膜片钳技术及其应用实例

T型Ca2+通道激活和失活曲线图
膜电位在-90mV，施加一组-80~ +70mV，以10mV递增的、波宽为200ms的指令电压方 波，以gCa与gCa max的比值对Vm作图，数据经Boltzman方程拟和所得为激活曲线； 以 ICa与ICa max 的比值对V 作图，数据经Boltzman方程拟和即为失活曲线 。
ICa/ICa max={1+exp[(V-Vi1/2)/ Ki]}-1（ICa max 峰钙电流的最大值，V预刺激电压，Vi1/2半数失活 电压，Ki失活斜率因子）
• 复活（Recovery）用复活时间常数曲线表示
单幂指数方程拟和 ICa=Aexp(-t/r)+C（A起始时间，t为时间，r为复活时间常数，C常 数）
4、硝苯地平(nifedepine)对小鼠生精细胞T型钙电流的作用
不同浓度硝苯地平对小鼠 粗线期精母细胞T型Ca2+电 流的作用
在本试验条件下，我们记录到的小鼠生精细胞内向 电流经过通道电生理学特性和药理学特性两个角度 鉴定，证实记录到的为T型Ca2+电流，无L型Ca2+通道 电流成分。并结合精子发生特点，提示精子顶体反 应时Ca2+的内流主要由胞膜T型Ca2+通道完成。
3、BaCl2对生精细胞Ca2+电流的影响
0 -100 -80 -60 -40 -20 -50 -100
2+
0
20
40
V (mV)
10mMCa 10mMBa2+
-150 -200 -250 -300
I (pA)
-350
T型Ca2+通道有个重要特征，通道对Ba2+和Ca2+选择性相同。 实验中加入与细胞外液Ca2+浓度相同的Ba2+，记录的Ca2+电流和Ba2+电流，在不 同去极化电压下，Ca2+电流和Ba2+电流均无明显差异，表明我们记录的小鼠生 精细胞Ca2+通道对Ca2+和Ba2+的通透性相同，符合T型的特征。
NiCl2和CdCl2是作用范围较广的Ca2+通 道阻断剂，比较Ni2+和Cd2+对Ca2+电流抑 制作用的大小，可以区分Ca2+通道的亚 型。
在细胞外液中加入不同浓度的NiCl2和CdCl2，
结果表明抑制作用Ni2+>Cd2+
Agent /µ mol· L-1 n ICa/pA· pF-1 加药前 CdCl2 30 3 5.62±0.19 加药后 4.48±0. 10
大鼠胎鼠皮层神经元
大鼠胎鼠皮层神经元 电压依赖性Na+电流
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失活曲线： 分析细胞膜电位的变 化引起失活离子通道 数的变化。半数失活 电(-60.790.24)mV， 斜率因子 (4.710.22)mV，在90mV到-40mV通道 失活。
1 . 0
. 8
. 6
. 4
. 2
0 . 0 1 2 0 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0
H o l d i n g p o t e n t i a l
共获1991年诺贝尔奖
Neher(1944-)
Sakmann(1942-)
6
膜片钳技术原理
膜片钳技术是用玻璃微 电极接触细胞，形成吉欧 姆(GΩ)阻抗，使得与电极 尖端开口处相接的细胞膜 的膜片与周围在电学上绝 缘，在此基础上固定电位， 对此膜片上的离子通道的 离子电流(pA级)进行监测 记录的方法。
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二、膜片钳技术



1976年 德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann 在青蛙肌细胞上记录记录到ACh激活的单通道离子电流 1980年 Sigworth等用负压吸引，得到10-100GΩ的高 阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声 1981年 Hamill和Neher等引进了膜片游离技术和全细 胞记录技术 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问 世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
Current density Potential (mV) -80 -60 -40 -20 -2 -4 -6 -8
ICa density (pA/pF)
0 0 20 40
小鼠生精细胞电压依赖性T型Ca2+电流
小鼠生精细胞T型Ca2+电流密度曲线图 Ca2+通道在-60mV时激活，电流在-30mV时 达到最大值，翻转电位约为48mV，峰电流 密度6.56±1.08pA·pF-1。(n=11)
激活曲线： 分析细胞膜电位的 变化引起激活离子 通道数的变化。半 数激活电压 (-49.430.62)mV， 斜率因子 (6.050.55)mV， 在-65mV到-10mV 通道开放。
Normalizedcurentamplitude/conductane
小鼠生精细胞T型Ca2+通道复活特征
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应用实例二：神经细胞离子通道学研究
动作电位时相图
离子通道阻断剂 （如钠通道阻滞剂普 鲁卡因）现已成为麻 醉剂或治疗疼痛的药 物 28
小鼠DRG神经元动作电位
小鼠DRG神经元电压依赖性Na+电流
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小鼠DRG神经元电压依赖性K+电流的记录
DRG神经元外向全钾电流
DRG神经元外向延迟整流钾电流
氰戊菊酯(Fen)加入前后Ca2+通道电流－电压关系图(I-V 曲线) 加入 1mol·L-1 氰戊菊酯后， Ca2+ 通道的激活电压向超极 化方向移动，提示 Ca2+ 通道的激活阈值降低，在 -70 ～ -50mV Ca2+电流比加药前增大，在-40～+20mV Ca2+电流被抑制，但翻 转电位没有明显变化。
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膜 片 钳 技 术 的 记 录 模 式
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全细胞膜片钳等效电流图
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膜片钳实验系统组成
屏蔽网 刺激器 监视器 显微镜 放大器 转换器 探头 微操纵器
防震台
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EPC 10 Plus膜片钳放大器
武汉华中科大仪博 PC2C
三、应用实例
神经毒理研究室是现代毒理学教育部重点实验室和江苏省应 用毒理重点实验室的组成部分，在上世纪八九十年代就开始组建 膜片钳实验室，属国内较早一批开展此工作的课题组，二十年来， 在导师肖杭教授领导、全体研究生的共同努力下，现在这门技术 已经成熟稳定，并得到国际国内同行的认可。
膜片钳技术及其应用实例
王
强
南京医科大学公共卫生学院神经毒理实验室
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内容提要


