流式细胞术临床应用

流式细胞术得临床应用

一、在肿瘤学中得应用

这就是FCM在临床医学中应用最早得一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞得DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA与RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到得与DNA结合得PI得荧光强度直接反映了细胞内DNA 含量得多少。由于细胞周期各时相得DNA含量不同，通常正常细胞得G1 / GO 期具有二倍体细胞得DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞得DNA含量((4 N)，而S期得DNA含量介于二倍体与四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期与G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相得百分率，DNA含量直接代表细胞得倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。

1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断

人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变得漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常得体细胞均具有比较稳定得DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能得癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量得异常改变，FCM可精确定量DNA含量得改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中得一个有价值得标志，能对癌前病变得性质及发展趋势作出估价，有助于癌变得早期诊断。有资料证实，癌前病变得癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度得加重，DNA非整倍体出现率增高，这就是癌变得一个重要标志。

2、在肿瘤得诊断、预后判断与治疗中得作用

FCM在肿瘤诊断中得重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰得存在可为肿瘤诊断提供有力得依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后得判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变得复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤得预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图得变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要得意义。临床医师可以根据细胞周期各时相得分布情况，依据化疗药物对细胞动力学得干扰理论，设计最佳得治疗方案，从DNA直方图直接地瞧到瘤细胞得杀伤变化，及时选用有效得药物，对瘤细胞达到最大得杀伤效果。

3、FCM在细胞凋亡与多药耐药基因得研究中得作用

研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡得早期阶段，胞浆膜磷脂得不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异得Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不就是细胞凋亡特有得，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡得早期细胞膜就是完整得，而细胞坏死时细胞膜得完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整得活细胞与早期凋亡细胞就是拒染得，而对膜完整性被破坏得晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞与坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死与

凋亡晚期细胞可被Annexirr V与PI或7- AAD同时染色。多药耐药就是肿瘤病人化疗失败得主要原因，FCM对多药耐药基因(MDR-1、P170等)与凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达得测定，可为临床治疗效果分析提供有力依据。

二、在临床细胞免疫中得作用

FCM提供了一种简捷地监测细胞亚群得方法。即通过荧光抗原与抗体检测技术对淋巴细胞膜表面分化抗原(CD分子)、细胞分类与各亚群进行分析，并计算出淋巴细胞各亚群得百分比，从而对人体细胞免疫状态进行评估。在某些病毒性疾病得感染血液病、原发性与继发性免疫缺陷病、肿瘤得疗效观察与预后判断以及器官移植得监测上起着重要得指导作用。

如正常人群淋巴细胞CD3+CD4+/CD3+CD8+比值大约为2∶1，但在人体细胞免疫力低下时可出现比例倒置。用FCM还可以监测肾移植后病人得肾排斥反应，如果CD3+CD4+/CD3+CD8+比例倒置，病人预后良好，较少发生肾排异现象；反之排异危险性增加。同样此种测定技术也用于爱滋病得诊断与治疗中。

白细胞表面分化抗原得检测：

CD3+：T淋巴细胞；CD45RA：未受刺激（Naive）T淋巴细胞；CD45RO：记忆T淋巴细胞

CD3-CD19+：B淋巴细胞

CD3-CD16+56+：NK细胞

【NK细胞表达众多表面分子，如CD56、CD16、CD57、CD161等，但这些表面标志都不就是NK细胞所特有得，只具有相对特异性。通常将CD56+、CD16+、CD3-、TCR-、BCR-得淋巴样细胞认为就是NK细胞。以CD56+CD16+，CD56+CD16-与CD56-CD16+为标志将NK细胞分为3个亚群，发现CD56就是NK细胞分化得特异性标志，而CD16得表达量与NK细胞得杀伤活性密切相关。在上述研究基础上许多学者主张以CD56得表达密度不同，将NK细胞分为CD56bright与CD56dim两群、CD56brightNK细胞高表达CD56, 低表达CD16, KIR(killer cell immunoglobulin-like receptors, KIR)；表达高亲与力得IL-2 受体。而CD56dim NK细胞高表达CD16，低表达CD56，仅表达中亲与力得IL-2受体。CD56bright NK细胞在IL-2得作用下表现出较强得增殖作用，而CD56dim NK 细胞几乎不分泌细胞因子，且IL-2不能促其增殖。CD56dim NK细胞表现出较强得杀伤活性，而CD56bright NK细胞杀伤活性较低且表达一些末成熟标志，可以认为CD56bright NK细胞就是未成熟得NK细胞，而CD56dim及NK细胞则相对较成熟，即NK细胞发育可能经历CD56bright NK细胞到CD56dim NK细胞这样一个过程。】

CD64：单核、巨噬细胞

CD1a、CD83：树突状细胞

CD3+CD4+CD8-：T辅助/诱导淋巴细胞标记（Th/Ti）；CD3+CD4+CD29+：T 辅助

淋巴细胞诱导亚群标记，辅助B淋巴细胞产生抗体与诱导细

胞介导得淋巴细胞溶解作用；CD3+CD4+CD45RA+：T抑制淋巴细

胞诱导亚群，诱导Th得活化与辅助其功能。T辅助细胞还可

分成Th1、Th2两个亚群，同时标记细胞内细胞因子IFN-γ

与IL-4，可区分Th1细胞（CD4+/ IFN-γ+）与Th2细胞

（CD4+/ IL-4+）。