质粒转化大肠杆菌实验 ppt课件
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10质粒DNA转化大肠杆菌
（ 6 ） 将 复 苏 后 的 菌 液 5000rpm 离 心 3 分 钟 , 吸 取 1.1ml上清液，弃去. （ 7 ）剩余液体轻轻弹匀 , 转到 LB 固体培养基上 , 用 涂棒涂布均匀，吹干.
（8）37℃倒置培养12～16h，挑选出白色单菌落， 用两步法提取质粒，检测克隆的真假阳性.
Hale Waihona Puke 4. 其他：涂棒 、微量移液器
4. 实验步骤 （ 1 ）从 -80℃超低温冰箱取一管大肠杆菌感受态细胞 （200μl），4℃融化. （ 2）在感受态菌液中加入 10μl p1300-TaSTK质粒溶液， 轻轻混匀，冰水浴中放置30min. （ 3 ）取出后在 42℃水浴热激 90Sec ，快速转移至冰水 浴中放置2min. （4）在超净工作台加入1ml LB培养基，37℃摇床复苏 培养0.5～1.0h. （ 5 ）复苏培养结束前 10min, 在超净工作台上各吸取 20μl 40mg/ml IPTG和40mg/ml X-Gal，滴加到LB固体 培养基上，利用涂棒铺匀，吹干.
十、质粒DNA转化大肠杆菌
1. 实验目的
掌握重组质粒 DNA 利用 CaCl2 法转化大肠杆菌的 原理和方法。
2. 实验原理
2.1转化率的影响因素 转化率的高低对于率的因素很多，其中包括：
1）载体DNA及重组DNA： 载体本身性质决定了转化率的高低，不同载体 DNA 转化同一受体细胞，其转化率明显不同。载体 分子的空间构象对转化率也有明显影响，超螺旋结 构的载体质粒往往具有较高的转化率，经体外酶切 连接操作后的载体 DNA或重组 DNA由于空间构象改 变，其转化率一般要比具有超螺旋结构的质粒低。 2）受体细胞： 受体细胞一般要求具有限制重组缺陷性，而且 应与所转化的载体 DNA性质相匹配，如pBR322转化 大肠杆菌JM83株，其转化率不高于103/mg DNA，但 若转化ED8767株，则可获得106/mg DNA的转化率。
质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定
实验六 质粒在大肠杆菌中 的转化和鉴定
一、质粒转化的功用
1. 为实验室获得大量进行基因克隆的质 粒。
2. 使携带有目的基因的重组质粒在大肠 杆菌中进行表达。
二、原理
热激法：大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2低渗溶液中， 细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于 细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促 进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生 长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在 被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在 选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
五、操作步骤 1、从-70℃冰箱中取100μl（或50 μL）
感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后 立即置冰上。
2、 加入2 μl质粒DNA溶液,轻轻摇匀, 冰上放置30分钟。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴 5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4、向管中加入1ml LB液体培养基 (不含抗生素),混匀后37℃振荡培养1小 时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质 粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂 布于含Amp的筛选平板上,正面向上放 置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培基中为
什么不加入抗生素？ 2.什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几
种类型？用于基因重组的主要用到哪种质粒？
一、质粒转化的功用
1. 为实验室获得大量进行基因克隆的质 粒。
2. 使携带有目的基因的重组质粒在大肠 杆菌中进行表达。
二、原理
热激法：大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2低渗溶液中， 细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于 细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促 进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生 长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在 被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在 选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
五、操作步骤 1、从-70℃冰箱中取100μl（或50 μL）
感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后 立即置冰上。
2、 加入2 μl质粒DNA溶液,轻轻摇匀, 冰上放置30分钟。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴 5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
