Pif1解旋酶家族功能的研究进展_王攀
复合酶制备抗氧化活性核桃多肽工艺优化
安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2018，24（08）复合酶制备抗氧化活性核桃多肽工艺优化王攀范娜（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛726000）摘要：以碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶复合水解核桃蛋白制备抗氧化活性多肽的工艺条件优化为对象，通过研究酶解时间、酶解温度、酶与底物浓度比及复合酶比例对核桃蛋白酶解物清除DPPH·能力的影响，并利用正交试验优化工艺条件，以提高核桃蛋白多肽对DPPH·的清除率。
结果表明，酶解时间、酶解温度、酶与底物浓度比及复合酶比例对核桃蛋白酶解物清除DPPH·能力有一定影响；当木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶复合酶解温度为45℃、时间1.5h、酶与底物浓度1500U/g、pH值7.0、复合酶比例为2∶1时，酶解物清除DPPH·的能力最强，清除率达78.7%。
关键词：核桃多肽；复合酶；工艺优化中图分类号TS201.2文献标识码A文章编号1007-7731（2018）08-0022-03核桃蛋白是一种优质的植物蛋白资源，富含18种氨基酸，精氨酸和谷氨酸含量高［1］，其酶解产物核桃蛋白多肽具有浓度高、溶解性好等特性［2-3］，乳化性、吸湿性等均优于核桃蛋白，更适合用于加工生产优质食品［4］。
在食品加工中，脂肪的氧化是影响食品风味、质构和外观的主要因素［5］，具有抗氧化活性的生物活性肽是潜在的天然、安全、高效的抗氧化剂［6-7］。
酶的水解和微生物的发酵是较常用的水解蛋白质的方式［8-9］。
核桃蛋白水解后具有很好的抗氧化、抑菌、抗肿瘤等作用［10］，因此利用核桃蛋白开发具有抗氧化活性的多肽市场前景广阔。
本实验通过利用木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶复合水解核桃蛋白，研究其复合比例、水解条件对水解产物抗氧化活性的影响，以提升核桃蛋白水解物的抗氧化活性，为核桃蛋白多肽的应用提供一定的参考。
1材料与方法1.1材料与设备1.1.1材料与试剂材料：核桃，市售；木瓜蛋白酶（1000U/mg）；碱性蛋白酶（10000U/g）；DPPH（D9132）。
Bispora sp. MEY-1来源的嗜酸海藻糖酶TreA酶学性质研究
中国农业科技导报，2021,23(4)：85-92Journal of Agricultural Science and TechnologyBispora sp.MEY-1来源的嗜酸海藻糖酶TreA酶学性质研究蒋肖，涂涛，王坤，彤丽格，罗会颖*(中国农业科学院饲料研究所，农业农村部饲料生物技术重点实验室，北京100081)摘要:酸性海藻糖酶作为生物催化剂在生物工业中广泛应用，挖掘酶学性质优良的酸性海藻糖基因具有重要意义。
从Bispora sp.MEY-1中成功克隆出一个酸性海藻糖酶基因7＞丛,并在毕赤酵母GS115中实现高效表达。
对纯化后的酸性海藻糖酶TreA进行酶学性质鉴定,其最适pH为4.0,在pH2.2-5.0范围内，该酶能够维持60%以上的酶活力。
TreA在偏酸条件下稳定效果比较好，在pH1.0-4.0条件下处理1h,可以剩余88%以上的酶活力。
TreA的最适温度为60咒，在40~70t之间都可以维持50%以上的酶活力，属于中高温酶。
重组海藻糖酶TreA的比活为1913U-mg_1，动力学参数心和卩昨分别为0.67mg-mL_1f[l119iJimol-min-1-mg-1。
同时,还评估了不同金属离子或化学试剂对纯海藻糖酶TreA的酶活性影响及其蛋白酶抗性。
极大丰富了海藻糖酶基因资源，促进了其在生物工业中的应用。
关键词:Bispora sp.MEY-1；酸性海藻糖酶;异源表达;酶学性质鉴定doi：10.13304/j.nykjdb.2020.0452中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1008-0864(2021)04-0085-08Enzymatic Properties of an Acidic TrehalaseTreA from Bispora sp.MEY-1JIANG Xiao,TU Tao,WANG Kun,TONG Lige,LUO Huiying*(Key Laboratory for Feed Biotechnology t Ministry of Agriculture and Rural Afiairs；Feed Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing100081,China)Abstract:As a biocatalystase,acid trehalase is widely used in biological industry.It is very important to exploit new acid trehalase with excellent enzymatic properties.In this study,an acid