《电泳分离技术》PPT课件
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电泳技术参考课件_PPT幻灯片
1983年，Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫时间(外推为零的滞 留时间)与DNA分子大小有关的特性，设计了脉冲电场梯度凝胶，交替 采用两个垂直方向的不均匀电场，使DNA分子在凝胶中不断改变方向， 从而使DNA按分子大小分开。后来，Carle等改进了电泳技术，并发现 周期性的反转换电场(periodic inversion of the electric field) 亦能使大分子DNA通过电泳分开。电泳系统是由一个水平式电泳槽和两 组独立，彼此垂直的电极组成，一组电极负极为N，正极为S；另一组 负极为W，正极为E 。
目前多用琼脂糖为电泳支持物 (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可
(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳， 样品扩散度较自由电泳 小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨
(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测
(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长
由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析 检测血浆蛋白、脂蛋 白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其 他生物大分子。
第三节 琼脂糖凝胶电泳
天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖 (agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不 带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和 羧基的强酸性 多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产 生较强的电渗现象，加之硫 酸根可与某些蛋白质作 用而影响电泳速度及分离效果。
的泳动度。
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，
净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子
目前多用琼脂糖为电泳支持物 (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可
(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳， 样品扩散度较自由电泳 小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨
(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测
(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长
由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析 检测血浆蛋白、脂蛋 白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其 他生物大分子。
第三节 琼脂糖凝胶电泳
天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖 (agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不 带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和 羧基的强酸性 多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产 生较强的电渗现象，加之硫 酸根可与某些蛋白质作 用而影响电泳速度及分离效果。
的泳动度。
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，
净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子
电泳技术(共21张PPT)
5 显色及分析 机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。
蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B 根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。
机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
第4页，共21页。
2 滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。
3 点样
分1 电离泳胶：：带小电孔粒径点子，在p圆H电8场.点中向（着与量其本少身电）荷相、反的点电极条移动状的过（程。一般），点中间（未知样品）、 点一边（已知样品） 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品）
凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶） 4 操作要点
pH梯度支持介质的制备
聚焦电泳 检测 两性电解质载体的除去
第20页，共21页。
电泳技术思考题
1名词解释
