第10章经典液相色谱法

二、载体 载体(担体): 惰性物质, 要有较大的表面积(起负载固定 液的作用)。 有硅胶、纤潍素、硅藻土等 三、固定液及其选择 正相分配色谱，其固定相的极性大于流动相，即以强极 性溶剂作为固定液，以弱极性的有机溶剂作为流动相； 反相分配色谱，其固定液具有较小的极性，而流动相则 极性较大。 正相色谱与反相色谱的比较 正相 反相 固定相极性 大 小 流动相极性 小 大 适于分离的物质 极性物质 中等极性至非极性的物质 流出顺序 极性小的组分先流出柱 极性大的组分先流出
（2）凸形吸附等温线 在绝大多数情况下，吸附等温线 都有些弯曲而呈现凸形吸附等温线。其中主要原因之一是 固体吸附剂表面的不均一性。 例如硅胶表面上有几种吸附 能力不同的吸附中心——强的、较强的、弱的、极弱的 同一溶质分子总是先占据强的吸附中心，两者之间作 用力强，溶质分子被吸附得牢，吸附平衡常数K值大，迁 移速率慢；后占据弱的吸附中心，两者之间作用力弱，吸 附平衡常数K值小，迁移速率快，并依此类推。 显然，同一溶质分子具有不同的吸附平衡常数K，即具 有不同的迁移速率。在溶质分子集中的区域，吸附剂的所 有吸附中心达到吸附饱和，K值小，迁移速率快，先流出 色谱柱；在溶质分子稀少的区域，由于仅仅占据了强吸附 中心，K值大，迁移速率慢，后流出色谱柱。从而导致流 出曲线前沿陡峭，后沿拖尾，形成拖尾峰，且保留时间亦 随样品量的增加而减小。如图10-2B所示。
(2) 硅胶: 吸附能力稍弱于氧化铝,用于分离弱酸与中性物(如
有机酸、氨基酸、甾体等)。硅醇基是使硅胶有一 定吸附能力的活性基团。
三种存在形式:
O H Si OH Si O Si O H O Si
பைடு நூலகம்

Ⅰ 自由型
Ⅰ 束缚型Ⅰ
Ⅰ Ⅰ 活泼型Ⅰ
吸附能力 ：Ⅲ >Ⅰ>Ⅱ 活性大小 ：Ⅲ >Ⅰ>Ⅱ
(3) 聚酰胺:由酰胺聚合而成的高分子物质。
O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C N H n
其吸附原理利用分子内酰胺基和羰基。 酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中的羟基或羧 基形成氢键； 酰胺基中的氨基与醌类、硝基类中的醌基、硝基形 成氢键而产生吸附作用。不同的化合物，由于活性基团 的种类、数目与位置的不同，形成氢键的能力不同，而 实现分离。 对位间位取代基均能形成氢键的,吸附力增大。邻位 基团间能形成分子内氢键的,吸附力减小。芳香核具有较 多共轭键时,吸附力增大。
2. 吸附剂的活性：
氧化铝、硅胶的吸附力的大小, 还与其含水量有较大的关系：
表10-1 硅胶、氧化铝的含水量与活度级别的关系
硅胶含水量 （%） 0 5 15 25 38
氧化铝含水 量（%） 0 3 6 10 15
活度级别 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
注意:吸附剂的吸附活性(能力)与活度级别的相反关系
活度级数 小 大
第10章
经典 液相色谱
§1 §2 §3 §4 §5 §6
LSC
LLC
ICE SCE TLC PC
经典液相色谱法包括经典柱色谱法和平面色谱 法，是在常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱 方法。 经典色谱法与现代色谱法的区别主要在于输送流 动相方式、固定相种类和规格、分离效能、分析速度 和检测灵敏度等方面。 经典液相色谱法设备简单，操作方便，分析速度 快。在药物研究、食品化学、环境化学、临床化学、 法检分析及化学化工等领域都有广泛的应用。特别是 在天然药物成分的鉴别、分离等方面发挥着独特的作 用，是中药鉴别的主要方法之一。
被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢! 常见的化合物极性大小顺序: 烷烃 < 烯烃 < 醚类 < 硝基化合物 < 二甲胺 < 脂类 < 酮类
< 醛类 < 硫醇 < 胺类 < 酰胺 < 醇类 < 酚类 < 羧酸类
被分离物质的极性与结构的关系 (1) 基本母核相同 , 基团极性愈大 , 分子极性愈大。 基本母核相同 , 极性基团数目愈多 , 分子极性愈大。
2．加样与洗脱
加样的方法有三种：①试样配成浓溶液，用吸管轻轻沿管 壁加入柱内，然后加流动相洗脱。 ② 试样溶液 0.5～1g 吸附剂 挥干溶剂 吸附了样品的吸附剂 ③用一块比色谱柱内径略小的圆形滤纸吸附试样溶液，待溶 剂挥发后，加入柱内，然后加流动相洗脱。
洗脱时,应连续不断地加入洗脱剂，切勿断流。 并调节 一定的流速。 3．检出 可以通过分段收集流出液，采用相应的物理和化学方法 进行检出。 对有色混合物，很容易观察化合物的分离情况，对无色 物质，可用紫外光观察荧光色带而检出。也可用荧光吸附 剂，通过荧光熄灭定位。
2吸附等温线
一定温度与压力下,某组分在吸附剂表面吸附平衡,该 组分在两相中的浓度相关曲线。