trehalase gene(TreA)from Bispora sp.MEY-1was successfully cloned and expressed in Pichia pastoris GS115.The enzymatic properties of purified trehalase TreA were identified.The optimum pH was4.0,and the relative activity maintained over60%under the range of pH2.2〜5.0.The relative activity of purified enzyme was more than88%after treated for1h under pH1.0〜4.0,whichexhibited the good acid stability.The optimum temperature of purified enzyme was60七,which was enzyme with medium-high temperature resistance.The specific activity of purified enzyme was1913U*m g_1,and its K m and V max were0.67mg•mL-1and119|JLmol•min-1*mg-1,respectively.Moreover,the effects of different mental ions or chemical reagents,and the protease resistances on the purified enzyme activity were also evaluated.Key words:Bispora sp.MEY-1；acid trehalase；heterologous expression；characterization海藻糖是一类非还原型二糖，由两个a-D-葡萄糖通过a-1,1-糖昔键连接而成,通常以二水化合物的形式存在，是所有糖中化学性最不活跃的糖⑴。
用酵母双杂交技术筛选PIF1解螺旋酶的相互作用蛋白
用酵母双杂交技术筛选PIF1解螺旋酶的相互作用蛋白引言在细胞中，蛋白质之间相互作用是维持生命活动正常进行的重要基础。
因此，研究蛋白质的相互作用关系对于了解生物学过程的调控机制以及疾病发生发展具有重要意义。
酵母双杂交技术（yeast two-hybrid，Y2H）是一种重要的蛋白质相互作用筛选技术，已被广泛应用于生物学研究。
本文将介绍酵母双杂交技术在筛选PIF1解螺旋酶的相互作用蛋白中的应用。
PIF1解螺旋酶简介PIF1解螺旋酶是一种高度保守的DNA螺旋酶家族成员，广泛存在于真核生物中。
该酶在DNA复制和DNA损伤修复等生物学过程中发挥着重要作用。
具体来说，PIF1解螺旋酶可以解旋DNA双链结构，促进DNA复制过程的进行。
此外，它还参与单链断裂修复和基因组稳定性的维持等功能。
PIF1解螺旋酶的相互作用蛋白筛选为了揭示PIF1解螺旋酶在细胞中的功能调控机制，研究者可以利用酵母双杂交技术筛选出与其相互作用的蛋白质。
以下是筛选过程的具体步骤。
第一步：构建Y2H载体酵母双杂交技术涉及到两个重要的载体：pGBKT7和pGADT7。
其中，pGBKT7负责编码DNA结合域（DNA binding domain，BD）和目标蛋白的融合蛋白，而pGADT7则负责编码激活域（activation domain，AD）和候选蛋白的融合蛋白。
在本研究中，研究者将PIF1解螺旋酶的编码序列克隆到pGBKT7载体中，从而获得PIF1-BD融合蛋白。
第二步：构建基因文库基因文库是由大量表达了细胞中的蛋白质编码序列的DNA片段构成。
在酵母双杂交筛选中，构建一个与PIF1-BD融合蛋白进行相互作用的候选蛋白文库非常关键。
一般通过提取细胞中RNA，合成cDNA，将其与载体pGADT7连接而得到候选蛋白文库。
第三步：酵母转化与筛选将PIF1-BD载体和候选蛋白文库共同转化到酿酒酵母细胞中，通过培养在选择性培养基上进行筛选。
在这个过程中，只有与PIF1-BD融合蛋白发生相互作用的融合蛋白才能启动报告基因的表达，从而使细菌在选择性培养基上生长。
蛋白酶的分类及酶切位点
蛋白酶的分类及酶切位点氨基酸0.ppt氨基酸的名称与符号alanine 丙氨酸Ala Aarginine 精氨酸Arg Rasparagine 天冬酰氨Asn Asx Naspartic acid 天冬氨酸Asp Asx Dcysteine 半胱氨酸Cys Cglutamine 谷氨酰胺Gln Glx Qglutamic acid 谷氨酸Glu Glx Eglycine 甘氨酸Gly Ghistidine 组氨酸His Hisoleucine 异亮氨酸Ile Ileucine 亮氨酸Leu Llysine 赖氨酸Lys Kmethionine 甲硫氨酸Met Mphenylalanine 苯丙氨酸Phe Fproline 脯氨酸Pro Pserine 丝氨酸Ser Sthreonine 苏氨酸Thr Ttryptophan 色氨酸Trp Wtyrosine 酪氨酸Tyr Yvaline 缬氨酸Val V血清终止胰酶消化的原理血清终止的原理其实是竞争抑制。
就是用过量的牛血清中含有的蛋白来和胰酶结合。
