离子交换层析柱的装填及处理
蛋白纯化层析柱填装
蛋白纯化层析柱填装
首先，选择合适的层析柱是非常重要的。
根据需要分离的蛋白
的大小、电荷、亲和性等特性，选择不同类型的填料，比如离子交
换柱、凝胶过滤柱或亲和层析柱等。
填料的粒径和柱子的尺寸也需
要根据样品的特性和分离要求来选择。
其次，准备填充柱子的缓冲液和样品。
缓冲液的选择取决于蛋
白的稳定性和溶解性，确保填充柱子前样品已经被适当地溶解和净化。
在填充柱子之前，需要先平衡填充柱子，通常使用与样品相同
的缓冲液。
填充柱子时，需要小心操作，确保填充均匀，避免气泡的产生。
填充柱子的速度应该适中，以免填料受到损坏或形成不均匀的层析床。
填充结束后，需要进行压缩，以确保填充物的密实度和柱子的
稳定性。
最后，进行层析实验前，需要对填充好的柱子进行质量控制，
比如检查柱子的均匀性和密实度，以及检测柱子的渗透性和分辨力。
只有填充好的柱子通过了质量控制，才能进行后续的层析实验。
总的来说，蛋白纯化层析柱填装是一个复杂而关键的步骤，需要仔细选择填料和柱子，合理准备样品和缓冲液，并严格控制填充和质量，以确保最终获得高质量的纯化蛋白。
层析柱原理和使用方法
层析柱原理和使用方法
层析柱原理是一种常用的色谱技术，可以分离复杂混合物中的各个组分。
层析柱是一个长管状结构，内部填充有吸附剂或离子交换树脂等材料。
根据组分在填料中的亲和性差异，不同组分会以不同的速度通过填料，从而实现分离。
层析柱的使用方法如下：
1. 样品预处理：将混合物中的目标组分溶解或悬浮于合适的溶剂中，并进行必要的样品处理（如pH调整、过滤等）。
2. 建立实验条件：选择合适的填料材料、填料粒径和填充方法，并确定适当的溶剂体系和流动相条件。
3. 装填填料：将选择好的填料装入柱中。
填料的打包密度和均匀性对色谱分离效果有重要影响，因此要确保填料的均匀性和紧密度。
4. 平衡柱：用流动相预浸柱，使填料均匀吸附流动相，并达到平衡状态。
平衡时间根据填料种类和样品性质而定。
5. 注射样品：将样品以适当的体积注射到柱中，并控制注射速度和压力。
6. 运行分析：启动流动相，控制流动相速度和温度，使样品组分逐渐分离，并记录结果。
7. 数据分析：根据检测器的信号，对分离出的目标组分进行定性和定量分析。
层析柱的使用注意事项：
1. 填料选择：根据被分离组分的性质选择合适的填料。
2. 流动相选择：要确保流动相对目标组分具有足够的分离能力。
3. 注射量控制：注射量应根据柱容量和检测器灵敏度进行合理
控制。
4. 柱温控制：柱温对于某些温度敏感性样品的分离效果有重要影响，可以根据需要进行柱温控制。
5. 柱保养：正确使用和保养层析柱，避免杂质吸附和填料破碎等情况的发生。
6. 数据分析：及时记录和分析实验结果，确保实验数据的准确性和可靠性。
CM52阳离子交换树脂层析过程中关键点及注意事项
CM52阳离子交换柱层析过程中的关键点及注意事项
1、关键点
①、柱活化及平衡
活化：0.1mol/L NaOH含1mol/LNaCl洗脱至流出液pH大于11，然后用纯化水洗脱至流出液pH小于8；平衡：洗脱buffer平衡至流出液pH和电导与洗脱buffer相同，然后上样buffer平衡至流出液pH和电导与上样buffer相同。
②、上样
a、要求样品总蛋白浓度为5mg/ml,样品电导小于2mS/cm，样品pH值
与上样Buffer pH相同。
b、洗脱Buffer的配制，可以适当提高洗脱Buffer的浓度，确保平衡
Buffer的pH与洗脱Buffer相同。
c、样品上样量应该与树脂载量相匹配。
③、洗脱
在洗脱过程中应该分步收集，分别测定洗脱各部分的活性以及电泳，合并相关的部分。
④、柱的清洗与再生
洗脱完毕后，用2mol/LNaCl洗脱柱上残留蛋白质，监测OD值的变化（如果还有少量的残留蛋白，而且高浓度的盐不能完全洗掉，用10%乙腈洗脱），用水洗脱至相应的pH与电导，然后重复活化的操作步骤，最后用20%乙醇保存。
2、难控制点
样品上样浓度不恒定，pH值和电导也容易变化。
在洗脱过程中，目标蛋白由于没有明显的吸收峰，对样品的收集只能采取分段收集。
3、易变因素和对上游样品的要求
上样样品的蛋白浓度、pH和电导容易变化。
上游样品必须进行相应的浓缩，调整相应的pH和电导值，过滤。
蛋白纯化过柱具体步骤
蛋白纯化过柱具体步骤
《蛋白纯化过柱具体步骤》
蛋白纯化是生物化学研究中常见的实验技术，通过离子交换柱、亲和层析柱等手段，可以从复杂的混合物中分离纯化目标蛋白。
下面将介绍蛋白纯化过程中的具体步骤。
1. 条件优化
在开始纯化前，重要的第一步是优化实验条件。
这包括确定最佳的缓冲液、pH值、离子浓度和温度等。
这些条件将直接影响到纯化效果和目标蛋白的稳定性。
2. 准备离子交换柱