4、向管中加入1ml LB液体培养基 (不含抗生素),混匀后37℃振荡培养1小 时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质 粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂 布于含Amp的筛选平板上,正面向上放 置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培基中为
什么不加入抗生素？ 2.什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几
种类型？用于基因重组的主要用到哪种质粒？
质粒转化大肠杆菌
质粒转化大肠杆菌的原理
质粒的结构与功能
质粒是一种裸露的、独立于细菌染色 体外并具有自我复制能力的双链环状 DNA分子。
质粒在细菌中发挥着重要的遗传调控 作用，可以促进细菌的进化与适应环 境。
质粒携带特定的基因，赋予细菌某些 表型特征，如抗性、代谢性、致病性 等。
大肠杆菌的遗传特性
大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴 性细菌，具有多种遗传特性，如
抗性、代谢性、致病性等。
大肠杆菌的染色体和质粒共同构 成其基因组，调控其生命活动和
适应性。
大肠杆菌的基因组相对较小，易 于进行遗传操作和基因工程研究
。
转化过程的分子机制
转化过程是指将外源DNA分子导 入受体细胞，并使其获得新的遗
传特性的过程。
在大肠杆菌中，转化过程主要依 赖于细胞表面的受体蛋白与外源 DNA分子的结合，以及DNA分
质粒转化反应
将转化后的细胞在合适的选择培 养基上培养，筛选出转化子。
转化细胞的筛选与鉴定
转化细胞的筛选
在选择培养基上，通过观察菌落的生 长情况，筛选出含有目的质粒的转化 子。
转化细胞的鉴定
通过PCR、酶切等分子生物学方法对 转化子进行鉴定，验证目的质粒是否 成功转化到大肠杆菌中。
04
转化效率的影响因素及优化策 略
转化子基因表达水平的检测
基因表达水平的定量分析
通过qPCR、Western blot等技术手段，对转化子中的目的基因表达水平进行定 量分析，了解转化子中目的基因的表达情况。
基因表达谱的比较
将转化子与未转化子的基因表达谱进行比较，找出差异表达的基因，分析转化对 基因表达的影响。
转化子稳定性的评估
转化子的稳定性检测
感受态细胞制备
质粒的结构与功能
质粒是一种裸露的、独立于细菌染色 体外并具有自我复制能力的双链环状 DNA分子。
质粒在细菌中发挥着重要的遗传调控 作用，可以促进细菌的进化与适应环 境。
质粒携带特定的基因，赋予细菌某些 表型特征，如抗性、代谢性、致病性 等。
大肠杆菌的遗传特性
大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴 性细菌，具有多种遗传特性，如
抗性、代谢性、致病性等。
大肠杆菌的染色体和质粒共同构 成其基因组，调控其生命活动和
适应性。
大肠杆菌的基因组相对较小，易 于进行遗传操作和基因工程研究
。
转化过程的分子机制
转化过程是指将外源DNA分子导 入受体细胞，并使其获得新的遗
传特性的过程。
在大肠杆菌中，转化过程主要依 赖于细胞表面的受体蛋白与外源 DNA分子的结合，以及DNA分
质粒转化反应
将转化后的细胞在合适的选择培 养基上培养，筛选出转化子。
转化细胞的筛选与鉴定
转化细胞的筛选
在选择培养基上，通过观察菌落的生 长情况，筛选出含有目的质粒的转化 子。
转化细胞的鉴定
通过PCR、酶切等分子生物学方法对 转化子进行鉴定，验证目的质粒是否 成功转化到大肠杆菌中。
04
转化效率的影响因素及优化策 略
转化子基因表达水平的检测
基因表达水平的定量分析
通过qPCR、Western blot等技术手段，对转化子中的目的基因表达水平进行定 量分析，了解转化子中目的基因的表达情况。
基因表达谱的比较
将转化子与未转化子的基因表达谱进行比较，找出差异表达的基因，分析转化对 基因表达的影响。
转化子稳定性的评估
转化子的稳定性检测
感受态细胞制备
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化ppt课件
• 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备 的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将 载体DNA分子导入受体细胞。
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以
满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
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21
感受态细胞(Competent cells)
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击 法， CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜 的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的 载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化（transformation）
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使 受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基 因工程等研究领域的基本实验技术。
2.抗生素使用错 策
用正确的抗生素
误
3.转化后温浴30min左
3.转化后立即涂 板忘记温浴
右，让抗性基因得 以表达
七、问题与讨论
1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质 量？
2.如阴性对照中长出菌，原因？
