细胞工程实验课题

盐城师范学院海洋与生物工程学院

——细胞工程实验微课题设计

细胞工程微课题实验方案

不同浓度磷元素对鱼肝细胞的活性

的影响

专业：生物技术

班级：技术14（1）班

成员：14243148杨永周14243150朱剑秋14243146 王宁14243138 胡峰

14243140 李强14243136 陈一帆

14243137 贡森森

日期：2016年11月

磷元素对鱼肝细胞活性的影响

一、实验目的

随着农业的不断高速发展，我国农村为了更高的产量施大量的氮磷钾肥，虽然极大提高了农作物的存活率，但是肥料过剩所产生的水质问题也日趋显著。在这些问题中尤为突出的就是磷元素对水质的影响，调查发现，磷元素过多会使水富营养化从而产生水华破坏水中鱼类的生存环境导致大量鱼类死亡，所以我们今天想研究磷元素过多对鱼的细胞有什么影响，从而警醒人们关注水质安全不要过多施肥。

二、实验原理

草鱼是我国目前养殖产量最大的淡水鱼类之一，在人工养殖过程中，由于水质、饲料等因素易出现以脂肪性肝病为特征的营养性疾病。肝脏作为鱼体最大的解毒和营养代谢器官，在营养物质的消化吸收和保障鱼体健康方面起着重要作用。体外肝细胞分离和原代培养是研究肝细胞功能的有效方法，培养体系中的肝细胞可以很好的模拟体内肝脏的生理环境，用不同浓度的的磷化合物对其进行耐性实验，测试其生物活性。

三、实验器材

（1）设备

培养箱，超净工作台，倒置显微镜，高压蒸汽灭菌锅，低速离心机，冰箱，分析天平，细胞培养瓶8个，移液器，青霉素空瓶6个，血球计数板等。

（2）试剂

D-Hanks 液、PBS缓冲液、胰蛋白酶、牛跟腱胶原、10%胎牛血清、牛胰岛素、100 IU / mL 青霉素、100 μg / mL 链霉素，DMEM培养基，红细胞裂解液、细胞活性鉴别染液台盼蓝染色剂，不同浓度的磷酸溶液。

1：D-Hank’s液的配制称取KCl:0.1g，KH2PO4:0.03g，NaCl:4.0g，NaHCO3:0.175g，Na2HPO4`12H2O:0.04g，溶于双蒸水，混合均匀，定容至500ml，调节pH值7.0-7.4，高压蒸汽灭菌，4℃保存。

2：DMEM培养基的配制：血清的灭活：常用小牛血清，新鲜血清要在56℃水浴灭活30min，再经抽滤分装，即可加入培养基中；吸取配制好的青霉素、链霉素加入到50mlDMEM培养基中（不含小牛血清及双抗），再吸取5ml灭活的小牛血清和2ml 双抗加入培养基中混匀，小牛血清的含量为10%,置于4℃冰箱待用。

4：配置磷酸溶液母液，实验时候稀释成所需的浓度。

实验动物：市场售卖的鱼

四实验内容

（1）实验材料处理

1 用适当的方法促死实验所用的两条鱼，将刚死的的鱼用75%酒精浸泡30s，使其消毒，然后转移到超净工作台，倒T解剖，取出鱼肝，剥干净后用配置好的D-Hanks冲洗，然后用消毒后的剪刀剪成肉糜。

剪成肉糜之后转移到灭菌的离心管内酶解消化（加入3ml 0.25%的胰蛋白酶），消化好后在37℃水浴锅内预热，20℃水浴酶解1min后摇匀。

摇匀后在离心机上500r离心5min，弃上清后5000r离心5min之后加入500微升完全培养基，均匀加入到消毒的五个细胞培养瓶培养48h。

2 培养48h后加入不同浓度的磷酸溶液

我国对于水中p含量有以下的标准

一类(以P计)小于0.02mg/l(湖,库0.01)二类(以P计)小于0.1mg/l(湖,库0.025)

三类(以P计)小于0.2mg/l(湖,库0.05)四类(以P计)小于0.3mg/l(湖,库0.1)

五类(以P计)小于0.4mg/l(湖,库0.2)

实验可选择0.2mg/l，0.8mg/l，1.6mg/l，2mg/l的浓度梯度加入培养基培养24h后观察，与培养之前先观察未胁迫培养之前的细胞拍照做对比（一定设置对照组）。（2）肝细胞活力的测定

细胞悬液与细胞活性鉴别染液台盼蓝染色剂按1∶9 体积比混合，4 min 后于血球计数板上计数，并在显微镜下观察: 活细胞圆形透明，死细胞染成蓝色，用活细胞占计数细胞中的百分比表示细胞活力。

计算公式: 细胞存活百分率= 4大格活细胞数/ ( 4大格活细胞数+ 死细胞数) ×100 % 。

预期效果：在高浓度的磷酸溶液培养后，细胞形态皱缩死亡，数目减少，得出结论高浓度的磷酸对鱼肝细胞活力有抑制作用。

（3）MTT法测定不同时间鱼肝细胞A值

1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞（细胞浓度的问题见后面的注意事项）接种到96孔板，每孔体积200ul.

2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)10ul.

继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。

4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线

草鱼肝细胞增殖能力随时间延长呈现一定规律的变化。A值总体上呈现先增长后趋于稳定直至降低的趋势。24～48 h 阶段A值有显著性增加( P＜0.05)，72～120 h 期间A值相对稳定，144h时 A 值显著性降低(P＜ 0.05 )。

五实验结果

观察时发现细胞密度过低，未能出现预期的细胞形态，查询资料得知此现象为细胞培养出现大量死亡，通过仔细分析实验失败的原因有以下几点：

1 胰蛋白酶配制时染菌

2 操作人员在操作时不注意无菌操作（比如在超净工作台操作时将细胞取出工作台）

3 培养基配制时染菌受到污染