不给胰酶消化细胞蛋白的机会。
细胞传代时，血清为什么能终止胰酶消化？胰蛋白酶的酶切位点是肽链的Lys和Arg两个残疾的羧基端肽键，血清的加入可使酶饱和，严格上说不是竞争性抑制，因为血清蛋白不是抑制剂，还是底物！什么样的细胞不能用胰酶-EDTA消化植物细胞不能用胰酶-EDTA消化，要用纤维素酶消化。
应该是肿瘤细胞吧。
正常的细胞，貌似都需要用胰酶或者胶原酶消化。
EDTA-胰酶，只不过是在胰酶里加入了EDTA而已。
EDTA是乙二胺四乙酸，一种金属螯合剂。
一般和胰蛋白酶配合使用。
原因在于，钙，镁等金属离子会降低胰酶活力，故在使用胰酶消化液时要配合加入EDTA。
它可以螯合这些离子，消除对胰酶的抑制。
干细胞饲养层制作中，胰酶—EDTA消化成纤维细胞（MEF）时，EDTA的作用是什么？应该是胰酶分散细胞，EDTA鳌合金属离子使金属酶失活《军医进修学院学报》1992年02期加入收藏投稿正常人血浆蛋白酶解产物对胃癌细胞肺转移抑制作用的研究焦顺昌赵东海黄昌霞王洪海【摘要】：本文采用胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶联合消化方法得到正常人血浆(NHP)有限蛋白酶解产物(NHP-EP)。
过氧化物酶体增殖物激活受体
过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR) 是一类由配体激活的核转录因子,属Ⅱ型核受体超家族成员, 存在3种亚型，即PPARα、PPARδ、PPARγ，这三种亚型在结构上有一定的相似性，均含DNA结合区和配体结合区等。
PPAR与配体结合后被激活，与9-顺视黄酸类受体形成异二聚体，然后与靶基因的启动子上游的过氧化物酶体增殖物反应元件(peroxisome proliferator response element，PPRE)结合而发挥转录调控作用。
PPRE 由含相隔一个或两个核苷酸的重复序列AGGTCA组成。
与配体结合后，PPAR在DNA结合区发生变构，进而影响PPAR刺激靶基因转录的能力。
PPARδ几乎在所有组织中表达，浓度低于PPARα及PPARγ，直至最近以前尚未找到此一核受体的选择性配基。
PPARδ是代谢综合征（肥胖、胰岛素抵抗、高血压是与脂质紊乱有关的共同的病态表现）的一个新靶点。
有不少的研究表明：GW501516可作为PPARδ的特异激动剂用于研究。
参考网址：/cjh/2003/shownews.asp?id=156/conference/preview.php?kind_id=03&cat_name=ADA2001&title_id=59219 Regulation of Muscle Fiber Type and Running Endurance by PPARδplos biology，Volume 2 | Issue 10 | October 2004/plosonline/?request=get-document&doi=10.1371%2Fjournal.pbio.0020294NF-KB通路中的抑制剂好像有1.PDTC(pyrrolidine dithiocarbamate),是一种抗氧化剂，主要作用于IκB降解的上游环节（IκBα的磷酸化或IKK的活性水平），2.Gliotoxin 是一种免疫抑制剂，机制可能从多个环节阻断NF-KB的激活，如IκB的降解，NF-KB的核移位和与DNA的结合。
生物类专业博士论文题目选题
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人类重组PIF1解螺旋酶C-末端多肽的纯化及其抗体制备
【 摘要 】 目的 ： 表达纯化人类 Ｐ １ Ｉ 解螺旋酶 Ｃ 末端 的 ３８ ６１ Ｆ 一 ３ — ４ 氨基 酸的多肽 ＰＦ Ｉ ３ ， 同时用 纯化蛋 白制备
１ 材 料 与 方 法
１ １ 所用 菌 株 与 质 粒 ．
Ｒ ｓｔ ０ｅ
构 建 Ｐ Ｉ
表 达 重 组 体
的 质 粒 为 ｐ Ｔ ５ （ ｏａｅ ） 表 达 菌 株 为 Ｅ ｃｌ Ｅ １ ｂ Ｎ ｖｇｎ ， ． ｏｉ
２ Ｄ ３ （ ｏａｅ ） （ Ｅ ） Ｎ ｖｇｎ 。
体 ＰＦ 蛋白参与线粒体 Ｄ Ａ的重组及线粒体 Ｄ Ａ Ｉ１ Ｎ Ｎ 的稳 定 ＿ ， 粒体 ＰＦ 蛋 白缺 失 可导 致 酵母 失 去 线 ２线 ｊ ＩＩ 粒体 Ｄ Ａ并使 Ｄ Ａ的修复受阻。线粒体 Ｐ １ 白 Ｎ Ｎ Ｉ 蛋 Ｆ 与碱 基 切 除 修 复 蛋 白共 同 作 用 ， 以拮 抗 线 粒 体 可 Ｄ Ａ 自发 的氧化损 伤 ，， 于 或 防止 双 链 Ｄ Ａ断 Ｎ ４参 ｊ Ｎ
２０ ０ ８年 １ ２月
农
垦
医
学
Ｄｅ ２ ８ ｃ． ０ｏ
第３ ０卷 ｎ ｋ ｎ Ｍｅ ｉｉ ｅ ｏｒ ｌ ｆ ｎ Ｎｏ ｇ ｅ ｄ ｃｎ
Ｖ０ ． ０ Ｎｏ． １３ ６
论著 ・
人 类 重 组 ＰＦ 解 螺 旋 酶 Ｃ一末 端 多 肽 的纯 化 Ｉ１ 及 其 抗 体 制备
因的 １１ ０２—１２ ９６的 ｃＮ Ｄ Ａ片 段 （ 应 氨 基 酸 ３８— 对 ３ ４ ） ６１ 。经 Ｄ Ａ测序 证 明序列 正 确 后 ， 入 带 有六 聚 Ｎ 插 组氨 酸 的融 合 表 达 载 体 ｐ Ｔ ５ Ｎ ｖｇｎ ， 生 重 Ｅ １ｂ（ ｏａｅ） 产
RNA解旋酶的功能和控制机制研究
RNA解旋酶的功能和控制机制研究RNA解旋酶是一种重要的酶类，主要用于解开RNA分子的双链结构。
