液中，并将其均匀混合。
用已知浓度的维生素B2标准品分别配制成不同浓度的标准溶液，用于绘制标准曲线。
2.测定荧光光谱取适量的样品及标准溶液分别装入荧光分光光度计的比色皿中，然后在含有Excitation (Ex)波长为450.0nm、Emission (Em)波长为530.0nm的荧光滤光片下进行测量。
将标样及待测样荧光强度值分别记录下来。
3.制定标准曲线将已知浓度的维生素B2标准溶液按照步骤2测定，绘制标准曲线，根据数据进行回归分析，得出求出待测样品浓度的公式。
4.检测待测样品按照步骤2进行待测样品的测定，利用标准曲线计算出待测样品中维生素B2的含量。
三、测定注意点1.样品配制时要保持一定浓度，过高或过低都会影响分析结果；2.样品制备、实验条件及荧光光度计的使用必须保证一致性；3.测量结果可受色、浑浊等因素影响，需要有一定的操作经验、严守操作规程。
四、结论本文介绍了荧光分光光度法测定维生素B2含量的方法，并简要说明了测定原理及详细的操作步骤。
此种方法具有测量简便、操作方便、灵敏度高等优点，被广泛应用于维生素B2含量的测量。
实验一 荧光分光光度计的使用
实验一 荧光分光光度计的使用一、实验目的1.通过实验强化对荧光分光光度法的理解。
2.了解荧光分光光度计的结构和使用方法。
二、实验原理荧光分析法适宜一定强度的激发光经第一单色器分光，选择最佳波长的光去激发液池内的荧光物质。
该物质发出的荧光可射向四面八方，但通过液池后的激发余光是沿直线传播的。
为了准确的进行荧光测定，检测器不能直接对准光源通常在液池的一边，与激发光成直角关系。
1. 荧光激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度)(F ，作λ-F 光谱图称激发光谱。
从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长ex λ，选用 ex λ可得到强度最大的荧光。
2.荧光发射光谱：选择ex λ作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录每一波长下的 F ，作 λ-F 光谱图称为荧光发射光谱。
荧光发射光谱中荧光强度最强的波长为em λ。
ex λ与 em λ一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。
三、仪器与试剂1.仪器：Cary Eclipse 型荧光分光光度计2.试剂：核黄素试剂四、实验步骤1.试剂配制：取适量核黄素加水配置成溶液。
将溶液加入荧光比色皿，再将比色皿放入荧光分光光度计中。
2.测定（1）荧光发射光谱打开程序，单击set up，跳出一个窗口，单击Emission，则Excitation 固定，设为350nm。
再将扫描波长设定为400~600nm。
狭缝定为5，单击OK，等Start变绿灯时单击，仪器扫描出图，此为荧光发射光谱。
如下图。
（2）荧光激发光谱打开程序，单击set up，跳出一个窗口，单击Excitation，则Emission 固定，设为370nm。
再将扫描波长设定为200~500nm。
狭缝定为5，单击OK，等Start变绿灯时单击，仪器扫描出图，此为荧光激发光谱。
如下图。
五、注意事项1.荧光比色皿四面均透光，用手拿取时应拿棱边，避免碰到透光面。
荧光分光光度法
荧光分光光度计的结构与操作
1 2 3
荧光分光光度计的结构
荧光分光光度计由光源、单色器、样品池、检测 器等部分组成，各部分协同工作完成荧光光谱的 测量。
荧光分光光度计的操作步骤
操作步骤包括样品准备、仪器调试、参数设置、 数据采集与分析等，操作时应严格按照仪器说明 书进行。
荧光分光光度计的维护与保养
为了保持仪器的性能和延长使用寿命，应定期对 仪器进行维护和保养，如清洁光学元件、检查电 路连接等。
荧光分光光度法
目录
CONTENTS
• 荧光分光光度法简介 • 荧光分光光度法的基本原理 • 荧光分光光度法的实验技术 • 荧光分光光度法的应用实例 • 荧光分光光度法的挑战与展望
01 荧光分光光度法简介
CHAPTER
定义与原理
定义
荧光分光光度法是一种基于荧光物质与激发光的相互作用， 通过测量荧光光谱来研究荧光物质性质的分析方法。
利用荧光染料标记DNA或RNA，通过 荧光光谱法检测基因表达和突变，以 及DNA和RNA的定量分析。
在环境监测领域的应用
污染物检测
荧光分光光度法可用于检测水体、土壤和空气中的有 害物质，如重金属、农药、酚类化合物等。