电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电泳、 相对迁移率、不连续凝胶电泳
2 影响泳动度的主要因素有哪些？
3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？
4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？
CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8） →
CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢离子） 蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间 电泳时， Cl －超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较
低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P 压缩成层
Aa：茚三酮、靛红
干法、湿法 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；
1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。
优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。
蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B 根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。
机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
第4页，共21页。
2 滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。
3 点样
分1 电离泳胶：：带小电孔粒径点子，在p圆H电8场.点中向（着与量其本少身电）荷相、反的点电极条移动状的过（程。一般），点中间（未知样品）、 点一边（已知样品） 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品）
凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶） 4 操作要点
pH梯度支持介质的制备
聚焦电泳 检测 两性电解质载体的除去
第20页，共21页。
电泳技术思考题
1名词解释
电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电泳、 相对迁移率、不连续凝胶电泳
2 影响泳动度的主要因素有哪些？
3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？
4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？
CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8） →
CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢离子） 蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间 电泳时， Cl －超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较
低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P 压缩成层
Aa：茚三酮、靛红
干法、湿法 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；
1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。
电泳分离技术
不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度
泳动度
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量、颗粒大 小和形状有关。
被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为： F=EQ
➢ 式中 E：电场强度，即每厘米支持物的电位 降；Q为被分离物所带净电荷。
（二）、影响电泳速度的因素
• 样品本身：带电量，分子大小，形状 • 电场强度：电压 • 缓冲液：成分， pH ，离子强度 • 支持介质：电渗作用，吸附作用 • 温度
影响泳动度的因素
1．电场强度 是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势
梯度)。电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。根据电场 强度的不同，电泳可分为两种。 ➢ (1)常压(100～500 V)电泳 其电场强度为2～10 V／cm。 分离时间较长，从数小时到数十小时，适合于分离蛋白质 等大分子物质。 ➢ (2)高压(2000～10000 V)电泳 其电场强度为50～200V／ cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、 多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
电泳技术概述
▪ 70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术 环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密 切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分析中 必不可少的手段。