将离子交换树脂填充到柱中，并将其与离子交换缓冲液预先平衡。
离子交换柱具有吸附和解吸离子的能力，可以根据目标蛋白的特异性选择合适的树脂。
3. 样品负载
将混合物样品加入到经过预平衡的离子交换柱中。
样品中的蛋白将与柱中的树脂发生特定的吸附作用。
4. 柱洗脱
通过逐渐提高离子浓度或使用梯度洗脱缓冲液，将非特异性吸附的杂质从离子交换柱中洗脱。
目标蛋白则因为与柱上树脂的相互作用更强而保留在柱上。
5. 目标蛋白洗脱
选择合适的洗脱缓冲液，通过改变pH值、离子浓度或加入竞争性吸附剂等方法，将目标蛋白从离子交换柱上洗脱下来。
洗脱后的蛋白溶液即为纯化后的目标蛋白。
6. 纯化后处理
对纯化后的目标蛋白进行鉴定和定量分析。
可以使用SDS-PAGE或Western blot等技术来确定纯化效果和蛋白的纯度。
以上就是蛋白纯化过柱的具体步骤。
通过这一系列步骤的操作，可以从复杂的混合物中分离纯化目标蛋白，为后续的生物学研究提供纯净的蛋白样品。
东曹株式会社 TOYOPEARL IEC 系列离子交换填料使用说明书
离子交换填料TOYOPEARL IEC系列使用说明书东曹株式会社安全注意事项［注意标签］■远离火源使用易燃溶剂时，请务必小心。
否则可能会导致火灾、爆炸或中毒。
■使用环境必须通风良好如果通风不良，易燃或有毒溶剂可能会导致火灾、爆炸或中毒。
■请勿喷洒溶剂溶剂发生喷洒或泄露可能会导致火灾、触电、中毒、受伤以及腐蚀。
清除漏出的溶剂时，请佩戴合适的护具。
■请佩戴护目镜和防护手套有机溶剂和酸属于有害物质，切勿直接接触皮肤。
■请小心处理包装处理不当可能会导致产品破裂或溶剂飞溅。
■请勿将本产品用于其他目的本产品仅可用于小分子和蛋白质的分离和提纯，请勿用于其他用途。
■请确认化合物的安全性请确认分离和提纯后的化合物和溶剂安全可靠。
■正确废弃请根据当地法律法规正确废弃。
注■请妥善保管本说明书，以便日后参阅。
注意事项：出厂溶剂TOYOPEARL IEC系列离子交换填料出厂时保存于20 %乙醇水溶液中。
注意事项：TOYOPEARL填料TOYOPEARL产品含甲基丙烯酸聚合物易燃性填料。
目录1. 简介 (1)2. 使用步骤 (2)3. 保存 (6)4. 备注 (6)1. 简介TOYOPEARL IEC系列是基于TOYOPEARL HW-65（650系列、蛋白质排阻界限5×106 Da）或TOYOPEARL HW-55（550系列、蛋白质排阻界限7×105 Da）多孔球形聚合物的离子交换填料。
其特点如下：·在不同pH值和盐浓度的缓冲液中，填料体积的变化可忽略。
·可以采用较高流速。
·有效抵御微生物的生长。
·适用于HPLC系统。
TOYOPEARL MegaCapⅡSP-550EC是基于TOYOPEARL HW-55多孔球形聚合物的离子交换填料。
·对于多肽和小分子蛋白质具有较高的载量，如胰岛素等。
·更低的压降。
表1 产品一览表＊注（粒径）S：超精细20～50 μmM：中等40～90 μmC：粗50～150 μmEC：超粗100～300 μm2. 使用步骤2-1 小颗粒去除（1）将500 mL的填料倒入3000 mL的烧杯中（烧杯的体积应为填料体积的6倍）。
离子交换层析柱和填料选择指南
平衡 1M
样品 上样体积
梯度洗脱
不结合的分子在 梯度开始前被洗脱
[NaCl]
10–20 CV
5–10 CV 0
柱体积（CV）
图1.使用梯度洗脱的典型IEX分离。
洗涤 高盐洗涤
5 CV
再平衡
紧密结合 的分子在 高盐洗涤 中被洗脱
5–10 CV
蛋白质由含有可以被测定的弱酸和弱碱基团（即电离 基团）。因此，蛋白质的净表面电荷是高度依赖的p H，并将随着环境pH变化而逐渐改变。每种蛋白质都 有其针对pH的独特静电荷关系，这可以被视为滴定 曲线（图2）。这条曲线反映了蛋白质整体净电荷如 何根据环境的pH变化。可以在不同的pH值下利用IEX 以分离具有截然不同电荷性质的多种蛋白。图2显示 如何选择正确的pH（实现令人满意的分最重要参数 之一）。
清洗程序，方案1
用4 CV达到70%的乙醇或30%的异丙醇洗涤。 用至少2 CV的蒸馏水冲洗，直到紫外基线和洗 脱pH稳定。 立即用3 CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤2相 同）。
清洗程序，方案2
用2 CV含有去垢剂的碱或酸溶液洗涤（例如含有 0.1–0.5%非离子型去垢剂的0.1 M乙酸）。 用5 CV 70%乙醇冲洗以去除残留的去垢剂。 用至少2 CV的蒸馏水冲洗（流速与步骤1相同）， 直到紫外基线和洗脱pH稳定。 用3 CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤1相同）。