3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体 细胞？各有什么优缺点？
图1
图2
如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性 基因导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有 Amp的LB固体培养基上生长，如图1。如转化不 成功则Amp敏感的菌株和阴性对照不会在含有 Amp的LB固体培养基上生长，如图2。
• 克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生 素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、 四环素、链霉素等。
重组DNA转化 细菌过程示意图
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以
满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
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感受态细胞(Competent cells)
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击 法， CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜 的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的 载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化（transformation）
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使 受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基 因工程等研究领域的基本实验技术。
2.抗生素使用错 策
用正确的抗生素
误
3.转化后温浴30min左
3.转化后立即涂 板忘记温浴
右，让抗性基因得 以表达
七、问题与讨论
1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质 量？
2.如阴性对照中长出菌，原因？
3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体 细胞？各有什么优缺点？
图1
图2
如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性 基因导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有 Amp的LB固体培养基上生长，如图1。如转化不 成功则Amp敏感的菌株和阴性对照不会在含有 Amp的LB固体培养基上生长，如图2。
• 克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生 素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、 四环素、链霉素等。
重组DNA转化 细菌过程示意图
质粒转化大肠杆菌
实验步骤
1. 培养细胞：将大肠杆菌细胞在含有适当抗生素的培养基中培养至对数生长期。2. 准备电激装置：准备电激仪和相应的电激仪耳害。3. 转化质粒：将待转化的质粒加入到含有培养细胞的电击培养基中，将细胞和质粒混合均匀后放入电激仪中进行电击处理。4. 复苏细胞：将转化后的细胞在富含营养的LB培养基中复苏恢复生长。
实验步骤
1. 培养细胞：将大肠杆菌细胞在含有适当抗生素的培养基中培养至对数生长期。2. 转化质粒：将待转化的质粒加入到培养细胞中，并对细胞进行热激处理，一般为42℃、45秒。3. 复苏细胞：将转化后的细胞在富含营养的LB培养基中复苏恢复生长。
电激法
电激法是一种常用的质粒转化方法，其原理是利用脉冲电场使细菌细胞膜瞬间发生通透性改变，使质粒能够穿过细胞膜进入细胞。实验步骤
THANKS
03
总结
总结
质粒转化大肠杆菌是一种常用的基因传递方法，通过热激、电激或化学方法将外源质粒引入细菌细胞中。不同的转化方法在操作步骤和效果上有所差异，实验者可以根据具体需求选择适合的转化方法。参考文献：1. 清华大学生物技术教育中心.《生物技术实验方法及原理》.清华大学出版社，2008.
THE END
质粒转化大肠杆菌
CONTENTS
简介基本原理总结
01
简介
简介
质粒转化是指将外源质粒引入细菌细胞中的过程，是生物技术中常用的基因传递方法之一。大肠杆菌是转化实验中最常用的宿主细胞之一，其转化效果较好且操作简便。本章将介绍质粒转化大肠杆菌的基本原理、实验步骤和注意事项。
02
基本原理
本原理
质粒转化大肠杆菌的基本原理是通过热激、电激或化学方法使细菌细胞膜发生破裂，使外源质粒能够进入细胞内。质粒经过转化后可以在细菌中复制和表达，从而实现基因的传递。热激法电激法化学方法
1. 培养细胞：将大肠杆菌细胞在含有适当抗生素的培养基中培养至对数生长期。2. 准备电激装置：准备电激仪和相应的电激仪耳害。3. 转化质粒：将待转化的质粒加入到含有培养细胞的电击培养基中，将细胞和质粒混合均匀后放入电激仪中进行电击处理。4. 复苏细胞：将转化后的细胞在富含营养的LB培养基中复苏恢复生长。
实验步骤
1. 培养细胞：将大肠杆菌细胞在含有适当抗生素的培养基中培养至对数生长期。2. 转化质粒：将待转化的质粒加入到培养细胞中，并对细胞进行热激处理，一般为42℃、45秒。3. 复苏细胞：将转化后的细胞在富含营养的LB培养基中复苏恢复生长。
电激法
电激法是一种常用的质粒转化方法，其原理是利用脉冲电场使细菌细胞膜瞬间发生通透性改变，使质粒能够穿过细胞膜进入细胞。实验步骤
THANKS
03
总结
总结
质粒转化大肠杆菌是一种常用的基因传递方法，通过热激、电激或化学方法将外源质粒引入细菌细胞中。不同的转化方法在操作步骤和效果上有所差异，实验者可以根据具体需求选择适合的转化方法。参考文献：1. 清华大学生物技术教育中心.《生物技术实验方法及原理》.清华大学出版社，2008.
