有谁可以详细讲述一下二代测序下机后数据分析流程和所用到的软件及程序
DNA第2代测序技术
• Solexa技术在合成中每次只能添加一个dNTP，因此很好 地解决了同聚物长度的准确测量问题。
图3. SOLiD测序技术流程
• SOLiD技术与Solexa技术类似，后续的序列拼接工作也 比较复杂。 • SOLiD技术每个循环的数据产出量为10-15 Gb，耗时约 为6-7天。 • SOLiD技术每个循环可以测两个上样玻片，读取长度可达 2×50bp，而且由于采用两碱基测序，该技术的准确率能 达到99.94 %以上。
1.3 第2代测序技术的特点
• 速度快 • 准确度高
• 成本低
• 覆盖度深
• 产出巨大
1.4 第2代测序技术的原理
• 第2代测序技术包括Roche公司的454技术、Illumina公司 的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。 • 下面对三种第二代测序技术的原理和特点分别进行具体介 绍。
• 高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非 编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技 术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度， 使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新 的小分子RNA。在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑 猩猩中都已经成功地找到了新的小分子RNA。在线虫中 获得了40 万个序列，通过分析发现了18个新的小RNA分 子和一类全新的小分子RNA。
1.2 为什么要发展第2代测序技术
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一 直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包 含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基 因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的 复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要 的角色。
二代dna测序技术数据的处理流程
二代dna测序技术数据的处理流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢!本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!二代DNA测序技术数据的处理流程引言DNA测序技术的发展为生物学、医学等领域带来了革命性的变化。
二代基因测序流程和试剂
二代基因测序流程和试剂的步骤和流程引言二代基因测序是一种高通量、高效率的基因测序技术，能够大规模地获取DNA或RNA的序列信息。
本文将详细描述二代基因测序的流程和试剂的步骤和流程，确保流程清晰且实用。
流程概述二代基因测序的流程可以分为样品准备、DNA或RNA提取、文库构建、聚合酶链式反应（PCR）、测序和数据分析等步骤。
下面将详细介绍每个步骤的具体操作和试剂使用。
1. 样品准备样品准备是整个二代基因测序流程的关键步骤，合理的样品准备可以保证后续步骤的顺利进行。
样品可以是组织、细胞、血液等，需要根据研究目的进行选择。
样品准备的步骤包括：1.1 样品收集根据研究目的选择合适的样品，并采用合适的方法进行收集。
例如，对于组织样品，可以通过手术获取；对于细胞样品，可以通过培养或离心分离等方法获取。
1.2 样品保存采集后的样品需要及时保存，以防止样品质量的降低。
常用的保存方法包括冷冻保存和固定保存。
冷冻保存可以使用液氮保存或低温冰箱保存，固定保存可以使用甲醛等试剂进行固定。
2. DNA或RNA提取DNA或RNA提取是获取样品中的核酸的关键步骤，常用的提取方法包括酚-氯仿法、盐酸法和商用试剂盒法等。
下面以商用试剂盒法为例进行介绍：2.1 样品裂解将样品加入裂解缓冲液中，通过离心等方法使细胞或组织破碎，释放出DNA或RNA。
2.2 蛋白酶处理加入蛋白酶将样品中的蛋白质降解，以便后续纯化DNA或RNA。
2.3 DNA或RNA纯化将裂解液加入商用试剂盒中，通过离心等方法将DNA或RNA与其他杂质分离。
根据试剂盒的不同，可以使用硅胶膜或磁珠等材料进行纯化。
2.4 洗脱DNA或RNA将纯化后的DNA或RNA从硅胶膜或磁珠上洗脱下来，得到纯化后的DNA或RNA。
3. 文库构建文库构建是将提取到的DNA或RNA转化为测序所需的文库，常用的文库构建方法包括PCR文库构建法和片段文库构建法。
下面以PCR文库构建法为例进行介绍：3.1 DNA片段制备将提取到的DNA通过限制性内切酶或超声波等方法制备成适当的片段。
第二代测序技术简介
第二代测序技术（Next-Generation Sequencing）NGS之基础篇2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成。
转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推出。
HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。
从HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中之一。
2006年，美国X大奖基金会（）设立了奖金高达1000万美元的基因组Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。
而罗氏（Roche）、应用生物系统（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。
2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。
随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且准确率达到99%以上。
2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。
虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的地位。
二代测序技术的原理与应用
二代测序技术-可逆阻断技术
二代测序技术-Ilumina测序原理