它在很多方面都扮演着重要的角色，如基因表达、RNA加工、蛋白质合成等。
在这篇文章中，我将介绍RNA解旋酶的功能、机制以及目前的研究进展。
第一部分：RNA解旋酶的功能RNA解旋酶是一类能够将RNA分子解开的酶，它们可以将双链RNA分子解开成为两条互不干扰的链。
在细胞内，RNA解旋酶主要用于解开mRNA分子的结构，使其能够被翻译成为蛋白质。
此外，RNA解旋酶还能够解开RNA中的某些二级结构，如RNA-RNA和RNA-DNA双链。
这种解开作用在RNA拼接、RNA修饰等过程中也非常重要。
第二部分：RNA解旋酶的机制RNA解旋酶的机制主要分为两类，一类是依靠ATP水解的蛋白质解旋酶，另一类是RISC（RNA诱导静默复合物）酶复合物中的小RNA分子解旋酶。
蛋白质解旋酶主要依靠ATP水解来提供能量，驱动RNA双链的解开。
其解旋过程一般分为如下步骤：1. 酶分子通过蛋白质-蛋白质相互作用吸附在RNA分子的双链结构上。
2. 酶分子的ATPase活性将ATP水解为ADP和P。
3. 解旋酶将ADP与P释放出来，这种释放反应提供了能量，使得解旋酶能够摆动RNA分子的双链结构。
4. RNA分子双链结构逐渐解开，直至全被解开。
RISC酶复合物中的小RNA分子解旋酶则不同寻常，其不需要ATP水解即能够使RNA双链结构解开。
这是因为RISC酶复合物中的小RNA分子和目标RNA分子形成了互补配对，形成的RNA-RNA复合物能够使RISC酶分子的ATPase活性受到抑制，而小RNA分子本身就具有解旋RNA的能力。
第三部分：RNA解旋酶的控制机制RNA解旋酶在细胞中被严格控制，以避免过度解旋RNA，从而影响RNA的正常功能。
这种控制机制主要体现在两个方面：1. 蛋白质解旋酶受限调控在细胞中，蛋白质解旋酶的活性会受到其他蛋白质的调控。
这些调控蛋白质可以直接与解旋酶分子相互作用，影响其ATPase活性，或者通过调节解旋酶在细胞中的局部聚集程度来影响其活性。
厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化
厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化郭海磊;刘娜女;段晓雷;奚绪光【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(045)006【摘要】[目的]通过原核表达系统获得嗜热的厌氧棒菌(Anaerobaculumh ydrogeni ormans)DNA解旋酶Pif1(AnaPif1),研究其体外最佳解旋条件,为深入研究嗜热菌Pif1家族解旋酶工作机理提供参考.[方法]构建重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,将重组载体转入表达菌株BL21 (DE3)中诱导表达目的蛋白,经Ni NTA柱和Heparin柱纯化最终获得全长AnaPif1蛋白;利用停流-荧光共振能量转移(FRET)技术,以pH值和Tris-HCl、NaCl、MgCl2浓度及反应温度、能量供体为考察因素,以反应时间常数或速率常数为指标,摸索该蛋白在体外的最佳解旋条件、最佳能量供体以及底物的偏好性.[结果]成功构建了pET15b-sumo-AnaPif1重组表达载体,通过诱导表达,获得了纯度大于95％的全长AnaPif1蛋白,其大小为55 ku,等电点为6.89.AnaPif1在体外的最佳解旋条件为:Tris-HCl(pH7.0) 20 mmol/L、NaCl 20 mmol/L、MgCl2 2 mmol/L、反应温度37℃;其能够利用4种核苷三磷酸(ATP/GTP/CTP/UTP)作为能量供体,但对ATP有偏好性;该酶还能解旋多种底物(双链DNA、G4-DNA),且对底物选择无明显偏好性.[结论]获得了纯化的AnaPif1解旋酶,明晰了其最佳解旋条件、能量供体及底物的偏好性特征.【总页数】7页(P206-212)【作者】郭海磊;刘娜女;段晓雷;奚绪光【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】Q783【相关文献】1.牛RECQL解旋酶的原核表达纯化及解旋条件优化 [J], 翟留涛;秦魏;刘娜女;奚绪光2.一种嗜热菌Pif1解旋酶的表达纯化及活性分析 [J], 赵正阳;刘娜女;李海红;奚绪光;范三红3.厌氧棒菌苗抑瘤作用的实验研究Ⅰ、厌氧棒菌苗对带瘤动物胸腺和T细胞的影响[J], 沈元珊4.嗜热厌氧杆菌 Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白与DNA底物结合的反应特性[J], 段晓雷;许欢;姚淼;曾洁;申丽;刘娜女;张涛;肖代敏;;;;;;;;;5.脆弱拟杆菌Pif1解旋酶的表达纯化与晶体生长 [J], 曹汝菲;李泽轩;许欢;张莎;张敏敏;戴枫;段晓雷因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Pif1解旋酶家族功能的研究进展王攀
