膜片钳技术及其应用实例
膜片钳实验与技术
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单击输入目录标题 膜片钳实验原理 膜片钳实验操作流程 膜片钳实验数据分析 膜片钳实验的应用实例
膜片钳实验的未来发展与挑战
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膜片钳实验原理
膜片钳技术的基本原理
膜片钳实验原理：通过玻璃微电极接触细胞膜，记录单一离子通道活动的 电位变化，从而研究细胞膜离子通道的特性。
膜片钳实验操作步骤
准备实验器材：包括膜片钳 放大器、微操纵器、微电极、
细胞夹持器等
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细胞贴片稳定：等待细胞贴 片稳定后，进行下一步操作
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开启膜片钳放大器：开启放 大器，调节放大器参数，确 保记录到有效的膜电流信号
数据记录：记录膜电流信号， 进行分析和处理
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新型膜片钳技术的研发，提高实验效率和准确性 应用人工智能技术，实现自动化数据分析与处理 结合其他技术手段，拓展膜片钳技术的应用领域 持续优化膜片钳设备，降低实验成本，提高普及率
膜片钳实验在多学科交叉中的应用前景
神经科学领域：研究神经元电活动与行为之间的联系 生理学领域：研究生物体的生理功能和机制 药理学领域：研究药物对细胞膜通道的影响和作用机制 生物医学工程领域：开发新型膜片钳技术，提高实验的灵敏度和特异性
膜片钳技术的特点：高灵敏度、高分辨率和高时间分辨率，能够记录单个 离子通道的活动。
膜片钳技术的应用范围：研究细胞膜离子通道的生理功能、药理作用和药 物作用机制等。
膜片钳实验的影响因素：电极内液的成分、温度、细胞内外的离子浓度和 pH值等。
膜片钳实验的应用范围
神经科学：研究神经细胞的电生理特性 药理学：药物对膜通道的影响 生理学：研究生物膜的离子通道功能 病理学：研究疾病状态下膜通道的异常变化
细胞生物学的研究技术
单细胞凝胶电泳技术的操作步骤
1.制备第一层胶：100ml 0.8％正常熔点胶，加盖盖玻片，4℃固化10min 2.制备第二层胶：轻轻地去除盖玻片，在第一层胶上滴加75ul含1×10000 个细胞的0.6％低熔点胶（cell与凝胶比例为1：5），加盖盖玻片，4℃固 化10min； 3.裂解：去掉盖玻片，将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内（临用前加10％ DMAO，1％Triton X-100），4℃裂解1h； 4.取出玻片，用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入pH13的电 泳缓冲液（没过玻片2-3min），放置20min（黑闭）。 5.电泳：电压20V，300mA，30min 6.取出玻片，用PBS或Tris.Cl，pH7.5漂洗3次，每次3min； 7.染色：胶上滴加3ulEB，加盖盖玻片，24h检测。或者4℃，潮湿，闭光 的条件下保有胶片，观察时再染色，镜检。
光镜免疫金银细胞化学 原理示意图
பைடு நூலகம்
（一）水解酶 水解酶可分为五类即磷酸酶类、脂酶类、芳香基硫酸酯酶类、 糖苷酶类以及作用于肽键酶类。水解酶是催化水解的酶类，在超微结构水 平上显示酶的细胞化学方法都是以孵育阶段为中心，孵育液中一般都有酶 的反应底物和捕捉剂，反应的基本原理可分为两个步骤：1底物经过酶的 分解形成初级反应产物；2 初级反应产物和相应的捕捉剂形成一种不溶性 的化合物称为最终反应产物，这些最终反应产物是一些不溶性重金属沉淀 物（如铅、铜、钡等），在电镜下容易被检出。一般来说这些沉淀物在细 胞的位置就代表了酶促反应的位置。（二）氧化还原酶 氧化还原酶可分为 （ 氧化酶和脱氢酶两种。在氧化酶细胞化学反应中含有两个即分开又紧密联 系的底物，一个是生理底物如氧或过氧化氢；另一个是捕捉底物，通常是 四盐酸3，3’二氨基联苯胺（DAB）。DAB很容易氧化，经过一系列的化学 变化生成强嗜锇性的聚合物，在经锇酸固定就形成了锇黑。脱氢酶常用在 捕捉剂为铁氰化物，它在酶的作用下被还原为亚铁氰化物，在铜离子的存 在下进一步形成高度不溶的亚铁氰化铜沉淀。 。
patch clamp膜片钳技术的原理和应用(超全的哦)
第二部分
一：应用学科
膜片钳技术的应用
膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规 方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且直 接或间接为临床医学研究服务， 目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科 学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物 细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。 随着全自动膜片钳技术（Automatic patch clamp technology）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高 通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命 力。
5.对药物作用机制的研 在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位（膜内 或膜外）施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可 能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物 生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的 领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理 的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法 观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大 脑皮层神经元L-型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺 血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通 道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型 钙通道有阻滞作用。
膜片钳技术及其应用
膜片钳技术可以用于研究细胞信号转导过程中离子通道和受体的变 化，了解信号转导的机制。
细胞功能调控的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞功能调控的机制，例如细胞兴奋性的 调节和细胞内离子浓度的变化。
04 膜片钳技术的优势与局限 性
膜片钳技术的优势
高灵敏度
细胞无损
膜片钳技术具有高灵敏度，能够检测单 个离子通道的活动，从而提供关于细胞 膜电位和离子通道功能的重要信息。
膜片钳技术可以在保持细胞完整性的 情况下进行实验，不会对细胞造成严 重损伤或干扰细胞的正常功能。
实时监测
膜片钳技术可以对细胞膜电位进行实时 监测，从而了解离子通道的动态变化， 有助于深入理解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术的局限性
1 2 3
实验条件要求高
膜片钳技术需要高精度的实验设备和条件，包括 低温、低噪声和低阻抗等，这增加了实验的难度 和成本。
03
04
05
膜片钳放大器
微操纵器
细胞培养皿或显 微镜载玻片
电极溶液
细胞内和细胞外 灌流液
用于放大细胞膜电信号， 提高信号的检测灵敏度。
用于精确控制电极的移动 ，以便在细胞膜上定位和 进行膜片钳实验。
用于培养和固定细胞，以 便进行膜片钳实验。
用于填充电极，以保持电 极的湿润和导电性。
用于维持细胞内外环境的 稳定，并排除干扰实验的 物质。
03
在单细胞水平上研究细胞信号转导和离子通道功能，深入了 解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术与其他技术的联合应用
结合光学成像技术，利用膜片钳技术对神经元电生理特性进行同时监测和成像，实现多参数的同时测 量。
与基因编辑技术结合，利用膜片钳技术对特定基因表达的离子通道进行功能研究，深入了解基因与离子 通道的关系。
膜片钳技术及其应用2010
机械系统:由
于膜片钳实验 是一个微电和 微操作实验， 任何微小的震 动都会影响电 极和细胞的封 接，导致实验 的失败，因此 一台高质量的 防震台是必须 的。
辅助系统：膜片钳实验系统是一个综合性
的集成系统，除了上面提到的几大系统外， 相关的辅助系统也是必不可少的，辅助系统 的设备好坏，很大程度上左右着实验能否顺 利开展，有的实验室主要系统配置十分主流， 而辅助系统则凑合，这将极大的影响实验， 所谓细节决定成败，用在膜片钳实验中是十 分贴切的。
(1).电压钳模式：在钳制细胞膜
电位的基础上改变膜电位，记录离 子通道电流的变化，记录的是诸如 通道电流；EPSC;IPSC等电流信号。 是膜片钳的基本工作模式.
