液相及液质分析方法学开发及验证
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浓度2:80% 原料及制剂
浓度3:100% 原料及制剂
浓度4: 120% 原料及制剂
浓度5: 140% 原料及制剂
精密度 1-3天
六次重复, 100% 原料药
定量限
浓度1 原料药
浓度2 原料药
浓度3 原料药
浓度4 原料药
浓度5 原料药
定量限 精密度
定量限 原料药
检测限
六次空白样品 的基线噪音
方法验证的复杂性
12源自文库
液相色谱的方法开发
13
液相色谱的方法开发
• 根据分析物的化学性质选配色谱条件
– 基于既往经验及思考进行合理猜测 – 通常辅以资料参考 – 询问同事
• “步进式”测试开发
– 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行
• 系统性筛选策略
– 先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试 • 评估结果，选择最有效的条件组合
定量
限度试验
准确度
+
+
*
精密度
+
+
-
专属性
+
+
+
检测限
-
-
+
定量限
-
+
-
线性
+
+
-
范围
+
+
*
* 可能需要，具体与特定试验的性质有关。
9
类型3
* + * * * * *
类型4
鉴别试验
+ -
如何进行方法验证
• 分析实验阶段
– 按照规定的实验计划或步骤
• 通常需要3 到 5天
– 在不同操作条件下，进不同浓度的试样 – 原料及制剂皆需分析
分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。
2
实验室获得方法及运用过程
方法开发 方法验证 方法确认 方法转移
3
分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等） 及优化（梯度、柱温、流速等）
准确度，精密度，专属性，检测限， 定量限，线性，范围，耐用性
法定检验方法在使用环境中适用性评 估（人员、仪器、样品、试剂）
• 拖尾因子
– T2
• 理论塔板数
– 通常 N > 2000
7
方法验证- USP<1225>
• 类型1
– 主组份或活性成份定量分析方法
• 类型2
– 杂质或降解化合物测定方法
• 类型3
– 性能特点之确定分析方法
• 如溶出度实验
• 类型4
– 鉴别试验
8
方法验证- USP<1225>
验证的内容
类型1
类型2
• 四元溶剂或二元混合使方法开发更方便
17
影响选择性的主要因素
固定相 有机溶剂 流动相pH值 梯度
18
固定相
19
固定相
传统硅胶颗粒基质
硅羟基
合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
Polyethoxysilane
准确度（Accuracy） 精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精密度 专属性（Specificity） 检测限（LOD） 定量限（LOQ） 线性（Linearity） 范围（Range） 耐用性（Robustness）
5
方法验证-系统适用性
• 系统适用性试验的内容
– 在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系 统之性能达到规定的要求
• 每一方法验证的过程由80到100次分析组成 • 每次分析中，仅一种组分（一个色谱峰）即
可产生7个相关结果（峰面积，保留时间，分 离度等……） • 每一组分最终得到总共约700 个数字 • 所有这些数字需要进行数学处理：
– 手工处理（计算器，Excel Macro’s 等） – 专用的方法验证程序
% Improvement
20 – 40% 15 – 20% > 400%
影响分离度的因素
16
UPLC技术加速方法开发过程
能够在一个工作日内完成方法开发!
• 对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行 系统性筛查
• 高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨 分离在更快的同时分离能力不打折扣
• 可自动选择色谱柱和流动相
非法定检验方法在实验室之间传递的 文件化过程
实验室获得方法及运用过程
方法验证
- 用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法
方法确认
- 用一个确定方法来挑战现实的分析环境 - 专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ - 一般不需要进行线性，范围，耐用性实验
4
方法验证的内容
ICH、USP<1225>、ChP II Appendix XIX A
Impact on Resolution
Double N
Double k
15
Double α
Maximized in UPLC Separations by:
▪Range of column chemistries ▪Multiple particle substrates ▪Wide usable pH range ▪High retentivity ▪Wide range in selectivity
– 再进行方法优化 • 梯度/温度
14
影响分离度的因素选择性最为重要
Rs N 1 k
4
k 1
Maximized in UPLC Separations by:
▪Ultra-low dispersion system ▪Small [< 2 µm] particles ▪Higher pressure capability ▪Well-designed columns
• 数据分析阶段
– 对分析结果进行统计学计算
• 色谱结果是相对的 • 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真
实变化
10
方法验证步骤
耐用性
实验参数 1 Min & Max
实验参数 2 Min & Max
实验参数 3 Min & Max
实验参数 4 Min & Max
11
线性 Day 1-3
浓度1: 60% 原料及制剂
– 塔板数，拖尾因子，分离度 – 确定重现性（%RSD）
• 系统适用性“样品”
– 主组份与预期副产物之混合物 – 系统适用性试验是色谱方法的一部分
6
方法验证-系统适用性
• 容量因子
– k' > 2
• 精密度/进样重复性
• RSD 1%, n 5 • 分离度
– Rs 2 (主峰与最近洗脱 的色谱峰之间)
HPLC及HPLC/MS法
• 基于分离分析科学技术
– 小颗粒填料的色谱柱 – 以光谱、质谱技术作为检测手段
• 专属性、分离效率及灵敏度
– 适用于广泛的色谱应用 – 适用于开发新方法 – 适用于现有方法的改进
1
分析方法学的开发及验证
• 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 • 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） • 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品
浓度3:100% 原料及制剂
浓度4: 120% 原料及制剂
浓度5: 140% 原料及制剂
精密度 1-3天