二代测序技术-Ilumina测序流程
二代测序技术-Ilumina测序流程
二代测序技术- 454 测序原理
焦磷酸测序(Pyrosequencing)
在测序时,使用了一种叫做“Pico TiterPlate”(PTP)的平板,它含 有 160多万个由光纤组成的孔,孔中载有化学发光反应所需的 各种酶和底物。测序开始时,放置在四个单独的试剂瓶里的四 种碱基,依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板,每次只进 入一个碱基。如果发生碱基配对,就会释放一个焦磷酸。这个 焦磷酸在各种酶的作用下,经 过一个合成反应和一个化学发 光反应,最终将荧光素氧化成氧化荧光 素,同时释放出光信号。 此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获 到。有一个碱基和测序模板进行配对,就会捕获到一分子的光 信号;由此一一对应,就可以准确、快速地确定待测模板的碱 基序列。
在第二代中最高读长；比第 一代的测序通量大
样品制备较难；难于 处理重复和同种碱基 多聚区域；试剂冲洗 带来错误累积；仪器 昂贵
很高测序通量
仪器昂贵；用于数据 删节和分析的费用很 高
很高测序通量；在广为接受 的几种第二代平台中，所要 拼接出人类基因组的试剂成 本最低
测序运行时间长；读 长短，造成成本高， 数据分析困难和基因 组拼接困难；仪器昂 贵
• 高通量测序技术
大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了 高准确性
• 主流平台
Ilumina (Solexa, Hiseq); Roche 454; ABI(Solid)
• 测序原理
合成法测序 连接法测序
第二代测序的基本流程
二代测序原理及应用
二代测序原理及应用二代测序技术是指第二代测序技术，也称为高通量测序技术。
它是指通过并行测序技术，能够在较短的时间内完成大规模DNA或RNA的测序。
二代测序技术具有高通量、高效率、低成本等特点，因此在基因组学、转录组学、表观基因组学等领域有着广泛的应用。
本文将对二代测序的原理及其应用进行介绍。
首先，我们来了解一下二代测序的原理。
二代测序技术主要包括Illumina、Ion Torrent、454等多种技术平台。
这些技术平台都是基于不同的原理进行测序的。
以Illumina为例，其原理是将DNA样品切割成短片段，然后通过桥式PCR扩增得到cluster，再通过测序芯片上的碱基逐一加入，通过荧光信号检测得到序列信息。
而Ion Torrent则是通过检测DNA合成过程中释放的氢离子来进行测序。
454则是通过测定DNA合成过程中释放的焦磷酸来进行测序。
这些原理都是基于不同的信号检测方式，但都能够实现高通量测序。
其次，我们来看一下二代测序技术的应用。
在基因组学研究中，二代测序技术可以用于揭示物种的基因组结构、功能基因的鉴定、基因组变异的分析等。
在转录组学研究中，可以通过RNA测序技术对转录本进行定量和定性分析，揭示基因的表达模式、剪接变异等信息。
在表观基因组学研究中，可以通过甲基化测序技术对DNA甲基化进行分析，揭示基因组的表观遗传信息。
此外，二代测序技术还可以用于微生物组学研究、癌症基因组学研究、个体化医疗等领域。
总之，二代测序技术作为一种高通量测序技术，具有高效、快速、低成本等优点，已经在基因组学、转录组学、表观基因组学等领域得到了广泛的应用。
随着技术的不断进步，相信二代测序技术在生命科学领域的应用将会更加广泛，为我们揭示更多生命科学的奥秘。
二代测序原理及应用
二代测序原理及应用1 什么是二代测序二代测序（Second Generation Sequencing，SGS），也被称为高通量测序，是目前被广泛采用的DNA测序技术。
它可以同时测序物种的大量DNA，一次性对一个样本中的基因组进行完整的测序，从而减少了人力费用和时间消耗，已被用于功能基因组研究，种质工程，染色体计数等方面。
2 二代测序原理二代测序技术又称为“随机扫描（Random Scanning）”测序技术，是基于“产生克隆，扩增特定序列，随机扫描和高通量凝胶电泳”的原理。
其中，产生DNA克隆是根据基因组上的特定序列产生DNA片段的一种连锁反应，生成大量的同一序列的大量分子克隆；扩增特定序列是将特定的DNA片段的模板分子，新的DNA复制含有该特定序列的DNA片段；随机扫描是指，由DNA测序仪扫描得到的不同的DNA Sequence；高通量凝胶电泳是指把经过克隆和扩增完成后的独特片段，通过凝胶电泳分析，比对出序列。
3 二代测序技术应用二代测序技术可以更精确，更快速地测序一个物种的全部 DNA，它可以特异性地测序变异位点，并具有自动化扩增，高通量以及低成本等特点，可以替代传统的单基因、低通量测序方法，应用于人类基因组学、基因克隆，转基因动植物研究，比较基因组学，物种的系统分类以及多种人类疾病的基因组学研究等。
最近，二代测序技术在病毒分离，基因组大变异，噬菌体基因组等方面的应用也日益增多，为提高病毒分离、基因表达分析和生物科学研究等场合提供了新的研究手段，也为疾病的早期筛查和诊断奠定了基础。
4 优势二代测序技术的优势在于，其使用了一种模块化的设计，使两个相同片段的测序完全同步，从而降低了批量测序的时间。
除此之外，二代测序技术还支持多重测序，如多家样本同时测序。
此外，因为它允许突变的检测，所以经常被用于噬菌体及病毒测序，基因表达分析以及精细调控网络等研究。
总之，二代测序技术已经成为基因组测序行业的主导技术。
08illumina二代测序分析软件介绍
什么是MiSeq Reporter
Miseq 仪器用来做数据分析的网页界面软件 RTA初级分析结束之后，MiSeq Reporter将会自动进行数据分析 如果MiSeq上有新的run进行测序，MiSeq Reporter数据分析将会自动终止，MiSeq 会进入新run测序初级分析模式
17
进入MiSeq Reporter
数据分析流程
初级分析 信号处理 & basecalling 二级分析 比对，拷突变、插 入，缺失等 数据挖掘 生物学意义
数据复杂度
tiff
bcl
fastq
bam
vcf/gvcf
？
数据分析难度
2
数据分析流程
初级分析 信号处理 & basecalling 二级分析 比对，拷突变、插 入，缺失等 数据挖掘 生物学意义
Bustard
(base calling)
.bcl
Off-Line Basecaller（OLB）
samplesheet
bcl2fastq
图片文件分析完成后就删除
4
RTA工作流程
Error Rate First Base Report Final Cluster Density Phasing Clusters PF
11
无效的SampleSheet（案例3）