用于阳离子交换层析的缓冲液
pH间隔
物质
1.4-2.4 2.6-3.6 2.6-3.6 3.3-4.3 3.3-4.3 3.7-4.7 5.1-6.1 4.3-5.3 5.2-6.2 5.6-6.5 6.7-7.7 7.0-8.0 7.8-8.8
马来酸 甲基马来酸 柠檬酸 乳酸 甲酸 琥珀酸 琥珀酸 乙酸 甲基马来酸 MES 磷酸盐 HEPES BICINE
阳离子交换层析柱
阳离子交换层析柱阳离子交换层析柱（Cation Exchange Chromatography Column）引言：阳离子交换层析柱是一种常用的层析技术，它基于阳离子交换树脂与溶液中的阳离子间的相互作用，实现对样品中阳离子的分离和纯化。
本文将介绍阳离子交换层析柱的原理、应用和操作方法，以及与其他层析技术的对比。
一、原理阳离子交换层析柱的核心是阳离子交换树脂。
阳离子交换树脂具有一定的亲合力，可以与溶液中的阳离子发生静电作用，并实现吸附和分离。
在阳离子交换层析柱中，树脂通常填充在柱子内部，形成一定的层析床。
当样品溶液通过柱子时，阳离子会被树脂吸附，而其他成分则通过柱子流出。
随后，通过改变溶液的性质，如改变pH 值或溶液中的离子浓度，可以实现阳离子的洗脱，从而获得纯净的目标物质。
二、应用阳离子交换层析柱广泛应用于生物化学、制药、环境分析等领域，特别是在蛋白质纯化中具有重要作用。
它可以用于富集和纯化阳离子性蛋白质，如血浆中的白蛋白、抗体等。
此外，阳离子交换层析柱也可以用于分离和纯化其他阳离子物质，如药物、天然产物等。
三、操作方法1. 样品预处理：样品通常需要提前经过一些预处理步骤，如去除杂质、调整pH值等，以确保样品的适应性和稳定性。
2. 层析柱装填：将阳离子交换树脂填充到层析柱中，并保证填充均匀和紧密。
柱子的尺寸和树脂的类型应根据样品的性质和需求进行选择。
3. 平衡层析柱：用与样品相同的缓冲液进行层析柱的平衡，以达到树脂与溶液之间的平衡状态。
4. 样品加载：将样品溶液缓慢地注入层析柱，允许样品与树脂发生相互作用。
5. 洗脱目标物：通过改变洗脱缓冲液的条件，如pH值、离子浓度等，实现对目标物质的洗脱。
6. 柱子再平衡：在每次使用后，进行柱子的再平衡，以确保下次使用时的稳定性和重现性。
四、与其他层析技术的对比与其他层析技术相比，阳离子交换层析柱具有一些独特的优势。
首先，它适用于纯化带有正电荷的物质，如蛋白质和药物。
层析柱填料的分类
层析柱填料的分类层析柱填料是一种常用的分离技术，在多个领域都有广泛的应用。
根据其物理性质和化学性质的不同，层析柱填料可以分为不同的分类。
本文将对层析柱填料的分类进行详细介绍。
一、根据物理性质分类1. 吸附填料：吸附填料是层析柱中最常用的一种填料。
其主要特点是表面具有较强的吸附能力，可以与待分离物质发生物理吸附作用。
常见的吸附填料有硅胶、活性炭、分子筛等。
吸附填料在生物制药、食品加工、环境监测等领域有广泛应用。
2. 离子交换填料：离子交换填料是一种带电的固体颗粒，其表面带有正或负电荷。
离子交换填料可以与待分离物质中的离子发生离子交换作用，实现分离纯化的目的。
常见的离子交换填料有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等。
离子交换填料在水处理、生物制药、化工等领域有广泛应用。
3. 柱色谱填料：柱色谱填料是一种高效分离的填料，其主要特点是具有较大的表面积和较好的分离效果。
常见的柱色谱填料有C18、C8、氨基、硅胶等。
柱色谱填料在药物分析、环境监测、食品检测等领域有广泛应用。
二、根据化学性质分类1. 亲水性填料：亲水性填料是一种具有亲水性表面的填料，其主要特点是对亲水性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的亲水性填料有硅胶、糖凝胶、羟基磷灰石等。
亲水性填料在生物制药、食品加工等领域有广泛应用。
2. 疏水性填料：疏水性填料是一种具有疏水性表面的填料，其主要特点是对疏水性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的疏水性填料有疏水性聚合物、疏水性硅胶等。
疏水性填料在有机合成、食品加工等领域有广泛应用。
3. 离子互化填料：离子互化填料是一种可以与待分离物质发生离子交换作用的填料，其主要特点是对离子性物质具有较好的吸附和分离效果。
常见的离子互化填料有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等。
离子互化填料在环境监测、药物分析等领域有广泛应用。
三、根据粒径分类1. 大孔径填料：大孔径填料是一种具有较大孔径的填料，其主要特点是具有较大的表面积和较好的传质效果。