二、电泳技术的基本原理
电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其 电性相反的电极移动的现象。
电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术。
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P
NH3+
NH2
P
P
COOH
COO-
第三章毛细管电泳分离技术
电泳迁移速度Ve : Ve= μeE = μeV/L
注：μe:电泳迁移率(电泳淌度); E:电场强度; V－毛细管柱两 端施加的电压；L－毛细管柱的长度。
μe =νe/E= Q/f
第三章毛细管电泳分离技术
ve
Q f VL
QV
6RsL
注： Q－离子所带的净电荷；f－Stokes阻力系数。η是缓冲 溶液的粘度(动力学的)，Rs是离子的有效半径(包括溶剂化层)
毛细管电泳分离柱效方程式
两端电压
N l2
aV pp l eeV o l
2 Dt2 DL 2 D L
理论塔板高
毛细管总长度
溶质扩散系数
实验上可按下式求出理论塔板数
电泳图上从起点至电泳峰 最大值之间的距离
电泳峰的半高峰宽
第三章毛细管电泳分离技术
毛细管电泳分离柱效方程式
N l2
① 消除固液界面间的ζ电位或提高溶液的粘度； ② 在毛细管的内壁涂上聚合物，如聚丙烯酰胺涂
层。 具体方法有：
第三章毛细管电泳分离技术
第三章毛细管电泳分离技术
第三章毛细管电泳分离技术
第三章毛细管电泳分离技术(Fra bibliotek)分离效率和分离度
1、分离效率
电泳湍度
毛细管有效长度
电渗湍度
柱效可用理论塔板数n表示
• 20世纪70年代在HPLC的推动下，电泳分离技术 成为了一种“灰姑娘”式的技术
第三章毛细管电泳分离技术
• 1981年，Jorgenson等介绍了毛细管区带电泳技 术。
• 1984年Terabe等提出的胶束电动毛细管色谱。 • 1987年，Hjerten建立了毛细管等电聚焦。 • 1987年，由Chohen等提出了毛细管凝胶电泳。 • 1991年，Monnig等首次提出了高速毛细管电泳。 • 目前，毛细管电泳已广泛应用于氨基酸、肽、蛋
注：μe:电泳迁移率(电泳淌度); E:电场强度; V－毛细管柱两 端施加的电压；L－毛细管柱的长度。
μe =νe/E= Q/f
第三章毛细管电泳分离技术
ve
Q f VL
QV
6RsL
注： Q－离子所带的净电荷；f－Stokes阻力系数。η是缓冲 溶液的粘度(动力学的)，Rs是离子的有效半径(包括溶剂化层)
毛细管电泳分离柱效方程式
两端电压
N l2
aV pp l eeV o l
2 Dt2 DL 2 D L
理论塔板高
毛细管总长度
溶质扩散系数
实验上可按下式求出理论塔板数
电泳图上从起点至电泳峰 最大值之间的距离
电泳峰的半高峰宽
第三章毛细管电泳分离技术
毛细管电泳分离柱效方程式
N l2
① 消除固液界面间的ζ电位或提高溶液的粘度； ② 在毛细管的内壁涂上聚合物，如聚丙烯酰胺涂
层。 具体方法有：
第三章毛细管电泳分离技术
第三章毛细管电泳分离技术
第三章毛细管电泳分离技术
第三章毛细管电泳分离技术(Fra bibliotek)分离效率和分离度
1、分离效率
电泳湍度
毛细管有效长度
电渗湍度
柱效可用理论塔板数n表示
• 20世纪70年代在HPLC的推动下，电泳分离技术 成为了一种“灰姑娘”式的技术
第三章毛细管电泳分离技术
• 1981年，Jorgenson等介绍了毛细管区带电泳技 术。
• 1984年Terabe等提出的胶束电动毛细管色谱。 • 1987年，Hjerten建立了毛细管等电聚焦。 • 1987年，由Chohen等提出了毛细管凝胶电泳。 • 1991年，Monnig等首次提出了高速毛细管电泳。 • 目前，毛细管电泳已广泛应用于氨基酸、肽、蛋
电泳分离技术
谢谢
THANKS
样本分析。
电场不均匀性
电泳过程中电场的不均匀性可 能导致分离效果不佳。
高成本
电泳分离技术所需的设备和试 剂成本较高，增加了实验成本
。
操作复杂度
电泳分离技术的操作相对复杂 ，需要专业人员进行操作和维
护。
05 电泳分离技术的发展趋势和未来展望
CHAPTER
技术创新和改进
高效电泳分离技术的研发
通过改进电泳分离技术的原理和工艺，提高分离效率和准确性，降低能耗和成本。
21世纪
随着生物技术的快速发展，电泳分离技术在基因组学、蛋白质组学等 领域的应用越来越广泛，成为生命科学研究的重要手段之一。
02 电泳分离技术的基本原理
CHAPTER
电泳现象
定义
电泳现象是指带电粒子在电场中受到电场力的作用而发生迁移的 现象。
原理
带电粒子在电场中受到电场力的作用，产生定向移动，使得粒子在 电场中分布不均，从而实现分离。
细胞分离
利用电泳分离技术可以分离不同种类的细胞，如淋巴细胞 分型、干细胞分离等，为细胞治疗和药物筛选提供支持。
在化学和环境科学领域的应用
有机物分离
电泳分离技术可用于有机物的分 离和纯化，如氨基酸、肽类、糖 类等，在化学合成和药物制备中 具有重要应用。
环境监测
电泳分离技术可用于环境样品中 污染物的分离和检测，如重金属 离子、有机污染物等，为环境监 测和治理提供技术支持。
电泳分离技术
目录
CONTENTS
• 引言 • 电泳分离技术的基本原理 • 电泳分离技术的应用 • 电泳分离技术的优缺点 • 电泳分离技术的发展趋势和未来展望 • 结论
01 引言
电泳技术PPT精品课程课件讲义
PPT内容可自行编辑
电泳技术
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
PPT内容可自行编辑
开始上课！
一、基本原理
电泳：在溶液中，带电粒子在外加电场的作用
下向相反电极移动的现象叫做电泳。
电泳分离方法主要就是根据大分子的分子量及
电性差异将大分子在电场中彼此分来的。简单
电流强度应该是每块胶板30mA左右。
2018/11/30
（二）琼脂糖凝胶电泳
1、概述 聚丙烯酰胺凝胶电泳对于分离生物大分子具 有较高的分辨率，但由于核酸分子比蛋白质分子大 得多，只能采用有较大孔径的琼脂糖凝胶来分离核
酸。由于核酸分子本身中含有大量的磷酸根，所以