THE END
质粒转化大肠杆菌
CONTENTS
简介基本原理总结
01
简介
简介
质粒转化是指将外源质粒引入细菌细胞中的过程，是生物技术中常用的基因传递方法之一。大肠杆菌是转化实验中最常用的宿主细胞之一，其转化效果较好且操作简便。本章将介绍质粒转化大肠杆菌的基本原理、实验步骤和注意事项。
02
基本原理
本原理
质粒转化大肠杆菌的基本原理是通过热激、电激或化学方法使细菌细胞膜发生破裂，使外源质粒能够进入细胞内。质粒经过转化后可以在细菌中复制和表达，从而实现基因的传递。热激法电激法化学方法
实验二 质粒DNA转化大肠杆菌
实验二质粒DNA转化大肠杆菌一、实验目的掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法技术二、实验原理转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程，其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，经42℃短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物，将细菌放置在培养箱中保温一段时间，促使在转化过程中获得新的表型得到表达，然后将细菌培养物涂在含有Amp的选择培养基中。
三、实验仪器及药品仪器：超净工作台、恒温摇床、制冰机、恒温培养箱、-70℃冰箱、水浴锅材料：大肠杆菌JM109、pUC19质粒、离心管试剂：LB固体培养基、20mg/mL X-gal、20mg/mL IPTG四、实验内容1、取200μL新制备的感受态细胞，加入DNA 2 μL（50 ng）混匀，冰浴30min，同时用pUC19做两个对照。
1）受体菌对照：200μL感受态细胞+ 2 μL 无菌水2）质粒对照：200μL 0.1mol / L CaCl2溶液+ 2 μL 质粒DNA2、将管放在42℃水浴90s。
3、立即冰浴2 min。
4、每管中加入800μL 的LB液体培养基，培养45min~60min（140rpm）。
5、向两个转化平板中先加入40μL IPTG，再加入40μL X-gal，并用灭过菌的涂布棒将这两样药品涂满平板。
6、然后将适当体积（100μL）转化的感受态细胞涂匀平板。
7、倒置平皿37℃培养12~16 h，出现菌落。
五、实验结果各实验组观察并记录皿内菌落大的生长状况并进行结果分析。
六、思考题如何提高转化率？。
质粒转化大肠杆菌
对阳性克隆进行质粒 DNA提取和检测。
03
实验结果分析
阳性克隆的确认
筛选方法
通过在选择性培养基上培养转 化后的菌落，对可疑阳性克隆
进行初步筛选。
验证方法
对初步筛选出的阳性克隆进行菌落 PCR验证，确保阳性克隆中已成功 导入了外源DNA。
验证指标
通过观察PCR产物电泳图，判断阳 性克隆是否含有目的基因片段。
通过电转化仪进行电转化，将质粒DNA转入大肠杆菌 。
转化实验操作
调整电转化参数至合适值。 将转化后的细胞接种到筛选阳性克隆的培养皿中。
将制备好的感受态细胞与质粒DNA混合，进行电转化实 验。
通过离心和热激法将细胞恢复到正常状态。
筛选阳性克隆
通过菌落PCR或酶切 电泳等方法筛选阳性 克隆。
对质粒进行测序验证 ，确认插入片段的正 确性。
增加离心和洗涤步骤
在制备感受态细胞时，加入离心和洗涤步骤可以去除多余的 钙离子和其他杂质，提高感受态细胞的质量和转化效率。
使用更高效的感受态细胞
选择不同品系的感受态细胞
不同品系的感受态细胞具有不同的转化效率。因此，可以通过试验比较不同品系的感受态细胞的转化 效率，选择更高效的感受态细胞。
通过培养条件优化感受态细胞
通过调整培养基的成分、温度、时间等参数，可以优化感受态细胞的生长和状态，提高其转化效率。
THANKS
感谢观看
在生物安全柜中操作，确保实验过程的安全性。
实验操作规范
使用无菌技术，确保实验过程 的无菌性。
将大肠杆菌和质粒分别转化到 合适的培养基中，并进行培养 。
在转化过程中，需要使用感受 态细胞，以确保质粒能够成功 导入大肠杆菌中。
问题与解决策略
质粒转化大肠杆菌
实验结果
