蛋白质工程的崛起(优秀版)

• 干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干
扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干 扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天然 产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的β-干 扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存 在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发 现，β-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、 31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱 氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位 的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸， 结果使大肠杆菌中生产的β-干扰素的抗病性活性 提高到108 U/mg，并且比天然β-干扰素的贮存 稳定性高很多。
活动2 某多肽链的一段氨基酸序列是：
……-丙氨酸-色氨酸-赖氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸-…… 丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG 色氨酸：UGG 赖氨酸：AAA、AAG 甲硫氨酸：AUG 苯丙氨酸： UUU、UUC
讨论： 1、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？
请把相应的碱基序列写出来。
每种氨基酸都有对应的三联密码子,只要查一下遗传 密码子表,就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出 来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由 多个三联密码子编码,因此其碱基排列组合起来就比 较复杂,至少可以排列出16种。同学们可以根据学过 的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据三联 密码子推出mRNA序列为GCU（或C或A或G） UGGAAA（或G）AUGUUU（或C），再根据碱基 互补配对规律推出脱氧核苷酸序列：CGA（或G或T 或C）ACCTTT（或C）TACAAA（或G）。
有意思的是这一给生命科学研究及应用领域带来革命性 突破的方法竟然是史密斯和其同事在喝咖啡时闲聊出来的。 现在，几乎每个生物实验室都会用定点突变法来研究基因或 蛋白质的功能。
➢ 蛋白质工程的主要步骤通常包括： （1）从生物体中分离纯化目的蛋白； （2）测定其氨基酸序列； （3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能
科学家面临新的问题
• 在已研究过的几千种酶中，只有极少数可
以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应 用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下 有活性，但在工业生产中没有活性或活性 很低。
• 干扰素是由效应T细胞产生的糖蛋白，可阻
断细胞分裂间期，抑制DNA复制，从而可用 于治疗疾病。但干扰素在体外很难保存。
2．生长激素改造
生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体 的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还 可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发 其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人 的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少 与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合 区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造 加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需 要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需 锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸 侧链，如第18和第21位His（组氨酸）和第17位Glu （谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作 为临床用药还有大量的工作要做。
蛋白质工程的崛起
活动1：如果想让某一个生物的性状在 另外一个生物的身上表达，常用的方法 有哪些？
基因工程成果丰硕
• 植物方面
– 提高植物的抗虫、抗病、抗逆性 – 改良植物的品质
• 动物方面
– 提高动物生长速度 – 改善畜产品的品质 – 用转基因动物生产药物 – 用转基因动物作器官移植的供体
• 研制药物 • 基因治疗
地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;
（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包 括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；
（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如定点突变；
（6）分离、纯化新蛋白，例
1．水蛭素改造
水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有 多种变异体，由65或66个氨基酸残基组成。水蛭素在 临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭 素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水 蛭素主要变异体HV2的设计方案，将47位的Asn（天冬 酰胺）变成Lys（赖氨酸），使其与分子内第4或第5位 Thr（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段的正 确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高4倍， 在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。
例如：
干扰素（半胱氨酸）
体外很难保存
改造
干扰素（丝氨酸）
体外可以保存半年
玉米中赖氨酸含量比较低
天冬氨酸激酶
改造
（352位的苏氨酸）
玉米中赖氨酸含量可提高数倍 天冬氨酸激酶（异亮氨酸）
二氢吡啶二羧酸合成酶 改造 （104位的天冬酰胺）
二氢吡啶二羧酸合成酶 （异亮氨酸）
蛋白质工程的概念
• 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律
• 玉米中赖氨酸的含量比较低
• 在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用
于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产， 这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产 中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每 一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存 在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会 很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产 中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质 的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳 定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨 基酸氧化引起的活性丧失等。
2、确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合 成或改造目的基因（DNA）？
可以通过人工合成的方法获取或基因的定点诱变技 术来改变。
基因会发生突变，突变可以自发，也可以诱发，这是每个稍 有生物学知识的人都知道的常识。但在加拿大生物化学家 M·史密斯（1932－2000）发明定点突变法之前，突变株的 产生必须经由自然界或用化学等方法诱使基因体突变。这类 方法属于随机突变，突变株必须在生物性状上有所改变，才 能确定有突变发生，但除非用分子生物方法或遗传方法找到 此突变处，否则无法确定突变位置。也就是说，这种突变是 盲目的。而史密斯发明的定点突变法却是有目的的，该法可 经由设计好的寡核苷酸，在任何一个基因片段上进行随意或 设计好的突变，也就是说，这种突变是预先设定好的，所以 也有人将该法称为“反遗传法”。
及其与生物功能的关系作为基础，通过基 因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改 造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对 生产和生活的需求。 前提： 了解蛋白质的结构和功能
原理： 改造基因（基因修饰或基因合成）
目的： 定向改造或制造蛋白质
基因表达流程图
蛋白质工程流程图
1. 从预期的蛋白质功能出发 2. 设计预期的蛋白质结构 3. 推测应有的氨基酸序列 4. 找到相应的脱氧核苷酸序列