核酸带有负电荷，在电场中会向正极移动。
中的甘油使样品溶液的密度变 大，避免加样后样品上漂； 2-巯基乙醇使蛋白质中的二硫键断裂，并不再形成新的二 硫键，溴酚蓝是指示剂，显示电泳前沿线的位置。将制胶 板中的密封教条除去，装入电泳槽，在正负极水槽中加入
电极缓冲液，将预处理后的蛋白质样品加入对应的梳空，
装好电泳槽，接好电源，开始电泳。施加在每块胶板上的
在浓缩胶中受到浓缩效应、电荷效应和分子筛效应
的影响，可被浓缩成一条极为狭窄的条带，因此当 蛋白质样品进入分离胶时就形成了彼此分离的清晰 条带，大大提高了分辨率。
2018/11/30
2、试剂 丙稀酰胺溶液中含有甲叉双丙稀酰胺 过硫酸铵（聚合的引发剂） 四甲基乙二胺是加速剂，可加快聚合的速度
2018/11/30
2018/11/30
1）打开电源 插上电泳仪电源，打开右侧面后部开关。主面板指示灯亮。 2）参数设置 电泳仪技术参数如下，在电泳仪使用时不要超过额定值。 最大电压：300 V 最大电流：400 mA 最大功率：75 W 最大时间：999 min 按下电泳仪主面板上“V/A Constant”按纽，进行恒压或恒流模式选择， “V”和 “A”上的指示灯来回切换，同时数显面板左方的“V”“mA”灯也 跟着切换。 恒压模式时，切换到“V”灯亮后，通过“+”和“－”进行调节电压数值 到 需要值。 恒流模式时与上一致。切换到“A”灯亮，设置所需电流值。 按下数显面板左方的“V/mA/时钟”按纽到时钟旁灯亮，可通过“+”“－” 调节设置时间值。 3）接上电泳槽电源线。意红色线插红色接口，黑色线插黑色接口。 4）按下“run/pause”按纽，“run”上的灯亮时开始电泳。 5）电泳过程中按下“V/mA/时钟”按纽可以当前运行电流电压和时间参数。 6）电泳过程中，可以按下“ run/pause”按纽暂停电泳和继续电泳。 2018/11/30 7）电泳完成后，按下“stop”按纽停止电泳。
电泳技术
主讲：XX XX
凡大医治病，必当安神
定志，无欲无求，先发大慈恻 隐之心，誓愿普救含灵之苦。
- - 孙思邈
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开始上课！
一、基本原理
电泳：在溶液中，带电粒子在外加电场的作用
下向相反电极移动的现象叫做电泳。
电泳分离方法主要就是根据大分子的分子量及
电性差异将大分子在电场中彼此分来的。简单
电流强度应该是每块胶板30mA左右。
2018/11/30
（二）琼脂糖凝胶电泳
1、概述 聚丙烯酰胺凝胶电泳对于分离生物大分子具 有较高的分辨率，但由于核酸分子比蛋白质分子大 得多，只能采用有较大孔径的琼脂糖凝胶来分离核
酸。由于核酸分子本身中含有大量的磷酸根，所以
核酸带有负电荷，在电场中会向正极移动。
中的甘油使样品溶液的密度变 大，避免加样后样品上漂； 2-巯基乙醇使蛋白质中的二硫键断裂，并不再形成新的二 硫键，溴酚蓝是指示剂，显示电泳前沿线的位置。将制胶 板中的密封教条除去，装入电泳槽，在正负极水槽中加入
电极缓冲液，将预处理后的蛋白质样品加入对应的梳空，
装好电泳槽，接好电源，开始电泳。施加在每块胶板上的
在浓缩胶中受到浓缩效应、电荷效应和分子筛效应
的影响，可被浓缩成一条极为狭窄的条带，因此当 蛋白质样品进入分离胶时就形成了彼此分离的清晰 条带，大大提高了分辨率。
2018/11/30
2、试剂 丙稀酰胺溶液中含有甲叉双丙稀酰胺 过硫酸铵（聚合的引发剂） 四甲基乙二胺是加速剂，可加快聚合的速度
2018/11/30
2018/11/30
1）打开电源 插上电泳仪电源，打开右侧面后部开关。主面板指示灯亮。 2）参数设置 电泳仪技术参数如下，在电泳仪使用时不要超过额定值。 最大电压：300 V 最大电流：400 mA 最大功率：75 W 最大时间：999 min 按下电泳仪主面板上“V/A Constant”按纽，进行恒压或恒流模式选择， “V”和 “A”上的指示灯来回切换，同时数显面板左方的“V”“mA”灯也 跟着切换。 恒压模式时，切换到“V”灯亮后，通过“+”和“－”进行调节电压数值 到 需要值。 恒流模式时与上一致。切换到“A”灯亮，设置所需电流值。 按下数显面板左方的“V/mA/时钟”按纽到时钟旁灯亮，可通过“+”“－” 调节设置时间值。 3）接上电泳槽电源线。意红色线插红色接口，黑色线插黑色接口。 4）按下“run/pause”按纽，“run”上的灯亮时开始电泳。 5）电泳过程中按下“V/mA/时钟”按纽可以当前运行电流电压和时间参数。 6）电泳过程中，可以按下“ run/pause”按纽暂停电泳和继续电泳。 2018/11/30 7）电泳完成后，按下“stop”按纽停止电泳。
电泳分离PPT课件
胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相， 比纸电泳分辨率高。
❖以上两种类型的电泳，由于介质的孔径 度大，没有分子筛效应，主要靠被分离 物的电荷多少进行分离。
4
第54页/共48页
③琼脂糖凝胶电泳：从琼脂中精制分离出的胶状多
糖，一般用于核酸的分离分析。
（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应； （2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用； （3）无毒； （4）染色、脱色程序简单，背景色较低； （5）热可逆性； （6）生物中性：一般不与生物材料结合。
四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )
利用蛋白质具有不同等电点的特性，以 聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体 两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有 各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。
32
第332页/共48页
2）光催化系统：核黄素－光
催化剂: 核黄素（维生素B2）
引发剂: 光
.