肉眼看 Samplesheet无任何错误！但bcl2fastq依然会报错？
FCID C0GNJACXX C0GNJACXX C0GNJACXX C0GNJACXX C0GNJACXX C0GNJACXX C0GNJACXX C0GNJACXX C0GNJACXX C0GNJACXX C0GNJACXX Lane 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 SampleID SampleRef PhiX PhiX P12R001 P12R002 P12R003 P12R004 P12R005 P12R006 P12R007 P12R008 P12R009 P12R010 Index ATCACG CGATGT TTAGGC TGACCA ACAGTG GCCAAT CAGATC ACTTGA GATCAG TAGCTT Description control lane example example example example example example example example example example Control Y N N N N N N N N N N Recipe Operator xy xy xy xy xy xy xy xy xy xy xy SampleProject PhiX example example example example example example example example example example
二代测序原理及报告解读
二代测序原理
边 复 制 边 测 序
扩
复
增
制
二代测序原理
制复
增扩
边 复
制
边测序DNA的建立捕获目标片段二代测序
安捷伦捕 获试剂盒
illumima 测序平台
二代测序流程复杂，参数繁多
需要检测的基因序列 所有碱基数量之和
现在报告中使用的参数
目标区覆 目标区平
测序质量
盖度
均深度
2.1 基因变异所致疾病及遗传方式
使用孟德尔遗传数据库查找基因所致疾病及遗传方式
显性与隐性遗传共存在
多种遗传方式
不完全显性
2.结果具体分析
1）该基因突变致病疾病类型及遗传方式 2）该样本的此处突变是否为致病性突变 明确致病和可疑致病 3）该样本的突变型最终是否患病
2.2 查找突变位点的致病性
2.3 总结突变与患病的关系
• 从遗传方式看有没有患病的可能性 • 从突变类型看有没有患病的可能性
ACMG突变解析指南
未报道致病位点，致病可能性的评估指南，节选其中可能致病性很强列表如下：
3.基因与疾病背景介绍
• 基因介绍来自于Gene数据库 • 疾病介绍来自于OMIM、罕见病数据库或其他外文权威
99.8% 274.67
目标区平均深度 >20X比例
99.7%
报告结果中的数据意义
检测到与临床相 关发生突变的基 因
转录本 编号
Exon 编号
CLCN2
NM_0011710 Exon
88
21
同一个基因可有 不同的别名，使 用Gene数据库 统一名称
同一基因可有 外显 不同的转录本， 子 通过Gene数 据库查突变类 型时必须使用 或换算到同一 转录本的突变 点
第二代测序技术
优点：长读长( Long reads) 可以帮助研究者 对变异进行更准确的定位。另外，该平台通量 高、费用较低、耗时短。
缺点：会出现插入和缺失错误
1． 3 纳米孔单分子技术
Oxford Nanopore Technologies 公司研发的测序技术完全不同于前两种
测序技术，其核心就是将在某一面上含有一对电极的特殊的脂质双分子层 置于一个微孔之上，该双分子层中含有很多由α 溶血素蛋白组成的纳米孔中
2． 1 基因组测序 2． 2 甲基化研究 2． 3 突变鉴定( SNP 检测) 2． 4 RNA 测序 2． 5 重复序列和poly 结构的测序
2． 1 基因组测序
由于具有读长长的特点，SMRT 测序平台在基因组测序中能降低测序后的Contig 数量， 明显减少后续的基因组拼接和注释的工作量，节省大量的时间。Christophern 等仅仅用0. 5 × 的PacBio RS 系统长度的数据与38 × 的二代测序( NGS) 的测序数据，对马达加斯加的一种 指猴基因组进行拼装，大幅度提高了数据的质量和完整度，同时借助Pacbio RS 的帮助将原有
至300-800bp间，经末端修复与特异性接头 连接等修饰后变性处理回收单链的DNA 。
454 (GS-FLX)流程
包水的混合 物，每个独特的片断在自己的微反应器里进 行独立的扩增，回收纯化；
2.4 RNA 测序
根据三代测序技术实时测序的特点，可以直接对RNA 进行测序，做到了对特定 组织和细胞内的表达差异的精确定位。运用Helicos 操作平台对酵母的聚腺苷酸化的 转录本进行精确定量，用50 个通道中的6个通道，共产生2． 4 亿个Reads。利用
Helicos 遗传分析平台可以将DNA 聚合酶换成反转录酶对RNA 直接测序，主要通过
二代测序 实验流程
二代测序实验流程英文回答：Sequencing is a fundamental technique in molecular biology that allows us to determine the order of nucleotides in a DNA molecule. The second generation sequencing, also known as next-generation sequencing (NGS), has revolutionized the field of genomics with its high-throughput and cost-effective approach. In this response, I will explain the general workflow of a typical second-generation sequencing experiment.The first step in a second-generation sequencing experiment is the preparation of the DNA sample. This involves isolating the DNA of interest and fragmenting it into smaller pieces. Various methods can be used for DNA fragmentation, such as enzymatic digestion or mechanical shearing. Once the DNA is fragmented, adapters are added to the ends of