免疫试验设计演示文稿

3 拟解决的关键问题

1正确制作好所需的佐剂并进一步应用。 2、设计空白对照实验观察所制佐剂的 实际效果。
三、研究方法、技术路线

1 W／O／W型乳剂的制作 2 实验
1 W／O／W型乳剂的制作
其中内水相：油相：外水相=30：4ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ：30，
佐剂的制作分两步， 第一步：按W／O型乳剂的制作方法制作W ／O初乳； 第二步：使用螺旋桨叶片（Eurostar mixer） (IKA,Germany)1000rpm乳化即可;
2 实验
l、分组： 将纯系小鼠随机分成4大组(24只／大组) (1) 空白对照组(注射生理盐 水)（2）W／O／W型乳剂对照组(3)乙肝疫苗对照组(4)W／O／W型 乳剂和乙肝疫苗实验组 每大组又分三小组(8只／小组)，即单次免疫组、二次免疫组、四次免 疫组； 2、免疫方法： 单次免疫组在0天免疫一次，二次免疫组在0天、14天各免疫1次，四 次免疫组在0天、7天、14天、21天各免疫1次，均经背部皮下免疫。 3、血清检测：单次免疫组、二次免疫组、四次免疫组均在第7天、第 14天、第21天、第30天、第45天、第60天各通过小鼠眼内眦静脉采 血，分离血清置入-80OC保存待测。用ELISA法检测血清抗乙肝疫苗 IgG、IgM的滴度，分别比较各组产生抗乙肝疫苗抗体滴度的差异，并 观察各组抗乙肝疫苗抗体滴度的动态变化。
2 国内外研究现状、水平和发展趋势
脂质体是由脂质双层构成的合成球，其中可以包裹抗原，进 以作为疫苗的投递载体和佐剂。脂质体的佐剂效力依赖于其 所含脂质层的数目，所带电荷，组分以及制备方法[2-4]。 近期肿瘤疫苗的研究结果表明，通过选择脂质体的脂质成分， 可使其表面连接的肿瘤抗原更适于被递呈给APC，并诱导产 生抗肿瘤免疫。在含有不饱和脂肪酸的脂质体中，与其连接 的抗原具有更高的交叉递呈能力。之后这个发现又被进一步 证实:实验表明可在小鼠体内诱导产生CTL反应进而清除肿瘤 [5]。尽管脂质体是研究最为广泛的抗原投递系统的一种， 但目前仍是一些新型免疫加强策略的研究对象。实验表明， 将DNA和蛋白共同包裹入脂质体所产生的协同效应超过了质 粒DNA和脂质体己知的佐剂效应。这种接种的新方法被命名 为“共投递”(co-delivery)，可能是由同一个APC同时通过 MHC-I类和II类分子递呈途径将抗原递呈给CD8+和CD4+细胞 的结果，这种递呈模式经常发生在对活的病毒病原体的免疫 应答中[6]。
2 研究目标




本实验将改良的疫苗注射到小鼠体内，观察 小鼠血清中抗体的含量。 1、W／O／W型乳剂的制作 2、分组并进行单次免疫组、二次免疫组、 四次免疫组实验 3、进行血清检测研究目标： W／O／W型乳剂有显著增强小鼠抗乙肝疫 苗免疫效果的作用：W／O／W型乳剂作为乙 肝疫苗的佐剂可显著提高小鼠对乙肝疫苗诱 导产生抗乙肝疫苗IgG抗体浓度，且可延长 抗体的维持时间；在诱导小鼠抗一HBs抗体 产生方面，LPSp与铝佐剂具有相似的佐剂效 应，且与疫苗中的铝佐剂具有协同效应，提
表1小鼠免疫后不同时间乙肝疫苗IgG抗体滴度 测定结果
第7天 空白 W／O／ W型乳 剂 第14天 第21天 第30天 第45天 第60天
乙肝 疫苗
W／O／ W型乳 剂和乙 肝疫苗
表2小鼠体内抗乙肝病毒Hbc 抗Hbs 抗Hbe的 量
抗乙肝病毒 Hbc 空白 W／O／W型 乳剂 乙肝疫苗 W／O／W型 乳剂和乙肝疫 苗 抗Hbs 抗Hbe
3预实验结果及后续打算：
• 2012年9 月 至2012年12月：搜集资料，购买实验 材料 • 2013年1月 至2013年6 月：实验组和空白组进行 免疫实验并观察结果。 • W／O／W型乳剂有显著增强小鼠抗乙肝疫苗免疫 效果的作用。 • 2013年6 月 至2013年 9月：结题
二、研究内容、研究目标和拟解决的关键 问题
对脂质A有增强小鼠抗乙肝疫苗免 疫效果作用的研究
英双二班 6109006048张苹6109006049张琼 6109006050张永婷6109006051陈彬 6109006052崔健6019006053韩振东 6109006054黄鑫禹6109006055林强
一、立题依据
1 选题原因 2 国内外研究现状、水平和发展趋势 3 预实验结果及后续打算
1 选题原因