饮用水安全
通过荧光光谱法检测饮用水中的消毒副产物，确保饮 用水安全。
生态毒理学研究
荧光光谱的定量分析方法
荧光光谱的定量分析原理
荧光光谱的定量分析基于荧光物质浓度与荧 光强度之间的线性关系，通过测量荧光强度 可以推算出荧光物质的浓度。
荧光光谱的定量分析方法
定量分析方法包括标准曲线法、内标法、外标法等 ，应根据实验需求选择合适的分析方法。
荧光光谱的定量分析误差 来源
误差来源包括仪器误差、样品不均匀性、操 作误差等，应采取相应措施减小误差，提高 分析精度。
荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素b2的含量
荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素b2的含量维生素B2是一种重要的水溶性维生素，促进蛋白质、碳水化合物和脂肪酸代谢，有助于产生能量。
因此，维生素B2对人类的生长发育和健康有着重要的作用。
多维葡萄糖粉是一种常见的含维生素B2的营养品。
荧光分光光度法是目前常用的维生素B2含量测定方法之一，本文将介绍如何使用荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量。
一、实验原理荧光分光光度法是使用化合物的荧光性质进行测定的一种方法。
维生素B2在紫外光的激发下，会发出荧光信号。
荧光强度与维生素B2浓度成正比。
因此，可以利用荧光强度来测定维生素B2的含量。
二、实验步骤1. 器材与试剂准备荧光分光光度计、分析天平、干燥器、分析天平、二氧化硅吸附剂、甲醛、乙醇、维生素B2标准品（1mg/mL）、多维葡萄糖粉样品。
2. 样品预处理将10g多维葡萄糖粉样品加入250mL蒸馏水中，用搅拌器搅拌均匀。
然后加入5mL 10%甲醛溶液，再加入10g二氧化硅吸附剂，摇晃混合，放入干燥器中干燥至恒重。
将得到的样品粉末保存在冷藏条件下，避免阳光直接照射。
3. 准备标准曲线取维生素B2标准品1mL，加入50mL三氟乙酸-醋酸溶液（40:60），在紫外灯下照射5至10分钟，制备成1μg/mL的维生素B2标准溶液。
将该溶液五倍稀释，得到0.2μg/mL 的维生素B2标准溶液。
以此类推，制备维生素B2标准曲线所需浓度的溶液。
4. 测定样品中维生素B2的含量将10mg样品加入250mL三氟乙酸-醋酸溶液（40:60）中，振荡混匀后离心，得到的上清液用滤膜孔的25mm滤膜滤过。
在指定波长下，以相应的激发波长和荧光波长进行扫描。
从标准曲线上读出样品中维生素B2的含量。
三、实验注意事项1.操作时需注意安全，避免吸入或皮肤接触试剂，并在实验后彻底清洗和处理实验设备和废弃物。
2.制备维生素B2标准曲线时，应注意溶液的配制和保存条件，确保浓度准确和稳定。
荧光分光光度法 (Fluorescence Spectrophotometry)
荧光分光光度法(Fluorescence Spectrophotometry)前言：•1852年，斯托克斯（Stokes）发现萤石在暗处受到光的照射会发出一种蓝白色的光，他把这种光命名为“荧光”。
•1868年Goppelstroeder发表了利用Al-桑色素绿色荧光来分析微量Al的分析方法，可见荧光分析是一种历史悠久的分析方法。
时至今日，荧光分析在方法上取得了极大的进展。
促进了诸如：时间分辨、相分辨、荧光偏振、荧光免疫、同步荧光等荧光分析新方法的发展，同时促使各种各样新型荧光分析仪器的出现。
在仪器化方面，微机控制的全自动荧光分析仪具有灵敏度高（比紫外-可见分光光度法高2~3个数量级）、选择性好、工作曲线线性范围宽，且能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点，已成为一种重要的痕量分析技术。
在生物、医学、医药、环境和石油工业等诸多领域，荧光分析法都有广泛的应用。
不仅能直接和间接地分析众多的有机化合物，而且利用与有机试剂间的反应还能进行许多无机元素的测定。
随着科技的发展进步，荧光这种光致发光（photoluminescence）的本质进一步被揭开：•物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外和可见（UV-Vis）荧光之外，受其它各种不同波长光的照射后，同样也有发光现象。
例如：X-荧光、红外荧光等。
•除了吸收光能使分子激发而发光，根据起始激发形成的方式，可以将荧光同其它的发光类型（例如：生物发光、热发光、化学发光和摩擦发光）区别开来。