the DNA fragments. These adapters serve as priming sites for the subsequent steps in the sequencingprocess.After the DNA sample preparation, the next step is library construction. In this step, the DNA fragments with adapters are amplified through PCR (polymerase chain reaction) to generate a large number of identical copies of each fragment. This step is crucial as it increases the amount of DNA available for sequencing and ensures that each fragment is represented adequately.Once the library is constructed, it is loaded onto the sequencing platform. There are several different sequencing platforms available, such as Illumina, Ion Torrent, and Pacific Biosciences. Each platform has its unique sequencing chemistry and technology. For instance, Illumina sequencing utilizes reversible terminators andfluorescently labeled nucleotides to determine the sequence of the DNA fragments.During the sequencing run, the DNA fragments in the library are sequenced in parallel, generating millions of short reads. These short reads are then processed andanalyzed using bioinformatics tools to reconstruct the original DNA sequence. This involves aligning the reads to a reference genome or assembling the reads de novo to generate a consensus sequence.Once the sequencing run is completed, the data analysis step begins. This involves quality control, read mapping, variant calling, and downstream analysis. Quality control ensures that the sequencing data is of high quality and free from artifacts. Read mapping involves aligning the reads to a reference genome to determine their genomic location. Variant calling identifies genetic variations, such as single nucleotide polymorphisms (SNPs) orinsertions/deletions (indels), in the sequenced DNA.In summary, the workflow of a second-generation sequencing experiment involves DNA sample preparation, library construction, sequencing, and data analysis. This process allows us to obtain high-quality DNA sequences and gain insights into the genetic makeup of an organism.中文回答：测序是分子生物学中的一项基本技术，可以确定DNA分子中核苷酸的顺序。
新二代测序技术工作流程
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对样本进行处理和提取，以获得高质量的 DNA 或 RNA。
简述二代测序的工作流程
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1. 样品制备。
提取DNA/RNA样品，并对其进行定量和质量控制。
第二代测序技术的应用
第二代DNA测序技术应用DNA测序作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。
1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法。
然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术应运而生。
第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system三种。
这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低。
SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。
下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。
2.基本原理Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
3.操作流程1）测序文库的构建（Library Construction）首先准备基因组DNA，然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头。
如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。