本次实验中，我们采用了优化的转化条件，并获得了较高的转化效率，具体数据见下表。
阳性克隆筛选与鉴定
阳性克隆定义
筛选方法
鉴定方法
实验结果
阳性克隆是指成功导入目标质 粒并表达出目标蛋白的大肠杆 菌细胞。
常用的筛选方法包括抗性筛选 、颜色筛选和PCR筛选等。本 次实验采用了抗性筛选和PCR 筛选相结合的方法。
对筛选出的阳性克隆进行进一 步鉴定，通常采用PCR扩增、 测序和蛋白表达等方法。本次 实验中对阳性克隆进行了PCR 扩增和测序鉴定。
经过筛选和鉴定，我们成功获 得了多个阳性克隆，具体数据 见下表。
数据分析与解读
数据统计
对实验数据进行统计和分析，包括转化效率、阳性克隆数、目标蛋白表达量等 指标。
改进方向
将菌液冰浴30分钟，使细胞停止生长并处于感受态。
实验步骤
将菌液分装到预冷的离心管中， 离心收集菌体，弃去上清液。
加入预冷的转化缓冲液（如 CaCl2溶液），轻轻悬浮菌体，
冰浴30分钟。
再次离心收集菌体，弃去上清液 ，加入适量的预冷转化缓冲液， 轻轻悬浮菌体，即为感受态细胞
。
实验步骤
01
2. 质粒转化
01
在特定条件下，如钙离子处理，质粒DNA能被导入大肠杆菌细
胞。
质粒DNA的复制与表达
02
进入大肠杆菌细胞后，质粒DNA利用宿主细胞的复制系统进行
复制，并表达其携带的基因。
质粒与宿主细胞的相互作用
03
质粒上的基因可能影响宿主细胞的表型，同时宿主细胞的基因
组也可能影响质粒的复制和稳定性。
03
实验材料与方法
提高转化效率的技巧
优化质粒与感受 态细胞的比例
本次实验中，我们采用了优化的转化条件，并获得了较高的转化效率，具体数据见下表。
阳性克隆筛选与鉴定
阳性克隆定义
筛选方法
鉴定方法
实验结果
阳性克隆是指成功导入目标质 粒并表达出目标蛋白的大肠杆 菌细胞。
常用的筛选方法包括抗性筛选 、颜色筛选和PCR筛选等。本 次实验采用了抗性筛选和PCR 筛选相结合的方法。
对筛选出的阳性克隆进行进一 步鉴定，通常采用PCR扩增、 测序和蛋白表达等方法。本次 实验中对阳性克隆进行了PCR 扩增和测序鉴定。
经过筛选和鉴定，我们成功获 得了多个阳性克隆，具体数据 见下表。
数据分析与解读
数据统计
对实验数据进行统计和分析，包括转化效率、阳性克隆数、目标蛋白表达量等 指标。
改进方向
将菌液冰浴30分钟，使细胞停止生长并处于感受态。
实验步骤
将菌液分装到预冷的离心管中， 离心收集菌体，弃去上清液。
加入预冷的转化缓冲液（如 CaCl2溶液），轻轻悬浮菌体，
冰浴30分钟。
再次离心收集菌体，弃去上清液 ，加入适量的预冷转化缓冲液， 轻轻悬浮菌体，即为感受态细胞
。
实验步骤
01
2. 质粒转化
01
在特定条件下，如钙离子处理，质粒DNA能被导入大肠杆菌细
胞。
质粒DNA的复制与表达
02
进入大肠杆菌细胞后，质粒DNA利用宿主细胞的复制系统进行
复制，并表达其携带的基因。
质粒与宿主细胞的相互作用
03
质粒上的基因可能影响宿主细胞的表型，同时宿主细胞的基因
组也可能影响质粒的复制和稳定性。
03
实验材料与方法
提高转化效率的技巧
优化质粒与感受 态细胞的比例
实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌课件
3
转化(Transformation)
是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的 一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的 基本实验技术。
0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在0℃低温处理大肠杆菌细 胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击 （如42 ℃ ）下，细胞可吸收外源DNA。
