第10章经典液相色谱法

2．加样与洗脱
加样的方法有三种：①试样配成浓溶液，用吸管轻轻沿管 壁加入柱内，然后加流动相洗脱。 ② 试样溶液 0.5～1g 吸附剂 挥干溶剂 吸附了样品的吸附剂 ③用一块比色谱柱内径略小的圆形滤纸吸附试样溶液，待溶 剂挥发后，加入柱内，然后加流动相洗脱。
洗脱时,应连续不断地加入洗脱剂，切勿断流。 并调节 一定的流速。 3．检出 可以通过分段收集流出液，采用相应的物理和化学方法 进行检出。 对有色混合物，很容易观察化合物的分离情况，对无色 物质，可用紫外光观察荧光色带而检出。也可用荧光吸附 剂，通过荧光熄灭定位。
O CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 C N H n
其吸附原理利用分子内酰胺基和羰基。 酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中的羟基或羧 基形成氢键； 酰胺基中的氨基与醌类、硝基类中的醌基、硝基形 成氢键而产生吸附作用。不同的化合物，由于活性基团 的种类、数目与位置的不同，形成氢键的能力不同，而 实现分离。 对位间位取代基均能形成氢键的,吸附力增大。邻位 基团间能形成分子内氢键的,吸附力减小。芳香核具有较 多共轭键时,吸附力增大。
wk.baidu.com、操作方法
1．固定液的涂布与装柱 装柱前，首先将固定液与载体混合。如果用硅胶、纤维素 等作载体时，可直接称出一定量的载体，再加入一定比例的 固定液，混匀后即可装柱。
2．加样和洗脱
第3节. 离子交换色谱
固定相: 离子交换树脂 流动相: 水溶液或缓冲液 分离机制: 差速迁移 分离对象: 离子化合物 (一)树脂分类: 具有网状立体结构的高分子聚合物。
含水量 少 多
活性 大 小
吸附能力 强 弱
所以，加热除水，活性提高，吸附力加强。 加一定水，活性下降，吸附力减弱。 活化：105～110℃加热除水为活化。 脱活：加一定水份，降低活性。
三、色谱条件的选择 • 由于吸附剂的种类有限，因此，当被分离物质、吸附剂种类 一定时，分离成败 的关键取决于流动相的选择 流动相又称洗脱剂、展开剂或移动相。 要求: 1. 纯度高 2. 稳定(对样品和吸附剂不反应) 3. 对样品溶解度大 4. 粘度小(易洗脱)。 1. 被分离物质的极性
(2) 分子双键多, 吸附力 ↑, 共轭度↑, 吸附性↑ 。
(3) 空间排列 , 影响极性。
如：
OH C O O H O
<
HO
C OH
2. 吸附剂的活性: 吸附剂的活性↑大，对被测组分的吸附能力↑强 被分离物质的极性 吸附剂活性 大 应选 → 小 防吸附太牢,难洗脱 小 应选→ 大 防tR太小,不易分离
（2）凸形吸附等温线 在绝大多数情况下，吸附等温线 都有些弯曲而呈现凸形吸附等温线。其中主要原因之一是 固体吸附剂表面的不均一性。 例如硅胶表面上有几种吸附 能力不同的吸附中心——强的、较强的、弱的、极弱的 同一溶质分子总是先占据强的吸附中心，两者之间作 用力强，溶质分子被吸附得牢，吸附平衡常数K值大，迁 移速率慢；后占据弱的吸附中心，两者之间作用力弱，吸 附平衡常数K值小，迁移速率快，并依此类推。 显然，同一溶质分子具有不同的吸附平衡常数K，即具 有不同的迁移速率。在溶质分子集中的区域，吸附剂的所 有吸附中心达到吸附饱和，K值小，迁移速率快，先流出 色谱柱；在溶质分子稀少的区域，由于仅仅占据了强吸附 中心，K值大，迁移速率慢，后流出色谱柱。从而导致流 出曲线前沿陡峭，后沿拖尾，形成拖尾峰，且保留时间亦 随样品量的增加而减小。如图10-2B所示。
二、载体 载体(担体): 惰性物质, 要有较大的表面积(起负载固定 液的作用)。 有硅胶、纤潍素、硅藻土等 三、固定液及其选择 正相分配色谱，其固定相的极性大于流动相，即以强极 性溶剂作为固定液，以弱极性的有机溶剂作为流动相； 反相分配色谱，其固定液具有较小的极性，而流动相则 极性较大。 正相色谱与反相色谱的比较 正相 反相 固定相极性 大 小 流动相极性 小 大 适于分离的物质 极性物质 中等极性至非极性的物质 流出顺序 极性小的组分先流出柱 极性大的组分先流出
