分光光度法测定酶转化液中L_丝氨酸含量_冯志彬

关键词：L-丝氨酸；甘氨酸；分光光度法；含量测定
中图分类号：O657.32
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2014）07-0102-03
doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.023
Determination of L-serine in enzyme conversion liquid by spectrophotometry
衍生缓冲液：称取碳酸氢钠4.2 g，加双蒸水定容至 100 mL，摇匀后备用。
定容缓冲液：称取磷酸二氢钾3.4 g，加入0.1 mol/L NaOH 145.5 mL，加双蒸水定容至500 mL。 1.3.2 分光光度法
酶转化液8 000 r/min离心5 min，上清液过0.45 μm滤 膜，将滤液点样于层析三号滤纸，点样量2 μL，置于层析 缸内，上行展开。待层析液上行至距滤纸顶端1.0 cm左右 时，取出自然晾干后，均匀喷涂显色剂，置于95 ℃烘箱中 显色10 min，将氨基酸显色斑点剪下后于25 mL比色管中， 加5 mL洗脱剂洗脱20 min，得洗脱液，在7200分光光度计 上测吸光度值[8]。
分析与检测
中国酿造
2014 年 第 33 卷 第 7 期
总第 269 期
·103·
不同体积比例在棕色容量瓶中混合定容。 洗脱液：量取75 mL无水乙醇加双蒸水定容至100 mL，
称取0.5 g硫酸铜溶于水中定容至100 mL，冰箱保存，用 时按38∶2的比例混合。
衍生剂：称取1 g 2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB），溶于乙腈，定容至100 mL，现用现配。
酮、水、氨水展开体系有利于分离前体物甘氨酸和产物L-丝氨酸，在此条件下得到吸光度与L-丝氨酸含量的线性关系，线性相关系数
为0.999 1，方法检出限为0.061 2 g/L，平均回收率为100.9%，平均相对标准偏差为3.341%。与氨基酸分析仪相比，该法具有良好的相
关性和准确的精密度，是一种简单、有效、快速的测定方法。
3
（d）
正丁醇∶丙酮∶水∶氨水 （10∶15∶5∶2）
2.5
（e）
正丁醇∶丙酮∶水∶二乙胺 （4∶3∶2∶1）
5
17.6
（1）0.18 （2）0.19
17.5
（1）0.51 （2）0.67
17.8
（1）0.28 （2）0.47
17.7
（1）0.41 （2）0.55
注： “（1）”为甘氨酸Rf值“；（2）”为L-丝氨酸Rf值。
separation of L-serine and glycine
编号 （a）
展开剂组分（V/V）
正丁醇∶冰醋酸∶水 （4∶2∶1）
展开时间/h 4
展开距离/cm Rf值
17.5
（1）0.15 （2）0.16
（b）
正丁醇∶丙酮∶水 （2∶1∶1）
5
（c）
正丁醇∶乙醇∶水∶二乙胺 （10∶15∶5∶8）
结果表明，展开剂中的正丁醇∶丙酮∶水∶氨水的体积比 为10∶15∶5∶2 时，L-丝氨酸和甘氨酸分离效果最好，不仅层 析斑点不扩散且斑点之间的距离较大（即Rf值差值大）， 而且L-丝氨酸和甘氨酸的层析斑点没有拖尾现象，呈圆形 斑点。该方法的线性方程为C=12.412A-0.054 5，相关系数 R2=0.999 1，最低检测质量浓度为0.061 2 g/L，平均回收 率为100.9%，RSD 3.341%。转化液样品前处理后采用本法 测定L-丝氨酸含量获得了满意的检测结果，证明该方法符 合L-丝氨酸生产过程中的测定要求。
2014 Vol.33 No．7
·104· Serial No．269
China Brewing NhomakorabeaAnalysis and Examination
酸的分离效果最好，不仅层析斑点的Rf值较大，斑点之间 的Rf值差距较大，而且两种氨基酸色斑的收敛性较好，没 有明显的拖尾现象，呈圆形斑点，其中以正丁醇-丙酮-水氨水比例为10∶15∶5∶2时效果最好。 2.3 标准曲线的绘制
图1 L-丝氨酸标准品吸收光谱图 Fig. 1 Absorbance spectra of standard L-serine
表1 不同展开剂对L-丝氨酸和甘氨酸的分离效果 Table 1 Separating effect of different developing solvent on the
L-丝氨酸标准溶液：称取L-丝氨酸标准品1 g溶于水 中，定容至100 mL容量瓶中，并置于冰箱中冷藏保存。
0.5%茚三酮溶液：称取茚三酮标准品0.5 g溶于丙酮中， 定容至100 mL，现用现配。
展开剂：将正丁醇、冰醋酸、水、丙酮及氨水等溶剂按
收稿日期：2014-05-17 基金项目：山东省高等学校科技计划项目（J12LD02） 作者简介：冯志彬（1977-），男，讲师，硕士，研究方向为发酵工程。