•通过化学反应使分子受激而发光称为“化学发光”。
利用化学发光进行分析工作叫“化学发光分析”。
•化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称为“分子发光分析(molecular luminescence)”。
•荧光和磷光同属光致发光。
通过测定发光的强度可以定量测定许多痕量的无机物和有机物。
•相对于磷光和化学发光而言，目前荧光法的应用较多。
本章主要讨论荧光分析。
荧光分光光度计(分子荧光)
荧光分光光度计（分子荧光）Fluores_cence •1楼1、基本原理在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。
再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（ex citation spectrum）。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluoresc ence analysis）。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。
2、检测荧光的仪器测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计，其二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。
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荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。
②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
可将光信号放大并转为电信号。
荧光分光光度计是用于电子扫描液相荧光标志物所拍发的荧光光谱的一种摄谱仪。
应用于科学研究、化工、医疗药品、生化、环保和临床检验、食物检验、讲授实验等领域。
本次实验所用样品维生素B6（vitamin B6），又称吡哆素。
是一种水溶性维生素，遇光或碱易破坏，不耐高温。
一种含吡哆醇或吡哆醛或吡哆胺的B族维生素。
1936年定名为维生素B6。
维生素B6为无色晶体，易溶于水及乙醇，在酸液中稳定，在碱液中易破坏，吡哆醇耐热，吡哆醛和吡哆胺不耐高温。
维生素B6在酵母菌、肝脏、谷粒、肉、鱼、蛋、豆类及花生中含量较多。
维生素B6为人体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，尤其是和氨基酸代谢有密切关系。
临床上应用维生素B6制剂防治妊娠呕吐和放射病呕吐。
维生素B6及其辅酶的结构式1 实验仪器与试剂1.1 仪器荧光分光光度计（RF-5301PC,日本岛津）、电子天平（AL204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司METTLER TOLEDO）、微孔滤膜（尺寸25mm，孔径0.8μ，上海半岛实业有限公司净入器材厂）1.2 试剂片（10mg/片，新疆西域药业有限公司，批号10020402）：取20片维生素B6称重，并研磨成粉，备用，计算得药粉的平均片重为73.93/mg。
贮备液溶液（195.4μg/ml，实验室提供）维生素B6盐酸(0.01mol/ml，实验室提供)2 方法与结果2.1 方法2.1.1 标准溶液制备维生素B2的浓度线性范围为2μg/ml-10μg/ml，储备液的浓度为194.4μg/ml。
故分别移取0.25ml、0.50ml、0.75ml、1.00ml和1.25ml储备液。
用盐酸(0.01mol/ml）稀释至25ml即得。
2.1.2 样品溶液制备平行称量样品10.14mg、10.62mg、10.76mg，分别用盐酸溶液溶解，定容至25ml容量瓶中，再分别移取3ml稀释至25ml即得。
2.1.3 确定激发、发射波长根据UV光谱确定激发波长λex和发射光谱的范围，固定激发波长，再选定范围扫描发射光谱；再根据发射光谱确定发射波长λem和激发光谱的范围，固定发射波长，在选定范围扫描激发光谱。
最终确定激发波长与发射波长。
激发光谱与发射光谱图见图1、图2。
荧光定量分析维生素B的参数设定：激发波长λex＝290nm，发射波长λem6＝386nm，狭缝宽度(3,3)，纵坐标扩展0-200。