TEMED的存在，可加速聚合。
15
第165页/共48页
聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成
16
第176页/共48页
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着 度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein) 在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只 与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。
24
第254页/共48页
两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对
数呈线性关系，符合下式：logMW=C-bm MW：分子量；m：迁移率；C、b均为常数
❖以上两种类型的电泳，由于介质的孔径 度大，没有分子筛效应，主要靠被分离 物的电荷多少进行分离。
4
第54页/共48页
③琼脂糖凝胶电泳：从琼脂中精制分离出的胶状多
糖，一般用于核酸的分离分析。
（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应； （2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用； （3）无毒； （4）染色、脱色程序简单，背景色较低； （5）热可逆性； （6）生物中性：一般不与生物材料结合。
四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )
利用蛋白质具有不同等电点的特性，以 聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体 两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有 各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。
32
第332页/共48页
2）光催化系统：核黄素－光
催化剂: 核黄素（维生素B2）
引发剂: 光
.
TEMED的存在，可加速聚合。
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第165页/共48页
聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成
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第176页/共48页
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着 度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein) 在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只 与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。
24
第254页/共48页
两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对
数呈线性关系，符合下式：logMW=C-bm MW：分子量；m：迁移率；C、b均为常数
第八章 电泳分离技术培训课件
12
区带电泳 ：是在半固相或胶状介质上加 上一个点或一薄层样品溶液，然后加电场， 分子在支持介质上或支持介质中迁移。
是应用最广泛的电泳技术之一。
13
14
15
按电场分：常压（<500V，适用大分 子）、高压（>500V，适用小分子） 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式
16
二、电泳技术原理
④ 适当的凝胶孔径和添加增加介质黏度的物质 （蔗糖或甘油） 会影响介质的有效黏滞度。
22
问题：电泳过程中产热？
后果： a)蛋白质变性，分离失去意义； b)温度升高引起对流，蛋白质区带扩散，降
低分辨率。 解决问题： W（热量）=IE I是电流；E是电压 按Ohm定律还有如下关系：W=I2/K K是 电导率
10
电泳分离：是利用带电粒子在电场中泳
动速度的差别进行分离的方法。 I. 实验室中强有力的分析、鉴定和分离技
术——更大规模的制备应用。 II. 与HPLC相比在可靠性、分辨率、使用
的难易度和成本上具优势。 III. 在生物技术研究和产物分离纯化应用的
是区带电泳。
11
电泳分类
按分离的原理区分： 区带电泳 移界电泳 等速电泳 等电聚焦
8
在医院临床检验中，利用电泳技术分析血 清中的酶及同工酶，可以诊断肾病综合症、 心绞痛、肝硬化、肝癌、多发生骨髓瘤、 恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病； 分析血色素组份，可以判定血细胞的正常 与异常
9
一九八四年九月，美国在航天飞机上首先使用 电泳技术提炼了一种治疗糖尿病的新药----胰岛 素β细胞，为全世界上百万糖尿病患者带来了福 音。电泳技术在太空的应用，更使它一时身价 百倍，由于太空无重力作用，电泳液中不存在 冷热对流现象，从而不影响分离效果。被分离 的物质纯度高，成本低，如治疗血栓病的尿激 酶，在太空生产，产量可以提高四百倍，售价 可降低百分之九十，美国每年患血栓病的人有 一百多万，只此一项即可节约几亿美元。
区带电泳 ：是在半固相或胶状介质上加 上一个点或一薄层样品溶液，然后加电场， 分子在支持介质上或支持介质中迁移。
是应用最广泛的电泳技术之一。
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按电场分：常压（<500V，适用大分 子）、高压（>500V，适用小分子） 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式
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二、电泳技术原理
④ 适当的凝胶孔径和添加增加介质黏度的物质 （蔗糖或甘油） 会影响介质的有效黏滞度。
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问题：电泳过程中产热？
后果： a)蛋白质变性，分离失去意义； b)温度升高引起对流，蛋白质区带扩散，降
低分辨率。 解决问题： W（热量）=IE I是电流；E是电压 按Ohm定律还有如下关系：W=I2/K K是 电导率
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电泳分离：是利用带电粒子在电场中泳
动速度的差别进行分离的方法。 I. 实验室中强有力的分析、鉴定和分离技
术——更大规模的制备应用。 II. 与HPLC相比在可靠性、分辨率、使用
的难易度和成本上具优势。 III. 在生物技术研究和产物分离纯化应用的
是区带电泳。
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电泳分类
按分离的原理区分： 区带电泳 移界电泳 等速电泳 等电聚焦