实验八 离子交换柱层析
本次实验的特殊安排
此次实验6个人一组，全班共分8组，每组依次 接8个试管，一共接64个试管，8个组共同完成一个 实验。
组数 用量 筒接 试管 号 第一组 0 ml 第二组 8ml 第三组 16ml 第四组 24ml 第五组 32ml 第六组 40ml 第七组 48ml 第八组 56ml
1～8
9～16
17～24
25～32
33～40
41～48
49～56
57～64
如表所示： 用量筒接取本组相应数值的洗脱液后，再用试管接 取，每管接1ml,共接8个试管。
3. 氨基酸的洗脱： 准备64支刻度试管——编号——用移液管取1ml 混合氨基酸——加入柱中——然后马上开始用刻度 试管接洗脱液——每支试管接1ml（注意控制层析 柱的速度，慢一点较好）——同时注意层析柱中缓 冲液的液面不要低于滤纸，注意及时补充缓冲液， 保持液面不变 4. 测OD值: 收集60支试管后——每支试管中加入1 ml显色 剂——然后在沸水浴中加热15min——冷却——每 支试管加1.5ml 50％乙醇——搅拌均匀——静置 10min——测OD570nm，以第二管为参比管 5. 以洗脱体积为横坐标，以OD值为纵坐标作图。
实验八
离子交换柱 层析分离氨基酸
一 实验原理
各种氨基酸分子的结构不同， 在同一pH时与离子交换树脂的亲 和力有差异，因此可依亲和力从小 到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达 到分离的效果。
二 实验步骤
1. 树脂的准备： 将干的树脂用水浸泡一天——然后用 2mol/L的HCl浸泡1h——然后再用2mol/L的 NaOH浸泡1h——然后用水洗至中性(已做好) 2. 装柱：——注意柱中不能有气泡 层析柱中先倒入2cm左右的缓冲液——将 洗至中性的树脂用缓冲液冲洗一遍——然后 将树脂倒入到层析柱中——装到离柱口2cm 处——然后剪一小圆形滤纸，垫在树脂上(注 意树脂不要跑到滤纸上面去)
离子交换柱层析操作
离子交换柱层析操作规程（可溶性蛋白）1.装柱：1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；2.柱的平衡与上样：2.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6；2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；3洗杂蛋白：3.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）4解离目的蛋白：4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul 做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）5.柱的清洗与保存：5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液（PH7.6）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.3用过滤去离子水冲洗50ml；5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。
在阳离子交换管柱层析法
歐亞書局
CH 3 胺基酸、胜肽與蛋白質
p.90
圖 3-17(a)
圖3-17 蛋白質純化常用 的三種管柱層析方法。(a) 離子交換層析法是利用蛋 白質在特定 pH 值時之靜 電荷差異進行分離。
歐亞書局
歐亞書局
CH 3 胺基酸、胜肽與蛋白質
p.90
表 3-5
歐亞書局
CH 3 胺基酸、胜肽與蛋白質
p.91
範例 3-1 胜肽的離子交換
一位生物化學家想要利用離子交換管柱層析法分離兩條 胜肽。在這支管柱移動相的 pH 值下，胜肽（A 與 Asp 殘基比 Arg Lys 及 His 殘基多；而另一條胜肽（B）的淨電荷則為 ＋1。請問哪一條胜肽在陽離子基質中先被沖提下來；而 哪一條胜肽則是在陰離子基質中先被沖提下來？
歐亞書局
CH 3 胺基酸、胜肽與蛋白質
p.90
蛋白質可利用電泳分離與鑑定
另一種用以分離蛋白質的重要技術是基於帶電蛋白質 分子在電場中之移動，此過程稱之為電泳（ electrophoresis）。
蛋白質電泳最常使用之膠體介質為聚丙烯醯胺之共價 聯結聚合物（圖 3-18）。
電泳中負責移動大分子蛋白質的是電位能 E，泳動率 μ 是該粒狀分子之速度 V 與電位能之比值。泳動率也 等於該分子之靜電荷 Z 與摩擦係數 f（此值部分反應 出蛋白質之形狀）之比值。可以下式表示：