(2).电流钳模式:向细胞内注入刺
激电流，记录膜电位对刺激电流的 反应。记录的是诸如动作电位， EPSP;IPSP等电压信号。
膜片钳的几种记录模式极其形成：
K+电流
Na+电流
cole
电压钳的原理：用两根尖端直径
0.5um的电极插入细胞内，一根电极用作 记录电极以记录跨膜电位，用另一根电极 作为电流注入电极，以固定膜电位。从而 实现固定膜电位的同时记录膜电流。电位 记录电极引导的膜电位（Vm）输入电压钳 放大器的负输入端，而人为控制的指令电 位（Vc）输入正输入端，放大器的正负输 入端子等电位，向正输入端子施加指令电 位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等 电位，即Vm=Vc,从而达到电位钳制的目的， 并可维持一定的时间。Vc的不同变化将导 致Vm的变化，从而引起细胞膜上电压依赖 性离子通道的开放，通道开放引起的离子 流反过来又引起Vm的变化，致使Vm≠Vc, Vc与Vm的任何差值都会导致放大器有电压 输出，将相反极性的电流注入细胞，以使 Vc=Vm，注入电流的大小与跨膜离子流相 等，但方向相反。因而注入的电流被认为 是标本兴奋时的跨膜电流值（通道电流）。
膜片钳在生命化学中的应用
Ａｂｓ ｒ ｃ Ａ ｓ ａｎ ａ ａ ｅ ｅ ｔ ｏｐｈｙ ｉ ｏ ｃ ｌｔ ｃ ｔａ ｔ ｄｖ ｎｃ ｄ ｅｌ ｃ ｒ ｓ ｏｌ ｇｉ ａ ｅ ｈｎｉ ｅ，ｔ ｔ ｈ— ｌ ｑｕ ｈｅ ｐａ ｃ ｃ ａｍｐ ｔ ｃ ｅ ｈｎｉ ｅ ａｓ ｅ ｏｍｅ ｏｎｅ ｑｕ ｈ ｂ ｃ ｏ ｈｅ ｍ ｏｓ ｉ ｐ ｔ ｍｅｔ ｏｄｓ ｎ ｔ ｅ ｅ ｒ ｈ ｆｅ ｄ ｏｆ ｌｆ ｃ ｅ ｅ ． Ｉ ｉ ｍｏｒ ｆｔ ｔ ｍ ｏｒ ａｎｔ ｈ ｉ ｈｅ ｒ ｓ ａ ｃ ｉ ｌ ｉｅ ｓ ｉ ｎｃ ｓ ｔ ｓ ｅ ｐｏｗｅ ｆ ｗｈｅ ｏ ｂｉ ｎｇ ｒ ｕｌ ｎ ｃ ｍ ｎｉ ｗｉｈ Ｏｔ ｒ ｔ ｃ ｔ ｈｅ ｅ ｈｎｉ ｕｅ ｑ ｓ，ｓ ｈ ａ ｈｅ ｆ ａ一 ｉｒ ｆ ｕ ｏｍ ｅ ｒ （ ｏ ｅ ｓ ｉ ｇ ｔ ｏｎ ｅ ｒ ｔｏ ｆ Ｃａ 。 ｎｄ ｕｃ ｓ ｔ ｕｒ ２ ｍ ｃ ｏ ｌ ｏｒ ｔ ｙ ｆ ｒ ｍ ａ ｕｒ ｎ ｈｅ ｃ ｃ ｎｔ ａ ｉ ｎ ｏ ‘）ａ ｓ ｎ ｅ— ｅ ｌ ｅ ｅｒ ｅ ｒ ｎｓ ｒｐｔｏｎ ｏｆ ｉ ｇｌ ｃ ｌ ｒ ｖ ｓ ｔ ａ ｃ ｉ ｉ ＲＮＡ ｆ ｌ ｅ ｂｙ ｈ ｐｏｌ ｏｌｏｗ ｄ ｔ ｅ ｙｍｅｒ ｓ ｃ ａｉ ｒ ａ ｔｏ （ ａ ｅ ｈ ｎ ｅ ｃ ｉ ｎ ＲＴ — ＰＣＲ ） Ｉ ｔ ｓ ． ｎ ｈｉ
维普资讯
第 １ 卷 第 ４ 期 ４
化 学 进
展
Ｖ ｏ１ ４ Ｎ ｏ．４ ．１
２０ ０ ２年 ７月
ＰＲ Ｏ Ｇ Ｒ Ｅ ＳＳ Ｉ ＣＨ ＥＭ Ｉ Ｒ Ｙ Ｎ ＳＴ
Ｊｌ ｕ ｙ，２ ０ ０ ２
膜 片钳在生 命化学 中的应 用 ＊
应 用 更加 广 泛 。 本 文 简 要 叙 述 了膜 片 钳 的 基 本 原 理 、 用 技 术 及 其 在 生 命 化 学 中 的 应 用 。 常
膜片钳技术及应用
制备玻璃微电极
拉制微电极 材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。 要求：玻璃毛胚外径1.3~1.7㎜，内径1.0~1.2
㎜，壁的厚度在0.2㎜以上。管壁越厚，拉 制出的电极尖端管壁也越厚，电极的跨壁 电容就越小，噪声也就越低。
玻璃微电极及膜片的几何形状
电极拉制仪
拉制方法：两步拉制法。
第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形 成一个细管，即拉制电极的颈部；
高阻封接形成的电流图
膜片钳技术四种基本记录模式
细胞吸附膜片(cell-attached patch) 将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于
清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细 胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管电 极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流， 称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整 性，
膜片钳技术
向细胞内注射恒定或变化的电流刺激， 纪录由此引起的膜电位的变化，这叫做电流 钳技术。在具体实验中，可通过给予细胞一 系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。
电压钳技术是通过向细胞内注射一定的
电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流， 从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注 射电流的大小与离子流的大小相等、方向相 反。因此它可以反映离子流的大小和方向。
电极液的充灌
对于尖端较细的玻璃微电极，膜片钳实 验中常用的方法是：在微电极尾部施加负压 使尖端充灌电极内液，然后用注射器在微电 极尾部充灌电极内液，最后轻弹微电极杆步 使其内的气泡排出。
