《电泳分离技术》PPT课件

第十一章 电泳分离技术
广泛应用于各个科学领域的新型 分离技术
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概述
在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用 下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现 象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同， 迁移速率不同，可实现分离。
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1809年俄国物理学家Peiice首次发现电泳现象，他在湿粘 土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻 璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极 移动，这就是电泳现象。
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聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点
设备简单 样品量小（1-100微克） 时间短（30-60分钟） 操作方便 分离范围广（多肽，蛋白，多糖等） 可提高灵敏度改为超微量测定（10-12~10-9） 可用于蛋白质分子量测定
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凝胶特性
机械性能、弹性、孔径大小等。 T——单体的总百分浓度 C——交联百分浓度
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电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断 改进，以实现下列目标：
1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。
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电泳的分类
1.电泳按其分离原理不同，分为区带电泳、移动界面电泳、 等速电泳、等电聚焦电泳等。
①区带电泳
②自由界面电泳 ③等速电泳：
(引发剂)
N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 TEMED (加速剂)
被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸， 正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚 链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。
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特别注意
丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺对中枢神经系统有损伤作用. 丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺要避光保存. 混合的溶液保存不宜超过一个月.
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影响电泳速度的因素
颗粒性质：直径、形状、静电荷。 电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压： 2-10V/cm 溶液性质：电极溶液和蛋白质样品溶液pH、离子强度、溶 液黏度。 电渗：液体对固体支持物的相对移动。颗粒运动的方向与电 渗方向一致时，加快颗粒的迁移率。反之亦然。 支持介质的筛孔
凝胶电泳和等电聚焦电泳由于其明显的优越性，得到了越 来越广泛的应用。
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电泳分析的特点
各种电泳技术具有如下特点：
凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可以进 行定性或定量分析； 样品量极少； 设备简单，可在常温下进行； 操作简单省时； 分辨率高。已被广泛应用于基础理论研究，临床诊断及工 业制造等方面。
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11ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
凝胶电泳
主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶
琼脂糖——筛分作用小，适于大分子物质 聚丙烯酰胺——分离效果好，分辨率高，适于小分子物质
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聚丙烯酰胺
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利用人工合成的凝胶作 为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰 胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形 成的三维空间凝胶网络。
3.电泳按支持介质形状的不同，分为薄层电泳、板电泳、柱电 泳等。
4.按用途不同可分为分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳、连 续制备电泳等。
5.按所用电压不同可分为：
①低压电泳：100v~500v，电泳时间较长，适于分离蛋白质等 生物大分子。
②高压电泳：1000v~5000v，电泳时间短，有时只需几分钟， 多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离
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琼脂糖凝胶电泳
（一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、
病毒 等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性
需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随 ，分成清晰的界面，并以等速向前运动。 ④等电聚焦电泳： 由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物 大分子移动到各自等电点的pH出聚集成很窄的区带。
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2.电泳按支持介质的不同，分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、 琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS——聚丙烯酰胺 凝胶电泳等。
a——丙烯酰胺的克数 b——亚甲基双丙烯酰胺克数 m——体积
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聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于总浓度，随浓度的增加 而降低。
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有效孔径决定蛋白质的分离
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聚合方式
光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。
化学聚合：制小孔胶。
过硫酸铵 APS
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第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖；
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由于早期的电泳仪价格昂贵，分辨率低，易产生对流，因 而逐渐发展起了区带电泳。
自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质 的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力， 不便于推广应用。
区带电泳是指在电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固相 介质作为支持介质，减少外界干扰的电泳技术。
PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。
PAGE是目前最常用的电泳方法。
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原理
以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶为支持物，采用电 泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、PH、 电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积 聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为0.1毫米），然后再进行 分离，从而提高了分辨率。
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迁移率(mobility) ： 带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度.
V: 泳动速度cm/秒or分 d: 泳动距离cm t: 电泳时间 (秒/分) E: 电场强度 伏特/cm
u: 泳动率or泳动度(cm/伏·秒or分) U: 电压 常压(100—500v)
高压(500—10000v)仅需几分钟 l: 支持场的长度 (有效长度)
1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳 。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢 酶的电泳移动和等电点。
1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液 之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清 提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白。