解螺旋 酶 在 所 有 生 物 体 都 广 泛 存 在，参 与 几 乎 所有的核酸代谢过程。Pif1 解旋酶家族存在于所有 的真核生物中，具有 5'-3'方向活性，且依赖 ATP。解 旋酶根据其模序不同可分为超级家族Ⅰ和Ⅱ，Pif1 解 旋酶家族属于超级家族Ⅰ。1983 年，酿酒酵母 Pif1 基因被分离出来［1］，并且最终确定酿酒酵母 Pif1 蛋 白（ ScPif1） 为解旋酶［2］，对解旋酶 Pif1 家族的研究主 要集中在其维持细胞核和线粒体基因组稳定性方面 的作用。在 酵 母 菌、寄 生 虫 及 哺 乳 动 物 中 均 有 对 ScPif1 和其同源蛋白的研究。 1 酿酒酵母 Pif1 蛋白
ScPif1 在细胞核的功能主要有： 在双链断裂添加 端粒重复序列，抑制端粒酶［5，8］参与 G-四链 DNA 的 形成［9-10］，参与冈崎片段的成熟［11］，阻断 rDNA 的复 制［12］。在线粒体的功能主要是维持野生型 mtDNA 的稳定［13-17］。 2 酿酒酵母 Rrm3 蛋白
酿酒酵母 Rrm3 蛋白是在筛选影响 rDNA 重组的 基因时首次发现的［18］。酿酒酵母 Rrm3 蛋白突变导 致有丝分裂重组刺激，不仅在 rDNA，也包括部分其 他串联重复位点（ 如 CUP1 基因就不是 Ty 成分） 。后 来发现，酿酒酵母 Rrm3 基因突变位于 tRNA 基因上 游时能够使 Ty1 的流动性增加 100 倍［19］，最近研究 表明，这 种 现 象 取 决 于 特 定 的、稳 定 的、能 影 响 复 制 叉进程的蛋白质复合物［18］。在维持核基因组稳定的 作用中，酿酒酵母 Rrm3 基因作为复制体组分可能靠 它的催化活 性 催 进 复 制 叉 运 动，在 复 制 叉 破 坏 稳 定 的蛋白-DNA 复合结构中起作用。 3 裂殖酵母 SpPfh1
肺炎支原体P1蛋白的研究进展
肺炎支原体P1蛋白的研究进展赵梦楠;刘宗昂;王舰【摘要】Mycoplasma penumoniae ( MP) is a common pathogenic microorganisms that causes respiratory infections, and PI protein is a transmembrane protein associated with adhesion, the adhesion is the important reason that causes inflammation. Currently, a new discovery of isolate 3 known as PI variants have drawn wide attention among scholars. In addition, PI protein can also be prepared for the laboratory diagnosis of MP infection. Therefore, the study of PI protein in the fields of structure gene, pathogenesis and laboratory diagnosis is of great significance.%肺炎支原体(MP)是引起呼吸系统感染常见的病原微生物,P1蛋白是肺炎支原体上一种与黏附相关的跨膜蛋白,其黏附作用是引发炎症作用的重要原因.目前新发现的一种被称为孤立岛3的P1变异体引起了各学者的广泛关注.另外,还可以利用P1蛋白进行MP感染的实验室诊断.因此,探讨P1蛋白基因结构、致病机制和实验室诊断方法具有重要意义.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2011(031)006【总页数】4页(P84-87)【关键词】肺炎支原体;P1蛋白;孤立岛3;黏附作用【作者】赵梦楠;刘宗昂;王舰【作者单位】中国医科大学七年制94期,辽宁沈阳110001;中国医科大学临床医学93期,辽宁沈阳110001;中国医科大学病原微生物学教研室,辽宁沈阳110001【正文语种】中文【中图分类】R375+.2普通人群中约30%的肺炎是由肺炎支原体引起的，肺炎支原体感染引起的呼吸道损害及各种肺外并发症已引起广泛关注。
热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析
热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析王帅锋;刘娜女;段晓磊;罗亦欣;范三红;奚绪光【摘要】[目的]通过原核表达系统获得热脱硫弧菌(Thermodesulfovibrio yellowstonii H.)Pif1解旋酶(TyPif1),研究TyPif1解旋酶的嗜热特性和解旋机理.[方法]将Typif1解旋酶编码区和SUMO促溶标签编码区融合连入pET15b获得重组表达载体pET15b-SUMO-TyPif1,将该重组载体导入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化获得融合蛋白,SUMO蛋白酶切除标签,再经Ni-NTA柱去除标签蛋白及SUMO蛋白酶,经Heparin柱进一步纯化最终获得TyPif1全长蛋白.通过荧光各向异性、圆二色谱(CD)和荧光共振能量转移(FRET)分析TyPif1解旋酶的DNA结合活性、解旋活性以及二级结构的热稳定性.[结果]获得了纯度大于95％的TyPif1蛋白,1L培养基可以获得约10mg纯度大于95％的蛋白;TyPif1解旋酶结合单链DNA和G4 DNA的活性明显高于双链DNA;TyPif1具有较高的解旋(G4 DNA的活性,在25～60℃下其二级结构相对稳定,且解旋速率随温度升高而增大,25～50℃TyPif1的解旋速率由0.09 s-1增大到0.23 s-1.