充灌长度为电极的1/3。
制备细胞标本
从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标 本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面 光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。 但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固 程度不同，采用的分离方法也不完全相同。 大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及 清洗等步骤。
膜片钳技术
膜片钳技术1、膜片钳技术原理膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。
膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。
膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。
由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零，形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。
此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。
又由于玻璃微电极尖端管径很小，其下膜面积仅约1 μm2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略，也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略，那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定。
膜片钳技术的原理图[51]Rs是与膜片抗阻串联的局部串联电阻（或称入路阻抗），Rseal是封接阻抗。
RS通常为1~5MΩ，如果Rseal高达10GΩ以上是成为Ip/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1。
此Ip可作为I~V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻（Rf）的电压下降而被检测出。
实际上这是场效应管运算放大器（A1）的输出中包括着膜电阻成分，这部分将在通过第二级场效应管运算放大器（A2）时被减掉。
本实验采用的是全细胞记录模式。
全细胞记录构型(whole-cell recording)高阻封接形成后，继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂，电极胞内液直接相通，而与浴槽液绝缘，这种形式称为“全细胞”记录。
第十五 膜片钳技术简介
磷脂双层的 屏蔽作用
Na-K 泵
离子的跨膜分布
[K+]o << [K+]i [Na+]o >> [Na+]i
离子的跨膜分布
胞外
Na+ Cl-
Membrane
A- K+
胞内
通道蛋白——离子通道
配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体 阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体
乙酰胆碱受体
DAD-VC system
MicroManipulators
CCD Camera
Electrophysiology-Apparatus
Electrophysiology-Apparatus
Patch clamp
Patch clamp-application
取材形式 脑片(slices)
单细胞
一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏 感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多 的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后 者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 水通道 2003年诺贝尔化学奖： Pete Agre、 Roderick MacKinnon
OUTLINE
1、电生理学简介 2、膜片钳技术概述 3、膜片钳技术应用
Singlechannel recording
Singlechannel recording
Macrocurrent recording
Macrocurrent recording
Advantages
Major Disadvantage
Physiological conditions
Easy to obtain
膜片钳技术原理及相关基本知识
膜片钳技术可以用于研究内分泌系统的电生理特性，了解激素分泌的 调节机制。
其他领域的应用
肿瘤学研究
膜片钳技术可以用于研究肿瘤细胞的 电生理特性，了解肿瘤的发生和发展 机制。