六次重复, 100% 原料药
定量限
浓度1 原料药
浓度2 原料药
浓度3 原料药
浓度4 原料药
浓度5 原料药
定量限 精密度
定量限 原料药
检测限
六次空白样品 的基线噪音
方法验证的复杂性
12源自文库
液相色谱的方法开发
13
液相色谱的方法开发
• 根据分析物的化学性质选配色谱条件
– 基于既往经验及思考进行合理猜测 – 通常辅以资料参考 – 询问同事
• “步进式”测试开发
– 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行
• 系统性筛选策略
– 先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试 • 评估结果，选择最有效的条件组合
定量
限度试验
准确度
+
+
*
精密度
+
+
-
专属性
+
+
+
检测限
-
-
+
定量限
-
+
-
线性
+
+
-
范围
+
+
*
* 可能需要，具体与特定试验的性质有关。
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类型3
* + * * * * *
类型4
鉴别试验
+ -
如何进行方法验证
• 分析实验阶段
– 按照规定的实验计划或步骤
• 通常需要3 到 5天
– 在不同操作条件下，进不同浓度的试样 – 原料及制剂皆需分析
分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。
2
实验室获得方法及运用过程
方法开发 方法验证 方法确认 方法转移
3
分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等） 及优化（梯度、柱温、流速等）
准确度，精密度，专属性，检测限， 定量限，线性，范围，耐用性
法定检验方法在使用环境中适用性评 估（人员、仪器、样品、试剂）
• 拖尾因子
– T2
• 理论塔板数
– 通常 N > 2000
7
方法验证- USP<1225>
• 类型1
– 主组份或活性成份定量分析方法
• 类型2
– 杂质或降解化合物测定方法
• 类型3
– 性能特点之确定分析方法
• 如溶出度实验
• 类型4
– 鉴别试验
8
方法验证- USP<1225>
验证的内容
类型1
类型2
• 四元溶剂或二元混合使方法开发更方便
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影响选择性的主要因素
固定相 有机溶剂 流动相pH值 梯度
18
固定相
19
固定相
传统硅胶颗粒基质
硅羟基
合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
Polyethoxysilane
准确度（Accuracy） 精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精密度 专属性（Specificity） 检测限（LOD） 定量限（LOQ） 线性（Linearity） 范围（Range） 耐用性（Robustness）
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方法验证-系统适用性
• 系统适用性试验的内容
– 在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系 统之性能达到规定的要求
• 每一方法验证的过程由80到100次分析组成 • 每次分析中，仅一种组分（一个色谱峰）即
可产生7个相关结果（峰面积，保留时间，分 离度等……） • 每一组分最终得到总共约700 个数字 • 所有这些数字需要进行数学处理：
– 手工处理（计算器，Excel Macro’s 等） – 专用的方法验证程序
% Improvement
20 – 40% 15 – 20% > 400%
影响分离度的因素
16
UPLC技术加速方法开发过程
能够在一个工作日内完成方法开发!
• 对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行 系统性筛查
• 高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨 分离在更快的同时分离能力不打折扣
• 可自动选择色谱柱和流动相
非法定检验方法在实验室之间传递的 文件化过程
实验室获得方法及运用过程
方法验证
- 用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法
方法确认
- 用一个确定方法来挑战现实的分析环境 - 专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ - 一般不需要进行线性，范围，耐用性实验
4
方法验证的内容
ICH、USP<1225>、ChP II Appendix XIX A
Impact on Resolution
Double N
Double k
15
Double α
Maximized in UPLC Separations by:
▪Range of column chemistries ▪Multiple particle substrates ▪Wide usable pH range ▪High retentivity ▪Wide range in selectivity
– 再进行方法优化 • 梯度/温度
14
影响分离度的因素选择性最为重要
Rs N 1 k
4
k 1
Maximized in UPLC Separations by:
▪Ultra-low dispersion system ▪Small [< 2 µm] particles ▪Higher pressure capability ▪Well-designed columns
• 数据分析阶段
– 对分析结果进行统计学计算
• 色谱结果是相对的 • 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真
实变化
10
方法验证步骤
耐用性
实验参数 1 Min & Max
实验参数 2 Min & Max
实验参数 3 Min & Max
实验参数 4 Min & Max
11
线性 Day 1-3
浓度1: 60% 原料及制剂
– 塔板数，拖尾因子，分离度 – 确定重现性（%RSD）
• 系统适用性“样品”
– 主组份与预期副产物之混合物 – 系统适用性试验是色谱方法的一部分
6
方法验证-系统适用性
• 容量因子
– k' > 2
• 精密度/进样重复性
• RSD 1%, n 5 • 分离度
– Rs 2 (主峰与最近洗脱 的色谱峰之间)
HPLC及HPLC/MS法
• 基于分离分析科学技术
– 小颗粒填料的色谱柱 – 以光谱、质谱技术作为检测手段
• 专属性、分离效率及灵敏度
– 适用于广泛的色谱应用 – 适用于开发新方法 – 适用于现有方法的改进
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分析方法学的开发及验证
• 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 • 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） • 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品