[结论]表达纯化了热脱硫弧菌TyPif1解旋酶,其不仅具有良好的热稳定性,同时具有特异的结合和解旋G4 DNA的能力.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(044)009【总页数】7页(P207-213)【关键词】热脱硫弧菌;Pif1解旋酶;蛋白表达纯化;DNA结合活性;DNA解旋活性【作者】王帅锋;刘娜女;段晓磊;罗亦欣;范三红;奚绪光【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】Q781;Q814.1解旋酶是一类利用水解NTP释放的能量沿着DNA磷酸骨架移动的分子“马达”，参与核酸复制、转录、重组与修复等过程，在生物体内扮演着重要的角色[1-2]。
解旋酶
不同生物解旋酶的氨基酸序列分析发现它们有9 个高度保守的序列，分别称为Q、I、Ia、Ib、II、III、IV、V 和VI（Fairman-Williams et al., 2010）（图1-2），这说明所有的解旋酶可能起源于相同的基因。
这些保守区域是ATP 酶、解旋酶活性以及NTP 和DNA 结合的功能区。
其中基序Ia 区通常是GTP 和ATP 结合区；Ⅱ区是ATP 结合蛋白B 区的特殊翻版；I 区可形成一套索结构与NTP 磷酸结合，其结构属ATP 结合蛋白的A区；而Ⅱ区保守的天冬氨酸与镁离子介导的磷酸结合有关；Ia 以及Ⅵ区的保守酪氨酸与可能的DNA 结合蛋白相关，提示涉及多核苷酸的结合；基序VI 则参与ATP 磷酸盐的结合；其他的基序（Ia、Ib、IV、V）则参与RNA 结合以及通过RNA 结合激活ATP 水解的活性；III 是RNA 解旋酶活性必需的结构。
依据以上Motif 的不同，真核生物的解旋酶分为两个大家族Helicase superfamily I和II （SFI 和SFII）（图1-3），其中多数RNA 解旋酶属于SFII，少数属于SFI（Fairman-Williams et al., 2010）。
SFI 一般是真菌中的解旋酶；高等植物、酵母、动物中一般都是SFII，它又分为DEAD-box、DEAH-box、DExH、RecQ 和SW1/SNF。
解旋酶SF1 和SF2 的家族分类，引自Fairman-Williams et al., 2010Figure1-5, Helicase SF1 and SF2 family classification .2006 年，RIKEN 基因组科学中心、冈崎研究所的研究人员发现，果蝇DEAD-boxprotein Vasa 的催化核的结构，该催化核与一个单链RNA 和一个ATP 类似物形成复合体。
ATP 类似物紧密与这两个结构域结合，并使他们变成更为紧密的形式，而且保守残基间发生域间相互作用。
酵母双杂交技术筛选人PIF1解螺旋酶相互作用蛋白
酵母双杂交技术筛选人PIF1解螺旋酶相互作用蛋白王攀;王建校;李珊珊;刘晓丹;王豫;周平坤;顾永清【摘要】目的应用酵母双杂交技术研究筛选与人类PIF1解螺旋酶相互作用的蛋白.方法应用酵母双杂交技术,以人PIF1蛋白PINT功能域(1～180氨基酸)和解螺旋酶模序(167～926氨基酸)为诱饵,与HeLa细胞cDNA文库杂交,筛选能与人PIF1蛋白不同功能域相互作用的蛋白.结合生物信息学分析,一对一酵母回复性杂交及β-galactosidase实验等确定阳性克隆.结果 PIF1蛋白PINT功能域杂交共获得17个阳性克隆,生物信息学分析有3个阳性基因,它们分别是CCNDBP1、OTUD5、CAP1.而PIF1蛋白解螺旋酶模序未获得阳性克隆.结论 PIF1蛋白的PINT功能域对调控PIF1的生理功能具有非常重要的作用.【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(034)005【总页数】4页(P595-598)【关键词】人PIF1解螺旋酶;PINT功能域;酵母双杂交;蛋白质相互作用【作者】王攀;王建校;李珊珊;刘晓丹;王豫;周平坤;顾永清【作者单位】军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850;石河子大学医学院,新疆石河子,832003;石河子大学医学院,新疆石河子,832003;石河子大学医学院,新疆石河子,832003;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850;石河子大学医学院,新疆石河子,832003【正文语种】中文【中图分类】Q78解螺旋酶是催化DNA双链解开的酶，几乎参与包括DNA复制、转录、重组修复等所有的核酸代谢过程，在生物体内具有重要的生理功能。
一些解螺旋酶的突变会导致人类遗传病，包括着色性干皮肤病、Werner综合征、Bloom综合征等［1］。
人类重组PIF1解螺旋酶C-末端多肽的纯化及其抗体制备