免疫学研究
膜片钳技术可以用于研究免疫细胞的 电生理特性，了解免疫反应的调节机 制。
THANKS
感谢观看
膜片钳技术可以用于药物筛选， 快速筛选出具有潜在治疗作用的 药物。
膜片钳技术可以用于研究药物对 离子通道的影响，了解药物的副 作用和不良反应。
生理学领域的应用
心血管系统研究
膜片钳技术可以用于研究心血管系统的电生理特性，了解心脏和血 管的电活动和功能。
呼吸系统研究
膜片钳技术可以用于研究呼吸系统的电生理特性，了解呼吸肌的电 活动和功能。
膜片钳技术的应用领域
生理学研究
研究细胞膜离子通道的电生理 特征和功能，揭示生理状态下
细胞膜电活动的规律。
药理学研究
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，为新药研发提供实 验依据。
神经科学研究
研究神经元和神经网络的电活 动和信息传递机制，揭示神经 系统的工作原理。
疾病机制研究
研究疾病状态下细胞膜离子通 道的异常变化，为疾病诊断和
数据采集
使用膜片钳系统记录细胞膜 电位变化，通过放大器和记 录器获取数据。
数据筛选
排除异常或噪声数据，确保 数据质量。
数据转换
将原始数据转换为适合分析 的格式，如电压值或电流值 。
数据分析方法
统计分析
对数据进行统计分析，如平均值、标准差、相 关性等。
频谱分析
对数据进行频谱分析，以了解信号的频率成分。
膜片钳技术适用于多种细胞 类型，包括神经元、肌肉细 胞、上皮细胞等，具有广泛 的应用范围。
膜片钳技术及应用
膜片钳技术的应用领域
神经科学
研究神经元离子通道与动作电 位的产生和传播，以及药物对
神经元功能影响。
心血管
研究心脏离子通道与心律失常 的关系，以及抗心律失常药物 的作用机制。
药理学
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，以及新药的开发和 筛选。
其他领域
膜片钳技术还可应用于内分泌 、免疫等领域，研究相关细胞
利用膜片钳技术，可以研究神经元在长期和短期内的电生理变化，了 解学习、记忆等认知过程的神经机制。
药物筛选与开发中的应用
药物作用机制的研究
膜片钳技术可以用于研究药物对离子通道或受体电流的影响，从 而揭示药物的作用机制。
药物筛选
通过膜片钳技术，可以在细胞或组织水平上快速筛选出具有特定 药理作用的药物候选物。
物或其他因素对细胞膜功能的影响。
03 膜片钳技术的应用实例
神经科学研究中的应用
神经元电活动的记录
膜片钳技术可以用来记录单个神经元在静息状态和刺激下的膜电位 变化，从而研究神经元的兴奋性和电生理特性。
突触传递的研究
通过膜片钳技术，可以记录突触后电位，研究神经递质释放、受体 激活和信号转导等过程。
神经可塑性的研究
在医学诊断与治疗中的应用
疾病诊断
膜片钳技术可用于检测细胞膜离子通道的异常变化，从而对某些 疾病进行早期诊断，如癌症、神经退行性疾病等。
药物研发
通过膜片钳技术可以研究药物对离子通道的作用机制，为新药研发 提供有力支持。
个体化治疗
根据患者的离子通道基因变异情况，膜片钳技术可以为个体化治疗 提供精准的用药建议。
高通量与高灵敏度
通过改进膜片钳技术的设计和材料，有望实现高通量和高灵敏度的检测， 从而能够同时记录多个细胞或同一细胞的不同活动，提高实验的效率和 精度。
膜片钳实验技术应用
9.1膜片钳实验技术应用1背景知识细胞膜上的离子通道与膜内外不同类型离子构成细胞兴奋的基础，离子进出细胞产生了生物电信号，这通常用电学或电子学方法进行测量，进而逐渐形成一门细胞研究学科—电生理学（Electrophysiology），它是采用电生理方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。
早期的电生理方法多使用双电极电压钳技术来记录细胞内的电活动。
1976年德国马普生物物理化学研究所生物Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。
1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
Sakmann和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，于1991年荣获诺贝尔医学和生理学奖。
膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一具有重大意义的变革。
这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个）的离子通道分子活动的技术。
正如1991年诺贝尔颁奖词所述，膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来一场革命性的变化，它和基因克隆技术（gene cloning）并驾齐驱，给生命科学研究带来巨大的前进动力。
膜片钳(patch clamp)按工作方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳(current clamp)。
膜片钳系统简介
滨州医学院-生理教研室 膜片钳系统简介一、膜片钳系统简介：膜片钳系统包括：放大器和数模转换器系统、显微成像系统、灌流系统、屏蔽减震系统，其中核心系统是放大器和数模转换系统。