取经处理后的酶转化液1 mL，8 000 r/min离心20 min， 取上清液过0.22 μm滤膜。准确量取过膜后的酶转化液液 适量（相当于L-丝氨酸0.05 mmol）于50 mL棕色容量瓶中， 加入已经配制好的衍生缓冲溶液5.0 mL，摇匀后再加入衍 生试剂溶液5.0 mL，摇匀，将容量瓶置于60 ℃水浴中暗处 恒温加热60 min后取出，放置待溶液冷却至室温后，加入 定容缓冲液稀释至刻度并摇匀，放置15 min后可以开始进 行色谱分离。色谱分离条件：氨基酸专用色谱ODS柱C18， 5 μm，250 mm×4.6 mm，柱温：33 ℃；检测波长：360 nm；流 动相总流量：1 mL/min。 2 结果与分析 2.1 吸收波长的检测
图2 纸色谱显色结果 Fig. 2 Paper chromatography results
由表1、图2可知，正丁醇-冰醋酸-水及正丁醇-丙酮水体系为展开剂时，L-丝氨酸和甘氨酸的Rf值基本一致， 未出现明显分离；正丁醇-丙酮（乙醇）-水-二乙胺展开体系 能够分离甘氨酸和L-丝氨酸，但展开时间较长且Rf值差距 不太明显；正丁醇-丙酮-水-氨水展开剂对L-丝氨酸和甘氨
图3 L-丝氨酸标准曲线 Fig. 3 Standard curve of L-serine
1 材料与方法 1.1 材料与试剂
L-丝氨酸、L-甘氨酸、茚三酮、正丁醇、丙酮、氨水、二 乙胺、双圈层析三号滤纸：国药集团化学试剂有限公司。 L-丝氨酸酶转化液：鲁东大学生命科学学院应用微生物 研究室生产。 1.2 仪器与设备
7200分光光度计：优尼科（上海）仪器有限公司；氨基 酸专用色谱工作站、UV200Ⅱ紫外可见波长监测器：美国 Laballiance设备公司；SHA-B恒温振荡器：金坛市国旺实 验仪器厂。 1.3 方法 1.3.1 溶液配制
FENG Zhibin, CHEN Guozhong, ZHANG Juan, CHA Yaping, CAO Wei
(College of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China)
Abstract: Determination of L-serine in enzyme conversion liquid was carried out by spectrophotometry. Results showed that the maximum absorbance wavelength of L-serine ninhydrin condensation products was 510 nm, and the compound of normal butanol, acetone, water and aqua ammonia developing agent is good for L-serine and glycine separation. The linear relationship between the absorption and the concentration of L-serine was obtained, and the linear correlation coefficient, detection limit, average recovery and relative standard deviation were 0.999 1, 0.061 2 g/L, 100.9% and 3.341%, respectively. Comparing to the amino acid analyzer, the method is simple, effective and quick, with good correlation and accurate precision. Key words: L-serine; glycine; spectrophotometer; determination
L-丝氨酸是一种重要的药物，在氨基酸输液及多肽合 成方面具有重要用途，同时作为中间物直接用于合成L-多 巴、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸等其他氨基酸，市场 需求量日益提高[1-2]。目前L-丝氨酸主要以甘氨酸为前体通 过生物酶法进行转化生产，建立一种适合 L-丝氨酸和甘 氨酸分离和定量测定的简便、快速的方法尤为重要[3-7]。目 前较为常用的高效液相色谱法和氨基酸分析仪法因操作 步骤复杂、仪器维护繁琐、价格昂贵，较难适应L-丝氨酸生 产过程中的多样品、多频次的测定[8-11]。纸层析法分离氨基 酸是一种微量而快速分离分析鉴定化合物的一种方法[12]。 它是近代生化领域最为常用的快速、高效、灵敏的分离技 术。该法操作简单、易于掌握、费用低、易于普及、分离效 率高，能把各种性质极相类似的组分分离开来，非常适合 在 L-丝氨酸生产过程控制中应用[13-15]。国内学者[8，16]对纸色 谱测定L-丝氨酸含量进行了研究，本实验在借鉴以往研究 的基 础 上 ，采 用 新 的 展 开 剂 进 一 步 缩 短 了 展 开 时 间 ，并 获得更好的分离效果，有利于L-丝氨酸的快速测定，对于 指导L-丝氨酸工业生产过程的精确控制具有参考意义。