p.91
圖3-18(b) FIGURE 1-13
歐亞書局
CH 3 胺基酸、胜肽與蛋白質
p.91
圖3-18(b)(續) FIGURE 1-13
柱层析法的原理和方法分析
柱层析法的原理和方法分析柱层析法是一种分离和分析混合物中组分的常用方法，它基于不同组分在固定相和流动相之间的不同分配行为，通过在填充在柱中的固定相上的流动相中进行分离。
下面将详细介绍柱层析法的原理和方法。
一、原理：柱层析法基于组分在固定相和流动相之间的相互作用差异来实现分离。
其中，固定相是一种特定的吸附剂或分离介质，它占据了柱子的内部空间。
而流动相是运动的溶液，它通过柱子并与固定相接触。
在固定相的作用下，样品中各个组分会以不同的速度通过柱子。
固定相可以通过物理吸附、化学吸附、离子交换、分子筛等方式与不同组分发生相互作用。
这种作用力会使得样品组分在流动相中的速度不同，从而使得各个组分在柱中分离。
通常情况下，移动相的性质和柱子中固定相的选择是需要考虑的关键因素之一二、方法分析：1.实验准备：确定需要分离的混合物，并选择合适的固定相和流动相组合。
准备量取定量混合物溶液，待用。
2.柱装填：将合适的固定相按照一定方法装填到柱子中。
根据需要，可以选择压缩或不压缩填充方法。
3.样品进样：将预先制备好的样品溶液以适量的体积注入柱子，等待分离进程进行。
4.分离过程：打开进样阀，使样品进入柱中。
样品会在固定相和流动相的作用下发生分离，不同组分会以不同的速度移动。
其中，流动相会冲走一些组分，而其他组分会在固定相上发生吸附。
5.检测和结果分析：使用合适的检测手段如紫外可见光谱检测、荧光检测等，在柱的出口位置定时检测样品的组成。
通过不同组分的峰值高度、面积等参数，可以推断出各个组分的浓度和分离效果。
6.结果计算和报告：根据检测结果，计算各个组分的浓度。
最后做出结果报告，包括每个组分的峰值高度、面积，浓度等。
总结：柱层析法是一种常用的分离与分析方法，其原理基于固定相和流动相之间的相互作用差异，通过对混合物中不同组分在固定相和流动相中分配行为的利用来实现分离。
柱层析法的方法包括实验准备、柱装填、样品进样、分离过程、检测和结果分析、结果计算和报告等步骤。
层析填料的选择及其装柱技术介绍幻灯片
理想的基质应符合下面的要求： 1．极低的非特异性吸附。 2．高度的亲水性。 3．较好的理化稳定性。 4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。 5．适当的多孔性。
一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联 葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。
常用亲和吸附剂采用的基质
反相层析填料的选择原则
考虑样品组分的种类和性质、分离的规模及对分辨率 的要求、流动相条件：
待分离物分子量，对介质孔径的选择提供指导； 样品组分的疏水性质决定采用何种配基； 分离的规模及对分辨率的要求也是须考虑的因素，通
常分离规模和分辨率的关系是负相关的 ； 反相层析时的流动相条件很大程度上影响反相介质基
层析填料的选择 及装柱技术介绍
佳辰公司生物中心 陈阶
2012-04-18
如何选择填料？
一、依据所纯化的对象的各物理和化学特性。
（一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、 核酸等）
二、纯化所要达到的目的（粗提？中度纯化？ 精细纯化？）。
三、所要选择的层析方法
1. 凝胶过滤 ( Gf)
易脱落。 4) 配体自身应具有较好的稳定性。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）
亲和吸附介质的配基
（1）酶的抑制剂 （2）抗体 （3）A蛋白 A蛋白（protein A）为分子量约42KD的蛋白质，
Sephadex LH-20 同时具备亲水和亲脂双重性质， 且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作 用。
Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似 的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初 步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对 映同分异构体的分离。
层析柱装柱流程
层析柱装柱流程介绍层析柱是一种常用于分离和纯化化合物的技术，其基本原理是利用化合物在不同介质中的亲和力差异而实现分离。