放大器和数模转换系统现在国际上常用的有两家公司生产：德国heka 和美国axcon ，其中双通道分别为heka 的EPC10和AXCON 的700B 。
heka 公司是发明膜片钳的公司，放大器和数模转换器整合在一个模块中，信噪比高，技术先进，但价格较贵，操作系统复杂；AXCON 公司放大器和数模转换器是分开的两个模块，信噪比稍差，但性价比高，操作系统入手容易，可以完成绝大多数细胞脑片的电生理记录，因此市场占有率较高。
AXCON 的700B 机器分为放大器（Muliclamp 700B ）和数模转换器（Digidata 1440A ）两个模块。
其中放大器的具体参数为：电脑化双通道电阻反馈高速电流钳放大器，自动的电容，电阻补偿。
软件控制放大器的增益、滤波、全细胞电容补偿、记录模式等。
噪音： 带宽1kHz 时的开路噪声15毫微微安陪以下，5kHz 时的开路噪声60毫微微安陪以下，10kHz 时的开路噪声最大130毫微微安陪。
带宽最大可达100kHz 。
电容补偿100PF （β=1）或1000pF （β=0.1）。
数模转换器的具体参数为：16位自适应数据采集系统, 16个模拟信号输入通道和2个模拟信号输出通道，16个数字信号输入通道和2个数字信号输出通道，4个外部设备信号输入通道，1个起始触发和1个记录触发。
输入信号范围+/-10V ，噪声小于+/-1mV ，最大采样率500kHz 。
二、膜片钳技术发展史：1976年德国马普生物物理化学研究所Neher 和Sakmann 首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh 激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。
1980年Sigworth 等在记录电极内施加5-50 cmH2O 的负压吸引，得到10-100G Ω的高阻封接（Giga-seal ），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。
细胞膜片钳实验
细胞膜片钳实验实验技术：一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。
膜片钳技术是用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片)与其周围在电学上分隔，在此基础上固定点位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法。
实验技术原理：膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。
实验操作流程：1、标本制备：根据研究目的的不同，可采用不同的细胞组织，如心肌细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞等，现在几乎可对各种细胞进行膜片钳的研究。
对所采用的细胞，必须满足实验要求，一般多采用酶解分离法，也可采用细胞培养法；另外，由于与分子生物学技术的结合，现在也运用分子克隆技术表达不同的离子通道，如利用非洲爪蟾卵母细胞表达外源性基因等。
2、电极制备：合格的膜片微电极是成功封接细胞膜的基本条件。
要成功的封接细胞膜需要两方面的因素保证，一是设法造成干净的细胞膜表面，二是制成合格的电极。
首先要选择适当的玻璃毛细管，其材料可使用软质玻璃（苏打玻璃、电石玻璃）或硬质玻璃（硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻璃）。
软玻璃电极常用于作全细胞记录，硬质玻璃因导电率低、噪声小而常用于离子单通道记录。
3、膜片钳实验系统：根据不同的电生理实验要求，可以组建不同的实验系统。
4、进行实验，记录和分析数据。
[晶莱生物]实验注意事项：客户提供：1、培养细胞：通过细胞计数取不少于2×106个细胞于EP管，加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂，混匀后保存于冰箱（-80℃，避免反复冻融）；2、实验信息：离子通道名称及亚型。
膜片钳的基本原理与应用(+protocals)
举例 二
细胞分泌研究----电位依赖性分泌
50 p A 0 -50 -100 7.96 7.92 p F 7.88 7.84 7.80 1 s 2 3
10uM forskolin
control
举例 三
细胞分泌----离子依赖性研究 --------with FLASH technology
[Ca ]i=4.72μM R=4.3/s Amp=119.9fF
二、历史和荣誉
Sakmann, Neher et al revolutionized the field of electrophysiology in 1981 with their paper “Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell- free membrane patches” (Pflügers Arch. 391, 85-100). In 1991, Neher and Sakmann were rewarded for their pioneering efforts in patch-clamp recording when they jointly won the Nobel Prize in Physiology or Medicine. Some companys have close relationship with Neher such as HEKA etc.