3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培 养2-3小时至OD600 ＝0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键 。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外 援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）
实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌
14
（二）、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
2. 热击：42℃水浴中热击60秒（注：精确计算时 间，热击过长将对细胞造成伤害）,热击后马上 置于冰上冷2-5分钟。
3. 复苏：向每管中加入800μl LB液体培养基(注：
不含Amp),混匀后在37℃150rpm轻摇培养1小时，
使细菌恢复思正考：常热生击长后的状细态胞已，吸并入表外源达质质粒粒，如编本码实验的中的
抗生素抗性p什E基么T3复因2a苏(，A时该m用质p的粒rL)可B。培赋养予液宿不主加氨A苄m青p霉？素抗性。但是为
实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌
16
（四）涂布平板筛选转化质粒
1. 将管中培养液摇匀后取100μl 均匀涂布于含Amp的筛选平 板上。 （注：将培养液摇匀后涂布。）
2. 正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培 养皿，37℃温箱中培养过夜，次日观察实验结果。
度要均匀）,冰上放置备用。
质粒转化大肠杆菌ppt
掌握基因克隆的基本步骤
01
基因克隆是将目的基因导入受体细胞，并在受体细胞内进行扩增、表达和纯化 的过程。
02
质粒转化是基因克隆过程中的一个重要环节，通过将目的基因与质粒进行连接 ，将连接产物导入受体细胞，实现目的基因的复制和表达。
03
基因克隆的基本步骤包括：目的基因的获取、质粒载体的选择与构建、目的基 因与载体的连接、感受态细胞的制备与转化、阳性克隆的筛选与鉴定等。
3
在大肠杆菌中，质粒转化主要通过三种途径进 行：接合、电穿孔和磷酸钙沉淀法。
熟悉分子生物学实验技术
质粒转化是大肠杆菌分子生物学实验中的重要技术之一，其 涉及到细菌培养、基因扩增、酶切、连接、纯化等多个步骤 。
在实验过程中，需要使用特定的试剂和设备，如限制性内切 酶、T4DNA连接酶、PCR仪、电泳仪等，以实现对DNA分子 的精确操作。
质粒转化大肠杆菌
目 录
• 实验目的 • 质粒转化大肠杆菌的原理 • 实验材料及设备 • 实验步骤及操作流程 • 实验结果与分析 • 结论与讨论
01
实验目的
了解质粒转化大肠杆菌的实验原理
1
质粒是一种裸露的、容易复制的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子。
2
质粒转化是指将一种细菌的DNA分子，通过人 工导入的方法转移到另一种细菌体内，使受体 细菌获得新的表型特征。
02
质粒转化大肠杆菌的原理
质粒的基本结构
质粒是一种存在于细胞质中的小型环状DNA分子，具有自 主复制能力，可随细胞分裂而传给后代。
质粒编码次要代谢途径中的多种蛋白质，以及一些与特定 表型有关的基因。
质粒的复制
质粒DNA复制是半自主复制，即质粒的复制受宿主细胞代谢 和调节系统的控制。
质粒转化大肠杆菌
稳定期
03
鉴定
采用电泳、紫外分光光度计等方法对纯化的质粒进行鉴定，确保其质量和浓度达到要求。
质粒的纯化和鉴定
01
提取质粒
从细胞中提取出质粒DNA，常用的方法有碱裂解法和煮沸法等。
02
纯化
通过一系列步骤将质粒中的蛋白质和其他杂质去除，得到纯净的质粒。
将大肠杆菌细胞在冰上放置一段时间，然后进行离心处理，去掉上清液，留下沉淀的感受态细胞。
实验室安全
质粒转化涉及细菌操作，需要注意生物安全。在处理细菌时，应遵循正确的生物安全程序，包括使用适当的个人防护装备和按照规定进行操作。
生物安全
安全注意事项
实验操作注意事项
试剂准备
正确准备实验所需的各种试剂，包括缓冲液、培养基和抗生素等，确保试剂的质量和有效性。