层析柱分为填充柱和装柱两种，本文将主要介绍装柱流程。
装柱前准备工作确定分离目标在装柱前，需要明确分离目标，以选择合适的载体和介质，如离子交换色谱柱、逆相色谱柱、凝胶过滤柱等。
准备层析柱和配件根据选择的层析柱类型，选购适当的层析柱、压力计、样品瓶、钝化剂等必要配件。
准备介质根据选择的柱类型和实验需求，选择合适的介质。
在使用新柱前，需要进行开柱处理，以去除杂质和预处理柱体。
装柱流程1. 柱体预处理将新柱体安装在装置中，流通适当的缓冲溶液经过柱体，洗涤不溶于溶液中的杂质和微生物。
2. 样品准备用适当的缓冲液将样品准备妥当，剔除其中的微粒和杂质。
3. 柱体装填将预处理后的柱体安装在柱体装填器上，逐层添加介质和样品，并用特殊方法将介质压实，尽可能减小柱体和样品的空隙。
4. 柱体检测装填完成后，用压力计检测柱体的漏气和密封情况，确保柱子健康并正常工作。
5. 样品装柱用希望分离的样品样品注入装好介质的分离柱，并应用压力调节器，并通过仪器程序使样品流过柱体。
在这个过程中，样品将在介质上进行分离。
6. 分离结果分析在对样品通过柱体后，将流出的溶液进行采集和处理，并用相应的分析方法对化合物进行测定。
后续处理1. 柱子的清理在完成实验后，需要将层析柱进行清洗以去除残留的样品和介质，防止柱体污染和结晶，降低柱子的使用寿命。
2. 柱子的储藏对于长期不使用的柱体，需要将柱子放置在特定的保护剂中，以保持干燥和清洁状态，防止介质变质或者柱子老化。
装柱流程是层析柱实验的重要步骤之一，其良好的实施关系到实验结果。
在实验前，需要仔细做好准备工作，掌握每一个环节的操作细节，并进行严格的柱子检测和后续处理工作。
柱层析纯化
柱层析纯化一、概述柱层析纯化是分离、纯化和富集生物大分子的一种常用技术。
它是利用各种不同的化学和物理性质来分离、提纯和富集混合物中的目标分子，如蛋白质、核酸等。
柱层析纯化技术已经成为生物制药工业中最常用的方法之一，因为它可以高效地从复杂混合物中提取目标分子，并且能够在较短时间内得到高度纯净的产物。
二、柱层析原理柱层析是基于不同组分在固定相上的不同亲和力而进行分离的。
固定相通常是填充在管柱中的小颗粒，这些颗粒可以根据表面化学性质进行选择性修饰。
样品通过固定相时，会与其表面发生相互作用，使其在固定相上停留时间不同，从而实现了对样品组分的分离。
三、柱层析步骤1. 选择填料：根据需要分离的目标分子特异性选择填料；2. 制备填料：将填料与特异性结合剂进行反应；3. 装填柱子：将填料装入柱子中；4. 平衡柱子：在样品加入之前，用适当的缓冲液平衡柱子；5. 加入样品：加入经过前处理的样品；6. 洗脱杂质：用缓冲液洗脱非特异性结合的杂质；7. 洗脱目标分子：用特定条件洗脱目标分子；8. 收集纯化产物：收集纯化后的产物。
四、柱层析类型1. 亲和层析：利用特异性结合剂选择性地捕捉目标分子。
2. 尺寸排除层析：根据分子大小进行分离。
3. 离子交换层析：通过离子交换基团对带电荷的生物大分子进行选择性捕捉。
4. 逆相层析：根据生物大分子在水相和有机相之间的亲和力差异进行分离。
五、优点与局限优点：1. 可以高效地从复杂混合物中提取目标分子，并且能够在较短时间内得到高度纯净的产物。
2. 操作简单，容易掌握，可以快速实现自动化操作。
3. 适用于各种生物大分子的分离纯化，具有广泛的应用前景。
局限：1. 填料选择和柱子操作需要一定的专业知识和经验。
2. 操作过程中可能会引入杂质，影响纯化效果。
3. 操作过程中需要严格控制条件，如温度、pH值等，否则可能会影响纯化效果。
六、应用柱层析技术广泛应用于生物制药工业、生命科学研究领域以及食品和环境监测等领域。
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识来源：易生物实验浏览次数：2755 网友评论0 条凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。
关键词：层析凝胶测定层析柱装填柱效测定分子筛层析排阻层析凝胶过滤层析一、实验目的和内容目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；2. 熟悉凝胶层析的一般过程；3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。
内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填；2. 凝胶柱柱效测定；3．凝胶再生的方法。