（1）线性吸附等温线 吸附平衡常数K为一定值时，则吸 附等温线为线型。即达到平衡时，组分在固定相中的浓度 Cs与其在流动相中的浓度Cm 成正比(Cs=KCm)，直线的 斜率为K。 线型吸附等温线是理想的等温线，同一种溶质的平衡常 数K与溶液的浓度无关，即K为一常数。组分流出速度不受 浓度的影响，故在洗脱或展开时，同一溶质分子在柱内具 有相同的迁移速率，能得到左右对称的流出曲线。如图102A所示。
一、基本原理 1．吸附与吸附平衡 吸附是指 溶质分子与吸附剂分子之间所 存在的某些化学作用力而被吸 附在吸附剂的表面。 吸附过程则是试样中溶质分 子（X）与流动相分子（Y）争 夺吸附剂表面活性中心的过程 ，即为竞争吸附过程 （图10-1 ）。
Xm + nYa
吸附 解吸附
Xa + nYm
图10-1 吸附色谱示意图 m.流动相 a.吸附剂 Xm.流 动相中溶质分子 Ym.流动相分 子 Xa.被吸附的溶质分子
(2) 分子双键多, 吸附力 ↑, 共轭度↑, 吸附性↑ 。
(3) 空间排列 , 影响极性。
如：
OH C O O H O
<
HO
C OH
2. 吸附剂的活性: 吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强 被分离物质的极性 吸附剂活性 大 应选 → 小 防吸附太牢,难洗脱 小 应选→ 大 防tR太小,不易分离
第2节 液～液分配柱色谱法（LLC）
1940年英国人Maritin (马丁) , Sngger(辛格) 分配色谱获诺 贝尔奖金。1952年两人再度合作,发明气相色谱。 经 典 的 液 — 液 分 配 色 谱 (liquid liquid partition chromatography，LLC)是将某种溶剂（固定液）涂布在 多孔微粒的表面或纸纤维上，形成一层液膜，构成固定相 。多孔微粒或纸纤维称为支持剂(solid support)或载体 (carrier)、担体。 一、 基本原理: 有些强极性化合物, 能被吸附剂强烈吸附, 即使使用 洗脱能力很强的流动相也难推动, 从而使吸附色谱无法分离。 为克服之，发明了液—液色谱。 利用混合物中各组分在两相中溶解度不同而达到分离。 K = Cs / Cm
二、 吸附剂
对吸附剂的要求： (1)表面积大，具有一定的吸附能力。 (2)不应与流动相发生化学反应。 (3)粒度要细，一般要150目。 1. 吸附剂：常用的有：氧化铝、聚酰胺、硅胶等。
酸性pH = 5～4 分离酸性物质. 如氨基酸
氧化铝 分离生物碱. 如挥发油,甾体等 分离碱性. 如生物碱
(1) 中性pH = 7.5 碱性pH =9～10
五、操作方法
1．固定液的涂布与装柱 装柱前，首先将固定液与载体混合。如果用硅胶、纤维素 等作载体时，可直接称出一定量的载体，再加入一定比例的 固定液，混匀后即可装柱。
2．加样和洗脱
第3节. 离子交换色谱
固定相: 离子交换树脂 流动相: 水溶液或缓冲液 分离机制: 差速迁移 分离对象: 离子化合物 (一)树脂分类: 具有网状立体结构的高分子聚合物。
3. 流动相: 流动相极性↑大，对被测组分的洗脱能力↑大 常用流动相极性强弱顺序: 石油醚 < 环己烷 < 四氯化碳 < 苯 < 甲苯几 < 乙醚 < 氯仿 < 醋酸乙酯 < 正丁醇 < 丙醇 < 乙醇、甲醇 < 水
被分离物质的极性 吸附剂活性 流动相极性
大 小
小 大
大 小
以上三方面只是一般性原则 , 至于使用哪种 , 要由实验来 摸索。流动相选择灵活性很大 , 往往可用一元 , 配两元或三 元。也可采用梯度洗脱等技术 。
图10-3 关系
化合物极性\吸附剂活度和洗脱剂极性间的
四、操作方法
1．色谱柱的制备
内径与柱长的比例，一般在1:10～20之间. 颗粒大小一般应在100~200目 样品重量:氧化铝重量=1:20~50，对于难分离化合物， 氧化铝用量可增加至100~200倍； 硅胶作固定相其比例一般为1:30~60，如为难分离化合 物，可高达1:500~1000。 (1)玻璃柱 干法装柱 湿法装柱 （2）尼龙柱
含水量 少 多
活性 大 小
吸附能力 强 弱
所以，加热除水，活性提高，吸附力加强。 加一定水，活性下降，吸附力减弱。 活化：105～110℃加热除水为活化。 脱活：加一定水份，降低活性。
三、色谱条件的选择 • 由于吸附剂的种类有限，因此，当被分离物质、吸附剂种类 一定时，分离成败 的关键取决于流动相的选择 流动相又称洗脱剂、展开剂或移动相。 要求: 1. 纯度高 2. 稳定(对样品和吸附剂不反应) 3. 对样品溶解度大 4. 粘度小(易洗脱)。 1. 被分离物质的极性
吸附平衡常数: Ka =
[Xa][Ym]
n
[Xm][Ya] n
由于流动相分子是大量的,所以[Ym]/ [Ya ]可视为常数。
∴ K
R
X a X a / Sa Cs X m X m / Vm Cm
（10-2）
S a为吸附剂的表面积， Vm 为流动相的体积，Cs为溶质在固