实验建议：为了提高实验的效率和准确性，建议在实验前进行预实验，以验证实验条件和操作步骤的正确性。同时，建议在实验过程中做好详细记录，以便于分析和总结实验结果。
克隆筛选
转化大肠杆菌
质粒转化大肠杆菌的结果分析
04
转化效率定义
转化效率是指目的基因整合到受体细胞染色体DNA中的比例，以及每个受体细胞中目的基因的拷贝数。
转化效率检测方法
通过southern印迹杂交、荧光定量PCR和菌落计数等方法进行转化效率的检测。
转化效率的检测
鉴定方法
将转化子进行DNA测序以确定目的基因序列是否正确，同时进行表型特征鉴定，例如抗生素抗性、插入失活等。
《质粒转化大肠杆菌》
xx年xx月xx日
目录
contents
质粒转化实验简介质粒转化前的准备质粒转化大肠杆菌的步骤质粒转化大肠杆菌的结果分析实验注意事项与建议参考文献
03
鉴定
采用电泳、紫外分光光度计等方法对纯化的质粒进行鉴定，确保其质量和浓度达到要求。
质粒的纯化和鉴定
01
提取质粒
从细胞中提取出质粒DNA，常用的方法有碱裂解法和煮沸法等。
02
纯化
通过一系列步骤将质粒中的蛋白质和其他杂质去除，得到纯净的质粒。
将大肠杆菌细胞在冰上放置一段时间，然后进行离心处理，去掉上清液，留下沉淀的感受态细胞。
实验室安全
质粒转化涉及细菌操作，需要注意生物安全。在处理细菌时，应遵循正确的生物安全程序，包括使用适当的个人防护装备和按照规定进行操作。
生物安全
安全注意事项
实验操作注意事项
试剂准备
正确准备实验所需的各种试剂，包括缓冲液、培养基和抗生素等，确保试剂的质量和有效性。
实验建议：为了提高实验的效率和准确性，建议在实验前进行预实验，以验证实验条件和操作步骤的正确性。同时，建议在实验过程中做好详细记录，以便于分析和总结实验结果。
克隆筛选
转化大肠杆菌
质粒转化大肠杆菌的结果分析
04
转化效率定义
转化效率是指目的基因整合到受体细胞染色体DNA中的比例，以及每个受体细胞中目的基因的拷贝数。
转化效率检测方法
通过southern印迹杂交、荧光定量PCR和菌落计数等方法进行转化效率的检测。
转化效率的检测
鉴定方法
将转化子进行DNA测序以确定目的基因序列是否正确，同时进行表型特征鉴定，例如抗生素抗性、插入失活等。
《质粒转化大肠杆菌》
xx年xx月xx日
目录
contents
质粒转化实验简介质粒转化前的准备质粒转化大肠杆菌的步骤质粒转化大肠杆菌的结果分析实验注意事项与建议参考文献
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1. 无菌落，失。 或培养条件不充 分。
2. 菌落布满如苔 样，失败，可能 是抗生素浓度不 够或失效。
3. 菌落布满，浓 度太高，失败。
4. 出现菌落，符 合要求。
结果分析及处理办法
1、有菌落，说明转化成功，但有两种可能性 。其一，质粒自身环化；其二，重组成功。 2、无菌落，说明实验1，2中，至少有一个实 验没有成功。 3、菌落布满如苔样，可能是抗生素浓度不够 或失效。 4、出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致。
6．在制备感受态大肠杆菌及转化过程中，尽量不使用玻 璃器皿，以免降低转化效率；
7．使用新鲜制备的感受态大肠杆菌，有利于提高转化效 率；
8．在整个实验过程中，要注意冰上操作。
2. 菌落布满如苔 样，失败，可能 是抗生素浓度不 够或失效。
3. 菌落布满，浓 度太高，失败。
4. 出现菌落，符 合要求。
结果分析及处理办法
1、有菌落，说明转化成功，但有两种可能性 。其一，质粒自身环化；其二，重组成功。 2、无菌落，说明实验1，2中，至少有一个实 验没有成功。 3、菌落布满如苔样，可能是抗生素浓度不够 或失效。 4、出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致。
6．在制备感受态大肠杆菌及转化过程中，尽量不使用玻 璃器皿，以免降低转化效率；
7．使用新鲜制备的感受态大肠杆菌，有利于提高转化效 率；
8．在整个实验过程中，要注意冰上操作。