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蛋白运输
------利用 利用PHOTOIMAGE技术研究细胞分泌、神经传导中的蛋白运输 技术研究细胞分泌、 利用 技术研究细胞分泌 作用
常州细胞生物学脑定位膜片钳原理及步骤
常州细胞生物学脑定位膜片钳原理及步骤
常州细胞生物学脑定位膜片钳是一种用于记录神经元电活动的实验技术。
其原理为利用微型电极穿透细胞膜，直接记录细胞内外电位的变化，并通过程序控制电极的移动，定位到特定的神经元细胞上进行电生理实验分析。
具体步骤如下：
1. 制备膜片钳：制作玻璃微电极，并用火炬加热封闭一端，使其呈现一个微小的孔。
将另一端连接到电极放大器上。
2. 切取小鼠或大鼠脑组织：将小鼠或大鼠的脑组织切成薄片，并将其置于离心管中。
加入缓冲液处理，使脑片柔软并不断吸除液，去除脑组织中的血液和细胞间液。
3. 将片段放在实验器皿中：将制备好的膜片钳放入实验器皿中，将离心管中的脑片放在显微镜下，观察和定位神经元的位置。
4. 穿透细胞膜：通过微调玻璃微电极的位置，将其穿透神经元细胞膜，并记录细胞内外的电位变化。
5. 进行电生理实验：利用程序控制电极的移动，将膜片钳定位到具体的神经元细胞上进行离子通道电流和电势信号的测量。
6. 分析细胞电生理数据：通过数据分析软件对实验结果进行分析，了解神经元细胞的电生理特性和响应情况。
7. 记录实验结果：将数据记录下来，并用图表等方式展示实验结果，以便后续研究或发表论文。
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氰戊菊酯(Fen)加入前后Ca2+通道电流－电压关系图(I-V 曲线) 加入 1mol·L-1 氰戊菊酯后， Ca2+ 通道的激活电压向超极 化方向移动，提示 Ca2+ 通道的激活阈值降低，在 -70 ～ -50mV Ca2+电流比加药前增大，在-40～+20mV Ca2+电流被抑制，但翻 转电位没有明显变化。
共获1991年诺贝尔奖
Neher(1944-)
Sakmann(1942-)
6ห้องสมุดไป่ตู้
膜片钳技术原理
膜片钳技术是用玻璃微 电极接触细胞，形成吉欧 姆(GΩ)阻抗，使得与电极 尖端开口处相接的细胞膜 的膜片与周围在电学上绝 缘，在此基础上固定电位， 对此膜片上的离子通道的 离子电流(pA级)进行监测 记录的方法。
3、BaCl2对生精细胞Ca2+电流的影响
0 -100 -80 -60 -40 -20 -50 -100
2+
0
20
40
V (mV)
10mMCa 10mMBa2+
-150 -200 -250 -300
I (pA)
-350
T型Ca2+通道有个重要特征，通道对Ba2+和Ca2+选择性相同。 实验中加入与细胞外液Ca2+浓度相同的Ba2+，记录的Ca2+电流和Ba2+电流，在不 同去极化电压下，Ca2+电流和Ba2+电流均无明显差异，表明我们记录的小鼠生 精细胞Ca2+通道对Ca2+和Ba2+的通透性相同，符合T型的特征。
激活曲线： 分析细胞膜电位的 变化引起激活离子 通道数的变化。半 数激活电压 (-49.430.62)mV， 斜率因子 (6.050.55)mV， 在-65mV到-10mV 通道开放。
Normalizedcurentamplitude/conductane
小鼠生精细胞T型Ca2+通道复活特征
27
应用实例二：神经细胞离子通道学研究
动作电位时相图
离子通道阻断剂 （如钠通道阻滞剂普 鲁卡因）现已成为麻 醉剂或治疗疼痛的药 物 28
小鼠DRG神经元动作电位
小鼠DRG神经元电压依赖性Na+电流
29
小鼠DRG神经元电压依赖性K+电流的记录
DRG神经元外向全钾电流
DRG神经元外向延迟整流钾电流
8
膜 片 钳 技 术 的 记 录 模 式
9
全细胞膜片钳等效电流图
10
膜片钳实验系统组成
屏蔽网 刺激器 监视器 显微镜 放大器 转换器 探头 微操纵器
防震台
11
EPC 10 Plus膜片钳放大器
武汉华中科大仪博 PC2C
三、应用实例
神经毒理研究室是现代毒理学教育部重点实验室和江苏省应 用毒理重点实验室的组成部分，在上世纪八九十年代就开始组建 膜片钳实验室，属国内较早一批开展此工作的课题组，二十年来， 在导师肖杭教授领导、全体研究生的共同努力下，现在这门技术 已经成熟稳定，并得到国际国内同行的认可。
生精细胞 背根神经节神经元 皮层神经元
13
应用实例一：生精细胞离子通道学研究
精子获能信号转导模式图
14
小鼠生精细胞电压依赖性T型Ca2+电流
1、急性分离生精细胞
机械分离法分离小鼠睾丸组织得到的细胞
单酶消化法分离小鼠睾丸组织得到的细胞
• 2、电极内液： CsMeSO3，CsF ，EGTA ，Mg2ATP ， Phosphocreatine ，HEPES，调pH值至7.4 ， 电极外液： NaCl , KCl, MgCl2, NaHCO3 , NaH2PO4 , Dglucose , HEPES , CaCl2 ，用NaOH调pH至7.4 • 3、全细胞膜片钳