人类重组PIF1解螺旋酶C-末端多肽的纯化及其抗体制备顾永清;Kenji Kamiya【期刊名称】《农垦医学》【年(卷),期】2008(30)6【摘要】目的:表达纯化人类PIF1解螺旋酶c-末端的338-641氨基酸的多肽PIF338-641,同时用纯化蛋白制备特异抗体.方法:从HeLa细胞的cDNA文库中PCR扩增得到PIF1解螺旋酶c-末端1012-1926的cDNA片段(对应氨基酸338-641),插入N-末端融合有六聚组氨酸的表达载体pET15b产生pET15b-PIF338-641重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,使PIF338-641蛋白在大肠杆菌中表达,用自制的镍亲和柱纯化PIF338-641蛋白,并以纯化蛋白免疫家兔制备抗血清.结果:PIF338-641蛋白在大肠杆菌中成功表达,纯化了PIF338-641蛋白并制备了PIF338-641蛋白抗血清.结论:制备的PIF338-641蛋白抗体能与蛋白发生特异的免疫反应.【总页数】4页(P449-452)【作者】顾永清;Kenji Kamiya【作者单位】石河子大学医学院,新疆石河子,832002;Department of Experimental Oncology,Research Institute for Radiation Biology and Medicine,Hiroshima University,Hiroshima 734-8553,Japan;Department of Experimental Oncology,Research Institute for Radiation Biology and Medicine,Hiroshima University,Hiroshima 734-8553,Japan【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.组蛋白脱乙酰化酶4N-末端和C-末端片段的原核表达及纯化 [J], 杨洋;覃小翠;刘书虎;黄威;王雪敏2.人CAP1蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体蛋白的相互作用 [J], 张莹;刘旭;王彬;潘秀颉;杨陟华;周平坤;朱茂祥;顾永清3.酵母双杂交技术筛选人PIF1解螺旋酶相互作用蛋白 [J], 王攀;王建校;李珊珊;刘晓丹;王豫;周平坤;顾永清4.不含氨基末端的PIF1解螺旋酶的纯化和初步功能研究 [J], 顾永清5.人类PIF1蛋白质N-末端多肽的表达纯化和 [J], 顾永清;朴金莲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物响应低温的分子机制研究进展
植物响应低温的分子机制研究进展张瑶;王傲雪【摘要】低温寒害(cold injury)是全球性的自然灾害之一,不仅限制农作物的地理分布,还会影响植物的生长发育,最终导致农作物减产甚至死亡.因此,研究植物响应低温胁迫的分子机制具有重要的理论意义和应用前景.本文从植物对低温的应答、植物对低温的感知和低温信号转导途径三个方面综述了植物是如何响应低温的,着重分析了CBF介导的低温调控网络,并对植物响应抗冷分子机制的研究进展进行概述,以期为进一步阐明植物抗冷机制提供理论基础和信息.这对提高农作物抗冷性具有重要的理论意义.【期刊名称】《黑龙江大学自然科学学报》【年(卷),期】2018(035)005【总页数】10页(P566-575)【关键词】植物;低温胁迫;信号转导;分子机制【作者】张瑶;王傲雪【作者单位】东北农业大学生命科学学院,哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,哈尔滨150030;东北农业大学园艺园林学院,哈尔滨150030【正文语种】中文0 引言植物在生长过程中会不可避免地遭受各种逆境胁迫，包括生物胁迫 (Biotic stress)和非生物胁迫 (Abiotic stress)。
细菌、真菌、病原菌以及昆虫等造成的伤害叫作生物胁迫，而低温、高温、干旱、高盐等因素对植物造成的伤害叫作非生物胁迫。
由于固着生长的特性，植物必须发展自己的防御系统来应对各种胁迫。
低温寒害是全球性的自然灾害之一，不仅限制农作物的地理分布还会影响植物的生长发育，最终导致农作物减产甚至死亡。
近些年，极端气候尤其是低温寒害，使得大面积农作物减产，对世界粮食安全造成重大威胁。
因此，研究植物如何感受外界温度的变化以及响应低温的分子机制具有重要的科学意义和应用价值。
长久以来，科学家通过分子生物学、生理学、生物化学和细胞生物学等手段对植物响应低温的分子机制进行了广泛和深入的研究。
1 植物对低温的应答1.1 低温逆境的分类为了更好地研究低温对植物造成的影响，将低温对植物的伤害分为冷害 (Chilling injury) 和冻害 (Freezing injury) 两种形式。
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粒体 定 位 信 号 导 入 线 粒体［5］。
ScPif1 的相对分子质量 为 98 × 103 ，并且依赖 ATP 和 Mg2 + 解 链 方 向 为 5'-3'［5-6］。
生化研究中用到的 ScPif1 是
Research Progress of the Pif1 Helicase Family Functions WANG Pan，GU Yong-qing． （ School of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832000，China）