源自文库
离子通道 膜片钳技术（Patch Clamp Technique） 应用实例
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被引用次数13325
一、离子通道
• 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞 内的通信是依靠其膜上的离子通道进行的，离子 和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电 信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方 法进行测量。由此形成了一门细胞学科—电生理 学（electrophysiology）。 • 膜片钳技术已成为研究离子通道的“金标准”。
钳制电位为-90 mV，给予50 ms，20 mV的去极化刺激，间隔50 ms 超极化至-110 mV，随后再给予-20 mV的去极化刺激引出T型Ca2+通 道的复活电流
经单指数方程拟合的复活曲线， r为144.93 ms
小鼠生精细胞T型钙离子通道的药理学特性
1、Bay K8644对生精细胞钙电流的作用
Bay K8644为特异的L型 Ca2+通道激动剂，低浓度 即可增大L型Ca2+通道电流， 但对T型Ca2+电流无影响。 实验发现加入5μ M Bay K8644，小鼠粗线期精母 细胞Ca2+电流无任何变化， 提示记录的Ca2+电流非L型 Ca2+通道开放产生，也不 含有L型Ca2+电流成分。
2、CdCl2和NiCl2对小鼠生精细胞Ca2+电流的作用比较
Inhibitio n
20±4
100
300 NiCl2 50 100
4
6 3 4
6.91±0.59
6.77±1.04 10.50±0.8 3 8.51±0.66
5.09±0. 75
2.16±0. 83 8.20±0. 97 3.69±1. 02
26±13
68±8 22±3 57±10*
x ±s. P<0.05, compared with 100µ mol· L-1CdCl2
生精细胞 背根神经节神经元 皮层神经元

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应用实例一：生精细胞离子通道学研究
精子获能信号转导模式图
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小鼠生精细胞电压依赖性T型Ca2+电流
1、急性分离生精细胞
机械分离法分离小鼠睾丸组织得到的细胞
单酶消化法分离小鼠睾丸组织得到的细胞
• 2、电极内液： CsMeSO3，CsF ，EGTA ，Mg2ATP ， Phosphocreatine ，HEPES，调pH值至7.4 ， 电极外液： NaCl , KCl, MgCl2, NaHCO3 , NaH2PO4 , Dglucose , HEPES , CaCl2 ，用NaOH调pH至7.4 • 3、全细胞膜片钳
电压门控性钙离子通道的动力学研究
• 激活（Activation）：用激活曲线反映通道开启 的速度和难易程度
Boltzmann方程拟和：gCa/ gCa max={1+exp[-(Vm-V1/2)/ K]}-1（gCa max 峰电导的最大值， V1/2半数激活电压，K激活斜率因子）
• 稳态失活（Steady-state Inactivation）反映通道 失活数目的电压依赖性，用失活曲线表示
100
80 56.94
Inhibition(%)
60 25.86 40
20
0
*P<0.05
Cd2+
Ni2+
二价金属阳离子Cd2+、Ni2+可 阻断电压依赖性Ca2+通道，但 二者对L型和T型Ca2+通道的作 用不同。Ni2+在低浓度时主要 阻断T型Ca2+通道而对L型Ca2+ 通道无效。相反Cd2+对L型Ca2+ 通道更有效。本实验观察了相 同浓度（100M）的Cd2+ （n=4） 、Ni2+（n=4）对生精 细胞Ca2+通道电流的作用，得 到Ni2+的抑制作用大于Cd2+， 而Cd2+在较高浓度（0.5mM） 才与100M Ni2+作用相近。由 此我们确定在小鼠生精细胞记 录的钙电流是由T型Ca2+通道 介导产生。
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• 电压门控性离子通道：膜上通道蛋白的带点集 团在膜电位改变时，在电场的作用下，重新分 布导致通道的关闭，同时有电荷移动，称为门 控电流。 • 配体门控离子通道：神经递质（如乙酰胆碱）、 激素等与通道蛋白上的特定位点结合，引起蛋 白构象的改变，导致通道的打开。 • 机械门控离子通道：机械牵拉 • 其他
DRG神经元外向瞬时钾电流
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小鼠DRG神经元高电压激活性Ca2+电流的记录
DRG神经元HVA Ca2+电流
I-V曲线
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配体门控通道电流：GABA电流的记录
DRG神经元GABA激活电流
Iso使DRG神经元IGABA电流幅值增大
Bic对IGABA电流有明显抑制作用 32
大鼠胎鼠皮层神经元 电压依赖性Na+电流的记录