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在医院临床检验中，利用电泳技术分析血 清中的酶及同工酶，可以诊断肾病综合症、 心绞痛、肝硬化、肝癌、多发生骨髓瘤、 恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病； 分析血色素组份，可以判定血细胞的正常 与异常
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一九八四年九月，美国在航天飞机上首先使用 电泳技术提炼了一种治疗糖尿病的新药----胰岛 素β细胞，为全世界上百万糖尿病患者带来了福 音。电泳技术在太空的应用，更使它一时身价 百倍，由于太空无重力作用，电泳液中不存在 冷热对流现象，从而不影响分离效果。被分离 的物质纯度高，成本低，如治疗血栓病的尿激 酶，在太空生产，产量可以提高四百倍，售价 可降低百分之九十，美国每年患血栓病的人有 一百多万，只此一项即可节约几亿美元。
《电泳分离》PPT课件
Polyacrylamide gel electrophoresis （PAGE ）
❖ 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法。由于其 分辨率高，不仅能分离含有各种大分子的混合物， 而且可以研究生物大分子的特性，如电荷、分子量、 等电点及分子构型。
❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点： ①孔径大小可调节，可用于分离多种生物分子。 ②机械强度好、弹性大，电渗低、分辨率高。 ③电泳分离后仍然保持生物活性，可用于生物大分 子的制备。
一、基本原理
（一）基本原理
当带电粒子
以速度ν 在电场
中移动时，受到 大小相等、方向 相反的电场推动 力和平动摩擦阻 力的作用。
电场强度 电泳阻滞力
物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。
（二）影响电泳速度的相关因素
1. 颗粒性质：带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗 粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径成反比。
2. 电场强度：E 愈高，带电颗粒的泳动速度愈快。 3. 溶液性质：pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈
大，净电荷愈多，泳动速度越快； 离子强度在0.02－0.2为宜; 泳动速度与溶液黏度成反比。
4.电渗 是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性 质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈 高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗方向 一致时，加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方 向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。
蛋白质分子的构型起主要作用
三.不连续凝胶电泳的分离原理
（一）原理
系统的不连续性表现在以下几个方面：
❖凝胶系统的不连续性：上层为大孔径的浓缩 胶，下层为小孔径的分离胶。
❖缓冲液离子组成及pH的不连续性：电极缓冲 液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为 pH6.8的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的 Tris-HCl缓冲液。
❖ 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法。由于其 分辨率高，不仅能分离含有各种大分子的混合物， 而且可以研究生物大分子的特性，如电荷、分子量、 等电点及分子构型。
❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点： ①孔径大小可调节，可用于分离多种生物分子。 ②机械强度好、弹性大，电渗低、分辨率高。 ③电泳分离后仍然保持生物活性，可用于生物大分 子的制备。
一、基本原理
（一）基本原理
当带电粒子
以速度ν 在电场
中移动时，受到 大小相等、方向 相反的电场推动 力和平动摩擦阻 力的作用。
电场强度 电泳阻滞力
物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。
（二）影响电泳速度的相关因素
1. 颗粒性质：带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗 粒的净电荷量成正比，与颗粒的半径成反比。
2. 电场强度：E 愈高，带电颗粒的泳动速度愈快。 3. 溶液性质：pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈
大，净电荷愈多，泳动速度越快； 离子强度在0.02－0.2为宜; 泳动速度与溶液黏度成反比。
4.电渗 是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性 质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈 高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗方向 一致时，加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方 向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。
蛋白质分子的构型起主要作用
三.不连续凝胶电泳的分离原理
（一）原理
系统的不连续性表现在以下几个方面：
❖凝胶系统的不连续性：上层为大孔径的浓缩 胶，下层为小孔径的分离胶。
❖缓冲液离子组成及pH的不连续性：电极缓冲 液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为 pH6.8的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的 Tris-HCl缓冲液。
电泳分离技术
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二、电泳技术原理
生物技术研究对象：主要是核酸和蛋白质
蛋白分子带电荷的基团：正电荷（氨基、亚氨
基、酰氨基）、负电荷（羧基、苯酚基、巯
基）；
基团所带电荷的性质和数量随溶液环境（如
pH和离子强度）变化。
蛋白分子在电场内迁移所受到的力（F）与
电场强度（E）及蛋白分子的净电荷成正比
关系。
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区带电泳 ：是在半固相或胶状介质上 加上一个点或一薄层样品溶液，然后加电 场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
是应用最广泛的电泳技术之一。
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按电场分：常压（<500V，适用大分 子）、高压（>500V，适用小分子） 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式