（4）大孔吸附树脂 大孔吸附树脂是一种不含交换 基团，具有大孔网状结构的高分子吸附剂。粒度多 为20-60目。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶 剂。大孔树脂可分为非极性和中等极性两类，在水 溶液中吸附力较强且有良好的吸附选择性，而在有 机溶剂中吸附能力较弱。 大孔吸附树脂主要用于水溶性化合物的分离纯化 ，近年来多用于皂苷及其它苷类化合物与水溶性杂 质的分离。也可间接用于水溶液的浓缩，从水溶液 中吸附有效成分。
图10-3 关系
化合物极性\吸附剂活度和洗脱剂极性间的
四、操作方法
1．色谱柱的制备
内径与柱长的比例，一般在1:10～20之间. 颗粒大小一般应在100~200目 样品重量:氧化铝重量=1:20~50，对于难分离化合物， 氧化铝用量可增加至100~200倍； 硅胶作固定相其比例一般为1:30~60，如为难分离化合 物，可高达1:500~1000。 (1)玻璃柱 干法装柱 湿法装柱 （2）尼龙柱
第10章
经典 液相色谱
§1 §2 §3 §4 §5 §6
LSC
LLC
ICE SCE TLC PC
经典液相色谱法包括经典柱色谱法和平面色谱 法，是在常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱 方法。 经典色谱法与现代色谱法的区别主要在于输送流 动相方式、固定相种类和规格、分离效能、分析速度 和检测灵敏度等方面。 经典液相色谱法设备简单，操作方便，分析速度 快。在药物研究、食品化学、环境化学、临床化学、 法检分析及化学化工等领域都有广泛的应用。特别是 在天然药物成分的鉴别、分离等方面发挥着独特的作 用，是中药鉴别的主要方法之一。
第2节 液～液分配柱色谱法（LLC）
1940年英国人Maritin (马丁) , Sngger(辛格) 分配色谱获诺 贝尔奖金。1952年两人再度合作,发明气相色谱。 经 典 的 液 — 液 分 配 色 谱 (liquid liquid partition chromatography，LLC)是将某种溶剂（固定液）涂布在 多孔微粒的表面或纸纤维上，形成一层液膜，构成固定相 。多孔微粒或纸纤维称为支持剂(solid support)或载体 (carrier)、担体。 一、 基本原理: 有些强极性化合物, 能被吸附剂强烈吸附, 即使使用 洗脱能力很强的流动相也难推动, 从而使吸附色谱无法分离。 为克服之，发明了液—液色谱。 利用混合物中各组分在两相中溶解度不同而达到分离。 K = Cs / Cm
二、 吸附剂
对吸附剂的要求： (1)表面积大，具有一定的吸附能力。 (2)不应与流动相发生化学反应。 (3)粒度要细，一般要150目。 1. 吸附剂：常用的有：氧化铝、聚酰胺、硅胶等。
酸性pH = 5～4 分离酸性物质. 如氨基酸
氧化铝 分离生物碱. 如挥发油,甾体等 分离碱性. 如生物碱
(1) 中性pH = 7.5 碱性pH =9～10
mg/g
拖尾峰的出现对以下产生了不利的影响： ①利用峰面积进行定量时峰面积的积分精度和重现 性。 ②利用峰高定量时检测的灵敏度。 ③定性分析时保留值与物质性质的相关性。 ④组分之间相互分离的程度。 因此应尽量避免色谱峰的拖尾。 克服的方法是：减小进样量或样品的浓度，即 利用凸形吸附等温线的直线部分，从而得到左右对 称的流出曲线。
一、基本原理 1．吸附与吸附平衡 吸附是指 溶质分子与吸附剂分子之间所 存在的某些化学作用力而被吸 附在吸附剂的表面。 吸附过程则是试样中溶质分 子（X）与流动相分子（Y）争 夺吸附剂表面活性中心的过程 ，即为竞争吸附过程 （图10-1 ）。
Xm + nYa
吸附 解吸附
Xa + nYm
图10-1 吸附色谱示意图 m.流动相 a.吸附剂 Xm.流 动相中溶质分子 Ym.流动相分 子 Xa.被吸附的溶质分子
吸附平衡常数: Ka =
[Xa][Ym]
n
[Xm][Ya] n
由于流动相分子是大量的,所以[Ym]/ [Ya ]可视为常数。
∴ K
R
X a X a / Sa Cs X m X m / Vm Cm
（10-2）
S a为吸附剂的表面积， Vm 为流动相的体积，Cs为溶质在固