二、实验仪器和试剂1. 实验仪器层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管易生物仪器库：/yp/product-list-42.html易生物试剂库：/yp/product-list-43.html2. 实验材料和试剂Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）三、实验步骤清洗层析柱测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液（重复使用的填料，从此步开始）边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)始终保护凝胶上端有一段液体准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脱，记录t r(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)，计算单位高度的柱效（参考完成时间16：00）柱效计算公式：N = 5.54•［θr/( W 1/2)］2其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。
东曹牌TOYOPEARL NH2-750F离子交换填料使用说明书
离子交换填料TOYOPEARL NH2-750F 使用说明书东曹株式会社安全注意事项［注意标签］■远离火源使用易燃溶剂时，请务必小心。
否则可能会导致火灾、爆炸或中毒。
■使用环境必须通风良好如果通风不良，易燃或有毒溶剂可能会导致火灾、爆炸或中毒。
■请勿喷洒溶剂溶剂发生喷洒或泄露可能会导致火灾、触电、中毒、受伤以及腐蚀。
清除漏出的溶剂时，请佩戴合适的护具。
■请佩戴护目镜和防护手套有机溶剂和酸属于有害物质，切勿直接接触皮肤。
■请小心处理包装处理不当可能会导致产品破裂或溶剂飞溅。
■请勿将本产品用于其他目的本产品仅可用于小分子和蛋白质的分离和提纯。
请勿用于其他用途。
■请确认化合物的安全性请确认分离和提纯后的化合物和溶剂安全可靠。
■正确废弃请根据当地法律法规正确废弃。
注■请妥善保管本说明书，以便日后参阅。
注意事项：出厂溶剂注意事项：TOYOPEARL填料目录1. 简介 (1)2. 使用步骤 (1)3. 保存 (4)4. 备注 (4)1. 简介TOYOPEARL NH2-750F是由多孔球形聚合物（粒径：30～60 μm）构成的弱阴离子交换填料。
TOYOPEARL NH2-750F特点如下：·包装上显示的填料量表示重力沉降后的填料量，非液体总量。
·在不同pH值或盐浓度的缓冲溶液中，填料体积的变化可忽略。
·可以采用较高流速。
·有效抵御微生物的生长。
·也适用于HPLC系统。
2. 使用步骤2-1 小颗粒去除（1）将500 mL的填料倒入3000 mL的烧杯中。
（烧杯的体积应为填料体积的6倍）。
（2）向烧杯中添加2000 mL的纯水（约为填料体积的4倍），搅拌并静置。
注：TOYOPEARL NH2-750F需要静置的时间约为45～60分钟。
（3）一旦填料静置完成后，小心倒出表面的悬浮液（含小颗粒）。
（4）将步骤（2）和（3）重复3次或以上。
图1 小颗粒去除2-2 清洗TOYOPEARL NH2-750F填料出厂及保存使用的是20 %乙醇水溶液。
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一、原理：
有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。
如：
R-SO3H＋M+ ————R-S3M＋H+
或R-NH3OH＋CL－—————R-NH3CL＋OH－
这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。
由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。
二、目的与要求：
本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。
通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。
三、仪器与装置：
玻璃层析柱：长19cm，内径1.2cm，3# 砂芯。
HL-2型恒流泵。
HD-4型电脑核酸蛋白检测仪。
BS-100A自动部份收集器。
250ml烧杯。
1ml吸管。
水浴锅。
72型（或721型）分光光度计。
四、试剂与药品：
树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。