③ 表面活性剂的存在会影响蛋白分子间的相互 作用，同时消除了不同蛋白质分子的固有电 荷差异。
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从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum 用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后， 开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、 醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等） 作为支持介质的区带电泳方法。
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1959年Raymond和Weintraub利用人工合 成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰 胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分 辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年 来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和 分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生 物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析 鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度： 即"电泳纯"（一维电泳一条带或二维电泳 一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被 人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的 最后、最准确的手段，即"Last Check"
第十四章 电泳分离技术
■ 联丙烯酰胺单体聚合过程：
聚 合 反 应
交联剂造成分枝
聚合反应
Bis 交錯连結 Bis
free radical
端点自由基 可再延续
自由基形成
一些概念
▪ 凝胶浓度和交联度 ▪ 不连续与连续胶 ▪ 变性胶及非变性胶
SDS (Sodium dodecyl sulfate)
十二烷基磺酸钠
凝胶的浓度和交联度
▪ 琼脂凝胶电泳：常用pH6-9;离子强度 0.02-0.05;硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液； 浓度常用1%-1.5%
▪ 琼脂凝胶电泳的优点：？？ 1. 近似自由界面 2. 液固相间无明显界面，电泳速度快 3. 不吸收紫外线，可直接用紫外检测仪测定 4. 容易染色易洗脱
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进 行，不加变性剂
■ SDS 在蛋白质表面 均勻敷上 一层负电：
SDS
boiling
原态蛋白质
变性蛋白质成一线狀分子 並且均勻帶上一层负电荷
极性头部
非极性尾部
■ 三种不同性质蛋白质的电泳比较：
Quaternary Molecular Protein Structure Weight
pI
Mobility
Native SDSPAGE PAGE
X Tetramer (40,000)x4 5.8 Slow Fast Y Monomer 88,000 5.2 Fast Slow Z Monomer 60,000 9.3 Upward Medium
X - Y - Z+
Native-PAGE
▪ 凝胶浓度：T（Acr和Bis总浓度） =(a+b)/m.100%
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琼脂糖凝胶电泳
（一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、
病毒 等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性
(引发剂)
N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 TEMED (加速剂)
被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸， 正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚 链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。
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特别注意
丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺对中枢神经系统有损伤作用. 丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺要避光保存. 混合的溶液保存不宜粒性质：直径、形状、静电荷。 电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压： 2-10V/cm 溶液性质：电极溶液和蛋白质样品溶液pH、离子强度、溶 液黏度。 电渗：液体对固体支持物的相对移动。颗粒运动的方向与电 渗方向一致时，加快颗粒的迁移率。反之亦然。 支持介质的筛孔
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凝胶电泳
主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶
琼脂糖——筛分作用小，适于大分子物质 聚丙烯酰胺——分离效果好，分辨率高，适于小分子物质
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聚丙烯酰胺
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利用人工合成的凝胶作 为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰 胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形 成的三维空间凝胶网络。
凝胶电泳和等电聚焦电泳由于其明显的优越性，得到了越 来越广泛的应用。
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电泳分析的特点
各种电泳技术具有如下特点：
凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可以进 行定性或定量分析； 样品量极少； 设备简单，可在常温下进行； 操作简单省时； 分辨率高。已被广泛应用于基础理论研究，临床诊断及工 业制造等方面。
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迁移率(mobility) ： 带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度.