定相的浓度，Cm为溶质在流动相中的浓度。吸附平衡常数K 是与组分的性质、吸附剂和流动相的性质与温度有关的一个 常数。 K值小，说明该物质被固定相吸附得不牢固，易被流动相 分子解吸附，在固定相中滞留时间短，在柱中移动速率快， 先流出色谱柱；若K值大，说明该物质被吸附得牢固，在固 定相中滞留时间长，移动速率慢，后流出色谱柱，
2. 吸附剂的活性：
氧化铝、硅胶的吸附力的大小, 还与其含水量有较大的关系：
表10-1 硅胶、氧化铝的含水量与活度级别的关系
硅胶含水量 （%） 0 5 15 25 38
氧化铝含水 量（%） 0 3 6 10 15
活度级别 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
注意:吸附剂的吸附活性(能力)与活度级别的相反关系
活度级数 小 大
（3）凹形：由于进样量较大，影响了固定相的物理性质。 随溶质量的增加, Cs/Cm增加，所以呈凹形。
CS A CS B CS C
吸附等 温
Cm Cm
柱内溶 质浓度 分布
C
Cm
柱内溶 质浓度 的分布 曲线 流出曲 线
C
C
L C C
L C
L
t tR tR
t tR
t
保留时 间与进 样量的 关系
mg/g
mg/g
3. 流动相: 流动相极性↑大，对被测组分的洗脱能力↑大 常用流动相极性强弱顺序: 石油醚 < 环己烷 < 四氯化碳 < 苯 < 甲苯几 < 乙醚 < 氯仿 < 醋酸乙酯 < 正丁醇 < 丙醇 < 乙醇、甲醇 < 水
被分离物质的极性 吸附剂活性 流动相极性
大 小
小 大
大 小
以上三方面只是一般性原则 , 至于使用哪种 , 要由实验来 摸索。流动相选择灵活性很大 , 往往可用一元 , 配两元或三 元。也可采用梯度洗脱等技术 。
2吸附等温线
一定温度与压力下,某组分在吸附剂表面吸附平衡,该 组分在两相中的浓度相关曲线。
（1）线性吸附等温线 吸附平衡常数K为一定值时，则吸 附等温线为线型。即达到平衡时，组分在固定相中的浓度 Cs与其在流动相中的浓度Cm 成正比(Cs=KCm)，直线的 斜率为K。 线型吸附等温线是理想的等温线，同一种溶质的平衡常 数K与溶液的浓度无关，即K为一常数。组分流出速度不受 浓度的影响，故在洗脱或展开时，同一溶质分子在柱内具 有相同的迁移速率，能得到左右对称的流出曲线。如图102A所示。
在正相分配色谱法中，固定液有水、各种缓冲溶 液、稀硫酸、甲醇、甲酰胺或丙二醇等强极性溶剂 ，以及它们的混合液. 在反相分配色谱中，常以硅油、液体石蜡等极性 较小的有机溶剂作为固定液，而以水、水溶液或与 水混溶的有机溶剂为流动相。
四、流动相及其选择 一般正相色谱法常用的流动相有石油醚、醇 类、酮类、酯类、卤代烷类、苯等或它们的混合物 。 反相色谱法常用的流动相则为正相色谱法中 的固定液如水、各种水溶液(包括酸、碱、盐及缓 冲液)或低级醇类等。 注意点：流动相在使用之前，必须先用固定相饱 和,以防固定相流失
第1节 液-固吸附柱色谱法（LSC）
经典的液—固吸附色谱（liquid solid adsorption chromatography，LSC）是以吸附剂为固定相，有 机溶剂为流动相，利用不同组分在吸附剂上吸附性能 的差异，进行分离分析的方法。 用于分离分析极性至弱极性的化合物，不适用于分 离分析强极性的物质。
被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢! 常见的化合物极性大小顺序: 烷烃 < 烯烃 < 醚类 < 硝基化合物 < 二甲胺 < 脂类 < 酮类
< 醛类 < 硫醇 < 胺类 < 酰胺 < 醇类 < 酚类 < 羧酸类
被分离物质的极性与结构的关系 (1) 基本母核相同 , 基团极性愈大 , 分子极性愈大。 基本母核相同 , 极性基团数目愈多 , 分子极性愈大。
(2) 硅胶: 吸附能力稍弱于氧化铝,用于分离弱酸与中性物(如
有机酸、氨基酸、甾体等)。硅醇基是使硅胶有一 定吸附能力的活性基团。
三种存在形式:
O H Si OH Si O Si O H O Si

Ⅰ 自由型
Ⅰ 束缚型Ⅰ
Ⅰ Ⅰ 活泼型Ⅰ
吸附能力 ：Ⅲ >Ⅰ>Ⅱ 活性大小 ：Ⅲ >Ⅰ>Ⅱ
(3) 聚酰胺:由酰胺聚合而成的高分子物质。