近年来乙肝又在国内流行,普通的乙肝疫苗产生的抗 体有一定的年限，一定时间后不能确定体内是否含 有乙肝的抗体，所以需要研制一种疫苗能够延长记 忆B细胞存在时间，且注射疫苗后抗体检测阳性率增 加，避免注射后抗体不产生的可能性。疫苗免疫激 活作用通常较弱，不足以刺激机体产生足够的抗体 因此常在疫苗中加入佐剂，可以延缓抗原释放率， 延长免疫反应，提高记忆细胞的数量，能够聚集抗 原，有效提高免疫球蛋白受体的聚集度。此研究试 图改变佐剂的结构，进一步改善疫苗的作用时间， 增加记忆细胞的数量，及延长抗体的存在时间，以 达到终身免疫的效果。另外，该实验设计完全具有 可行性：首先本实验所需实验室及实验设备器材等 均可以在本校内实现。其次指导老师做项目指导， 为实验中所遇问题给予指导和帮助。最后项目参加 人员对本项目有热情有信心，并有时间和精力完成
谢谢！

1研究内容 2研究目标 3拟解决的关键问题
1 研究内容

脂质A是一种糖磷脂，双糖骨架的游离羟基和氨基 可携带多种长链脂肪酸和磷酸基团，且是内毒素 毒性与生物活性的主要组成成分。乙肝减毒活疫 苗需要注射三次，通过佐剂的改变，使达到一次 性免疫。脂质A作为一种表面活性物质，添加于水 包油包水型亚微型或微型球状微囊结构的乳剂中 （静脉注射一般要求80%乳滴直径小于1um,乳 滴直径均匀），其具有的亲水性与疏水性亦可以 增加自身作为佐剂的稳定性，其本身亦具有抗原 性，具有免疫激活作用，促进APC吞噬抗原，； 佐剂球状微囊结构使乙肝病毒疫苗缓慢释放，由 于抗原被集中在佐剂系统的微粒表面或内部，所 以抗原达到有效浓度的增加，增强体液免疫与细 胞中介免疫反应，通过缓解释放抗原提高特异性 抗体的质量与数量改变抗原的物理状态。



（二）免疫次数对诱导小鼠产生抗乙肝疫苗IgG抗体的 预期影响结果
W／O／W型乳剂加乙肝疫苗实验组、W／O／W型乳剂对照组、乙肝 疫苗对照组同一时间不同免疫次数之间抗乙肝疫苗IgG抗体滴度各大 组内免疫四次的小鼠产生IgG抗体滴度均显著高于免疫二次 (P<0．05)，免疫二次也显著高于免疫一次(P<0．05)。
四、预期研究结果

（一）各实验组诱导小鼠产生抗乙肝疫苗IgG抗体滴度预 期结果
1、W／O／W型乳剂加乙肝疫苗实验组一次免疫、二次免疫、四次 免疫诱导产生的IgG抗体滴度均显著高于乙肝疫苗对照组、空白对照 组(P<0．05)。 2、W／O／W型乳剂加乙肝疫苗实验组四次免疫在多天后仍呈上升趋 势，而乙肝疫苗对照组四次免疫IgG抗体滴度达高峰后，随着时间的 延长抗体滴度均逐渐下降。


（三）小鼠血清抗乙肝疫苗IgM抗体的预期检测结果
W／O／W型乳剂加乙肝疫苗实验组在每一次免疫后IgM抗体滴度分别 显著高于未加W／O／W型乳剂的乙肝疫苗对照组与W／O／W型乳剂对 照组。虽然一段时间后IgM抗体滴度下降，但再次免疫时又出现以上 情况。
五、参考文献
[1]现代免疫佐剂研究作者 王大勇 于青海 周园 2004.4.30. [2]Heath TD，Edwards DC，Ryman BE.The adjuvant properties of liposomes.Biochem Soc Trans 1976;4:49 一52. [3]Tyrrel DA,Heath TD,Colley CM,Ryman BE.New aspects of liposomes.Biochim Biophys Acta 1976;457:259-63. [4]van Rooijen N,van Nieuwmegen e of liposomes as biodegradable and harmless adjuvants.Methods Enzymol 1983;93:83-5. [5]TaneichiM，Ishida H，Kajino K，Ogasawara K， Tanaka Y，KasaiM，etal.Antigen chemically coupled to the surface of liposomes are crosspresented to CD8+ T cells and induce potent antitumor immunity.J Immunol 2006;177:2324-30. [6] Laing P,Bacon A,McCormack B,Gregoriadis G,Frisch B,Schuber F.The‘co-delivery’approach to liposomal vaeeines:application to the development of influenza-A and hepatitis-B vaccine candidates.J