2.1.4 测量设定好参数后，转换进入计算模式。
重新进行空白调零，分别对5个不同浓度的标准溶液进行3次平行检测。
再将样品溶液过滤后进行荧光检测，同样平行测量3次。
图1 维生素B6激发光谱图2 维生素B6发射光谱2.2. 方法学研究2.2.1标准曲线的建立分别精密量取该维生素B6储备液（194.4μg/ml）0.25、0.50、0.75、1.00、1.25ml置25ml容量瓶中，加盐酸溶液(0.01mol/ml)稀释至刻度，摇匀，即得系列浓度的对照品溶液，照荧光分光光度法，在上述条件下测定荧光强度F，分别测3次，取平均值，以荧光强度（F）对浓度（C）回归处理，得标准曲线和回归方程。
表1 标准曲线实验编号浓度（μg/ml）F1 F2 F3F（平均值）RSD%1 1.954 158.302 157.140 157.406 157.616 0.49712 3.908 266.392 265.242 263.602 265.079 1.14453 5.862 398.063 395.364 392.663 395.363 2.20454 7.816 455.308 453.260 450.710 453.093 1.88095 9.770 524.874 524.026 521.300 523.412 1.5247图3 维生素B6的浓度与荧光强度的标准曲线在2μg/ml-10μg/ml浓度范围内，维生素B6的浓度与荧光强度成线性，标准曲线方程：F=47.063C+83.0308，相关系数：r=0.9883。
2.2.2 精密度试验分别精密量取该维生素B6储备液（194.4μg/ml）0.25、0.5、0.75ml 置25ml容量瓶中，加盐酸溶液(0.01mol/ml)稀释至刻度，摇匀即得，照荧光分光光度法，在上述条件下测定荧光强度F。
平行操作3份。
表2 精密度实验浓度（μg/ml）荧光强度F 测定浓度（μg/ml）均值±RSD16.2832.5748.852.2.3 回收率实验本底值加入量测得值回收率平均值±RSD 高浓度 1.954ug/ml 2.954ug/ml中浓度 3.908ug/ml 4.908ug/ml低浓度 5.826ug/ml 6.826ug/mlF1F2F3F平均值浓度（μg/ml）计算质量（mg）标示量%417.458 417.518 415.053 416.676 7.089 1.477 107.7 418.543 415.743 414.332 416.206 7.079 1.475 102.6 448.587 448.309 446.397 447.764 7.752 1.615 110.9 计算标示量百分含量的RSD%=3.43，平均标示量B%=107.1%。
药典规定制剂规格范围为95%-105%，所以该药品不合格。
3 讨论（1）溶剂能够影响荧光效率, 改变荧光强度，测定时必须采用同一溶剂, 实验标准溶液和样品溶液都采用盐酸作为溶剂。
（2）荧光强度与分子结构的关系：①共轭体系越大，离域大，π键的电子越易激发，荧光越易产生；②荧光物质的刚性和平面性越强，越有利于荧光发射；③给电子取代基加强荧光，吸电子取代基减弱荧光。
④在一定浓度范围内，随着溶液浓度增大，荧光强度增强，超过此范围，浓度的增大，荧光强度反而下降，这是由于荧光试剂浓度增大发生的自猝灭现象。
（3）影响荧光强度的因素除了浓度因素外，还有温度、溶剂、溶液pH、猝灭剂等。
样品在低温下测定，灵敏度提高，因为介质黏度增大，分子间相互碰撞减少；荧光物质在不同溶剂中，介电常数增大λem长移，极性增加，荧光强度增大；pH对酸碱性化合物的荧光强度有很大影响。
（4）样品回收率实验是对检测方法学的考察，目的是衡量检测器的准确性。
原理是对检测液中加入已知量的待测物。
测得值减去本底值，从而计算出加入量。
用检测得到的量比实际的加入量，所得值即为回收率。
通常设定高中低三个剂量组，一般选择线性范围内的1/3,1/2,2/3处浓度值为检测量。
分别进行三次实验，对高中低三个剂量组的方法合理性进行考察。
注意供试品溶液浓度应在线性范围内，中浓度中供试品与对照品的量约为1:1，中间浓度溶液一半的浓度为本底浓度。
（5）维生素B6易发生光降解，应避光保存。
本次实验样品可能是由于长时间未避光保存导致检测结果不合格。
（6）室内温度较高可能降低荧光效率和荧光强度。
（7）溶剂的拉曼光对荧光测定也有一定的影响，应根据溶剂拉曼光的波长，选择合适的激发光波长，以消除拉曼光的干扰。