Current density Potential (mV) -80 -60 -40 -20 -2 -4 -6 -8
ICa density (pA/pF)
0 0 20 40
小鼠生精细胞电压依赖性T型Ca2+电流
小鼠生精细胞T型Ca2+电流密度曲线图 Ca2+通道在-60mV时激活，电流在-30mV时 达到最大值，翻转电位约为48mV，峰电流 密度6.56±1.08pA·pF-1。(n=11)
钳制电位为-90 mV，给予50 ms，20 mV的去极化刺激，间隔50 ms 超极化至-110 mV，随后再给予-20 mV的去极化刺激引出T型Ca2+通 道的复活电流
经单指数方程拟合的复活曲线， r为144.93 ms
小鼠生精细胞T型钙离子通道的药理学特性
1、Bay K8644对生精细胞钙电流的作用
ICa/ICa max={1+exp[(V-Vi1/2)/ Ki]}-1（ICa max 峰钙电流的最大值，V预刺激电压，Vi1/2半数失活 电压，Ki失活斜率因子）
• 复活（Recovery）用复活时间常数曲线表示
单幂指数方程拟和 ICa=Aexp(-t/r)+C（A起始时间，t为时间，r为复活时间常数，C常 数）
100
80 56.94
Inhibition(%)
60 25.86 40
20
0
*P<0.05
Cd2+
Ni2+
二价金属阳离子Cd2+、Ni2+可 阻断电压依赖性Ca2+通道，但 二者对L型和T型Ca2+通道的作 用不同。Ni2+在低浓度时主要 阻断T型Ca2+通道而对L型Ca2+ 通道无效。相反Cd2+对L型Ca2+ 通道更有效。本实验观察了相 同浓度（100M）的Cd2+ （n=4） 、Ni2+（n=4）对生精 细胞Ca2+通道电流的作用，得 到Ni2+的抑制作用大于Cd2+， 而Cd2+在较高浓度（0.5mM） 才与100M Ni2+作用相近。由 此我们确定在小鼠生精细胞记 录的钙电流是由T型Ca2+通道 介导产生。
T型Ca2+通道激活和失活曲线图
膜电位在-90mV，施加一组-80~ +70mV，以10mV递增的、波宽为200ms的指令电压方 波，以gCa与gCa max的比值对Vm作图，数据经Boltzman方程拟和所得为激活曲线； 以 ICa与ICa max 的比值对V 作图，数据经Boltzman方程拟和即为失活曲线 。
Inhibitio n
20±4
100
300 NiCl2 50 100
4
6 3 4
6.91±0.59
6.77±1.04 10.50±0.8 3 8.51±0.66
5.09±0. 75
2.16±0. 83 8.20±0. 97 3.69±1. 02
26±13
68±8 22±3 57±10*
x ±s. P<0.05, compared with 100µ mol· L-1CdCl2
4、硝苯地平(nifedepine)对小鼠生精细胞T型钙电流的作用
不同浓度硝苯地平对小鼠 粗线期精母细胞T型Ca2+电 流的作用
在本试验条件下，我们记录到的小鼠生精细胞内向 电流经过通道电生理学特性和药理学特性两个角度 鉴定，证实记录到的为T型Ca2+电流，无L型Ca2+通道 电流成分。并结合精子发生特点，提示精子顶体反 应时Ca2+的内流主要由胞膜T型Ca2+通道完成。
Bay K8644为特异的L型 Ca2+通道激动剂，低浓度 即可增大L型Ca2+通道电流， 但对T型Ca2+电流无影响。 实验发现加入5μ M Bay K8644，小鼠粗线期精母 细胞Ca2+电流无任何变化， 提示记录的Ca2+电流非L型 Ca2+通道开放产生，也不 含有L型Ca2+电流成分。
2、CdCl2和NiCl2对小鼠生精细胞Ca2+电流的作用比较
DRG神经元外向瞬时钾电流
30
小鼠DRG神经元高电压激活性Ca2+电流的记录
DRG神经元HVA Ca2+电流
I-V曲线
31
配体门控通道电流：GABA电流的记录
DRG神经元GABA激活电流
Iso使DRG神经元IGABA电流幅值增大
Bic对IGABA电流有明显抑制作用 32
大鼠胎鼠皮层神经元 电压依赖性Na+电流的记录
NiCl2和CdCl2是作用范围较广的Ca2+通 道阻断剂，比较Ni2+和Cd2+对Ca2+电流抑 制作用的大小，可以区分Ca2+通道的亚 型。
在细胞外液中加入不同浓度的NiCl2和CdCl2，
结果表明抑制作用Ni2+>Cd2+
Agent /µ mol· L-1 n ICa/pA· pF-1 加药前 CdCl2 30 3 5.62±0.19 加药后 4.48±0. 10
大鼠胎鼠皮层神经元
大鼠胎鼠皮层神经元 电压依赖性Na+电流
33
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失活曲线： 分析细胞膜电位的变 化引起失活离子通道 数的变化。半数失活 电(-60.790.24)mV， 斜率因子 (4.710.22)mV，在90mV到-40mV通道 失活。
1 . 0
. 8
. 6
. 4
. 2
0 . 0 1 2 0 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0
H o l d i n g p o t e n t i a l