Abstract： Helicases are ubiquitous enzymes found in all organisms necessary for all （ or virtually all） aspects of nucleic acid metabolism． The Pif1 helicase family is a group of 5'-3' directed，ATP-dependent， found in nearly all eukaryotes． Here is to make a review on the discovery，evolution，and currently known facts about these enzymes in Saccharomyces cerevisiae（ ScPif1 and ScRrm3 ） ，Schizosaccha-romyces pombe （ SpPfh1） ，Trypanosoma brucei（ Tbple1，2，5，and 8） ，mice （ mPif1） ，and humans （ hPif1 ） ． Pif1 helicases variously affect telomeric，ribosomal，and mitochondrial DNA replication，as well as Okazaki fragment maturation，and in at least some cases affect these processes by using their helicase activity to disrupt stable nucleoprotein complexes． While the functions of these enzymes vary within and between organisms，it is evident that Pif1 family helicases are crucial for both nuclear and mitochondrial genome maintenance．
文献标识码： A
文章编号： 1006-2084（ 2013） 02-0219-03
Байду номын сангаас
doi： 10． 3969 / j． issn． 1006-2084． 2013． 02． 009
摘要： 解旋酶是一种所有生物体都广泛存在的酶，对于几乎所有的核酸代谢都是必需的。Pif1 解旋酶家族存在于所有的真核生物，是 5'-3'方向依赖 ATP 的解旋酶。Pif1 解旋酶影响端粒、核糖体 和线粒体的 DNA 复制以及冈崎片段的成熟，其影响机制很多是利用其解螺旋活性破坏核蛋白复合 体的稳定性。不同的生物 Pif1 解旋酶功能不同，但其对细胞核和线粒体基因组稳定性的维持是非常 重要的。目前已知，酿酒酵母（ ScPif1 和 ScRrm3） 、裂殖酵母（ SpPfh1） 、布氏锥虫（ TbPIF1、2、5、8） 、小 鼠（ mPif1） 和人类（ hPif1） 均属于 Pifl 解旋酶家族，现对上述 Pifl 解旋酶进行综述。
Key words： Pif1； Rrm3； Pfh1p； Helicase； DNA replication
从很多种资源中 纯 化 出 来 的，包括杆状病毒感染的 Sf9 昆虫细 胞［5］、大 肠 埃 希 菌［7］ 或酵母菌线粒体膜对此蛋白 的过 量 表 达［6］。 不 同 于 其 他 Pif1 家族解螺旋酶，ScPif1 是可 溶 的 并 且 相 当 容 易 纯化。
酿酒酵母 Pif1 蛋白是 Pif1 家族解旋酶的创始成 员，在 筛 选 影 响 线 粒 体 DNA 的 基 因 时 被 首 次 发 现［1］，后来在筛 选 影 响 端 粒 的 突 变 因 素 时 也 发 现 了 酿酒酵母 Pif1 蛋白，表明其在细胞核中也有作用［3］。 线粒体和细胞核的两个 Pif1 基因亚型都是从单一的 酿酒酵母 Pif1 基因开放阅读框表达的，但翻译起始 位点不同。线粒体定位信号位于第一和第二翻译起 始位点之间［4］，在线粒体 Pif1 从第一起始点开始翻 译。蛋白质印迹实验检测分析两种异构体： 较大的 亚型对应核细胞； 略小的亚型对应线粒体，能切断线
解螺旋 酶 在 所 有 生 物 体 都 广 泛 存 在，参 与 几 乎 所有的核酸代谢过程。Pif1 解旋酶家族存在于所有 的真核生物中，具有 5'-3'方向活性，且依赖 ATP。解 旋酶根据其模序不同可分为超级家族Ⅰ和Ⅱ，Pif1 解 旋酶家族属于超级家族Ⅰ。1983 年，酿酒酵母 Pif1 基因被分离出来［1］，并且最终确定酿酒酵母 Pif1 蛋 白（ ScPif1） 为解旋酶［2］，对解旋酶 Pif1 家族的研究主 要集中在其维持细胞核和线粒体基因组稳定性方面 的作用。在 酵 母 菌、寄 生 虫 及 哺 乳 动 物 中 均 有 对 ScPif1 和其同源蛋白的研究。 1 酿酒酵母 Pif1 蛋白
医学综述 2013 年 1 月第 19 卷第 2 期 Medical Recapitulate，Jan． 2013，Vol． 19，No． 2
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Pif1 解旋酶家族功能的研究进展
中图分类号： R34； R55
王 攀△ （ 综述） ，顾永清※ （ 审校）
（ 新疆石河子大学医学院，新疆 石河子 832000）