V: 泳动速度cm/秒or分 d: 泳动距离cm t: 电泳时间 (秒/分) E: 电场强度 伏特/cm
u: 泳动率or泳动度(cm/伏·秒or分) U: 电压 常压(100—500v)
高压(500—10000v)仅需几分钟 l: 支持场的长度 (有效长度)
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聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点
设备简单 样品量小（1-100微克） 时间短（30-60分钟） 操作方便 分离范围广（多肽，蛋白，多糖等） 可提高灵敏度改为超微量测定（10-12~10-9） 可用于蛋白质分子量测定
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凝胶特性
机械性能、弹性、孔径大小等。 T——单体的总百分浓度 C——交联百分浓度
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电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断 改进，以实现下列目标：
1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
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电泳的分类
1.电泳按其分离原理不同，分为区带电泳、移动界面电泳、 等速电泳、等电聚焦电泳等。
①区带电泳
②自由界面电泳 ③等速电泳：
a——丙烯酰胺的克数 b——亚甲基双丙烯酰胺克数 m——体积
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聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于总浓度，随浓度的增加 而降低。
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有效孔径决定蛋白质的分离
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聚合方式
光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。
化学聚合：制小孔胶。
过硫酸铵 APS
需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随 ，分成清晰的界面，并以等速向前运动。 ④等电聚焦电泳： 由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物 大分子移动到各自等电点的pH出聚集成很窄的区带。
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2.电泳按支持介质的不同，分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、 琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS——聚丙烯酰胺 凝胶电泳等。
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第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖；
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由于早期的电泳仪价格昂贵，分辨率低，易产生对流，因 而逐渐发展起了区带电泳。
自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质 的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力， 不便于推广应用。
区带电泳是指在电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固相 介质作为支持介质，减少外界干扰的电泳技术。
PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。
PAGE是目前最常用的电泳方法。
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原理
以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电 泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、PH、 电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积 聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为0.1毫米），然后再进行 分离，从而提高了分辨率。
3.电泳按支持介质形状的不同，分为薄层电泳、板电泳、柱电 泳等。
4.按用途不同可分为分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳、连 续制备电泳等。
5.按所用电压不同可分为：
①低压电泳：100v~500v，电泳时间较长，适于分离蛋白质等 生物大分子。
②高压电泳：1000v~5000v，电泳时间短，有时只需几分钟， 多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离
1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳 。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢 酶的电泳移动和等电点。
1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液 之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清 提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白。
第十一章 电泳分离技术
广泛应用于各个科学领域的新型 分离技术
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概述
在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用 下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现 象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同， 迁移速率不同，可实现分离。
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1809年俄国物理学家Peiice首次发现电泳现象，他在湿粘 土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻 璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极 移动，这就是电泳现象。