洗脱液：0.45N，PH5.3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸（C6O7H8•H2O）；186g 97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。
样品液：0.005M ASP和LYs的0.02N HCL混合溶液。
显色剂：显色剂列出两种可任选一种。
显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。
10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0.85 ml TiCL3（15%）
显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。
0.1M KCN:0.1628g KCN溶于水中稀释至250ml
A、将1.25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。
B、将2.5ml 0.01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。
将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。
此溶剂用时，A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。
五、方法与步骤：
1、树脂的处理：
关于市售新树脂的处理见7、，本实验采用处理好的树脂。
2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。
将经处理已成钠型的树脂置于烧杯中，加进1倍体积的柠檬酸缓冲液，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满。
倒时不要太快，以免产生泡沫。
待树脂在柱底逐渐沉积至约1cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液直至柱体装到8cm高度为止。
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬浮液的温度要相对恒定（特别是
对于采用高温法）。
装好的柱体应该没有纹路，没有节痕，没有气泡，柱顶表面平整而均匀。
如此，方可投入使用，否则须要重装。
3、平衡：
柱装好后接上调好流速的恒流泵或恒压洗脱瓶，用柠檬酸缓冲洗脱液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的PH与洗脱液的PH相同为止，这大约需要2-3倍床体积。
4、加样与洗脱：
移去柱上加液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至体表面时即行关闭。
用加样吸管吸取0.5ml氨基酸酸混合样品溶液。
沿柱壁小心地加入柱中，加样不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液，如此清洗柱内壁四周2-3次。
洗涤后，用缓冲液在柱内加至2-3cm高的液层，然后接上加液器，调好流速（24ml/hr）即开始洗脱。
注意在调节流速时要排除掉恒流泵或恒压瓶与柱之间连接管内的所有气泡。
并且在调节时不要过猛，以免影响层析行为。
5、收集：柱流液可用自部分收集器约收20管。
6、测定：
将收集的各管编号后，分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中，加入1ml洗脱缓冲液；
0.5mlKCN茚三酮试剂，混合后在100℃水浴加热25分钟，然后水冷却5-10分钟，加3ml 60%乙醇稀释，摇匀后用72型或721型分光光度计在570nm处比色。
测定后，以光吸收为纵坐标，收集的管数或ml数为横坐标绘制洗脱曲线。
7、再生：
对于装好的柱使用几次后需要0.2N NaOH溶液洗脱，再用蒸馏水洗至中性后重复使用。
对于市售的干树脂其处理方法为：先经水充分溶张后，倾泌去除细粒并使水澄清。
然后经浮选得到颗粒大小合适的树脂，浮先后用4倍量的2N HCL和2N NaOH依次浸洗，每次半小时，换酸或碱时要用水将树脂洗至中性，最后树脂应处理至溶液无黄色。
这时再用1N NaOH使树脂转成钠型（对于基它的转型要视实验和树脂的情形而定），以蒸馏水洗至中性备用。
对于不知或难以估计层析行为的样品层析时，要采用逐管收集测定跟踪法，以便掌握层析的结果。
氨基酸测定一般在1PH左右，在本实验中因缓冲液的PH就为5.3，因此可直接测定。
但如果PH偏差要求太大，则可以加1ml、2N，PH5.5醋酸缓冲液，以保证测定条件。