2017动物的克隆

组织培养工作进入了全新阶段
（三）动物细胞培养过程
材料动物有何特点，为什么？ 一般为幼龄动物或胚胎,因为这些组织或 器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强
用胰蛋白酶处理目的？
消化组织中的胶原纤维和细胞外的其他 成分，获得单个的成纤维细胞悬浮液。
思考动物培养条件？特殊培养液？
此处细胞在该生活环境中能无限生长和 增殖吗？
（ 2）在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核发 育的的作用。
2.为什么克隆羊能获得成功，请用分子细胞学机理Hale Waihona Puke Baidu来阐述原因。
3.克隆动植物具有哪些应用？
• (2016)下图表示通过核移植等技术获得某种克隆 哺乳动物(二倍体)的流程。
回答下列问题：
(1) 图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性
1个月，并且看到细胞分裂
真正开始
1907美国科学家将一部分蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中，成 功看到了神经纤维末端的阿米巴运动，解决了神经纤维起源 问题，并创立了悬浮培养法
1912年鸡胚细胞的培养1943科学家在致癌物20-甲基胆蒽的诱导 下培养小鼠结缔组织，获得了能在小鼠体内生长肉瘤的L-细胞系
1951通过对黑人妇女的宫颈癌组织的体外连续培养，获得肿 瘤细胞系即不死细胞系-海拉细胞系
过
程
细胞形成生长晕并增大
传代培养
细胞系或细胞株
（四）细胞系和细胞株
1.细胞系： 可连续传代的细胞
（1）有限细胞系：不能连续培养下去的细胞系。如：二倍体细胞
（2）连续细胞系:
大多数具有异倍体核型
能连续培养下去的细胞系 有的是恶性细胞系，具有异体致瘤性;
有的获得不死性（保留接触抑制，不致癌）
2.细胞株： 通过一定的选择或纯化方法，从原代培养或细
（1）细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭。 （2）细胞贴壁生长和细胞的接触抑制：
• 贴壁生长：细胞培养时，悬液中分散的细胞很快就贴附在 瓶壁上。
• 要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。
•接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞 就会停止分裂增殖的现象。
解 原代培养： 从机体取出后立即进行的细胞、组织培养，
培育植株等
动物细胞培养
细胞增殖
液体培养基 葡萄糖 动物血清
细胞株、细胞系 获得细胞或细胞分 泌蛋白
（五）克隆培养法
1、定义：
2、产物: 遗传性状均一、表现的性状相似
未经克隆的异质性细胞系
克隆
纯系
3、细胞克隆的基本要求: 来源于单个细胞
4、克隆对象的选择 选择对培养环境具有较大适应范围和
具有较强独立生存能力的细胞。 • 单细胞不如群体细胞 • 原代培养细胞和有限细胞系不如无限细胞系、转化细胞系和
一、动物细胞培养和克隆形成
（一）动物的细胞和组织培养
看书思考:
1、动物细胞、组织培养关系 2、能否用植物组织培养的方法使动物细胞发育成
动物个体？
3、动物的细胞和组织培养的理论依据（原理）？ 细胞增殖
（二）动物组织培养技术的发展
1885年鸡神经板在生理盐水中培养成活组织培养一词诞生 萌芽
1903年 皮肤及白细胞培养于腹水和血清中，结果细胞的成活期达
染色体的组成可为___X_X__或_X__Y___。
过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞
培养至适当时期再进行，去核时常采用_______的
方法。
显微操作
• (2)经过多次传代后，供体细胞中_遗__传_物__质的稳定性 会降低。因此，选材时必须关注传代次数。
• (3)若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同 ，从遗传物质的角度分析其原因是______。
胞系中获得的具有特殊性质的细胞 （1）有限细胞株 （2）连续细胞株
3.细胞系与细胞株的关系
细胞系泛指可传代的细胞；细胞株是具有特殊性质的细胞系
思考：植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目 原理
培养基性质 培养基特有成分
培养结果 培养目的
植物组织培养
细胞的全能性 半固体培养基
蔗糖 植物激素 植物体
问题讨论
烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧 伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们 想一想如何来治疗该病人？
取该患者的皮肤进行细胞培养, 获得足量的细胞后再移植
植物克隆的技术基础---- 植物组织培养 动物克隆的技术基础 ：
动物的细胞培养和组织培养
细胞培养也是细胞生物学的主要技术基础
卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的形状产生影响
• (4)与克隆羊“多莉(利)”培养成功一样，其他克 隆动物的成功获得也证明了__________。
动物已分化体细胞的细胞核具有全能性
制备单克隆抗体
2.动物细胞融合的成功应用
思考：
——单克隆抗体的制备
• 人们获得抗体的传统方法是?
–将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体
• 这种方法的缺点是什么?
–效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可能产生 严重的过敏反应。
（1）单克隆抗体
将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能 力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。
2、如何进行第2次筛选？ 培养在多孔细胞培养板上， 每孔只有一个杂交瘤细胞。
（3）单克隆抗体的优点:P33 特异性强，灵敏度高。
3.动物核移植实验和克隆繁殖
（1）核移植：利用供体核来取代另一个细胞中的细胞核。
去核
注核
受精卵去核
早期胚胎植入同步孕鼠 子宫中
实践证明：胚胎细胞核的移植 成功率远高于成体细胞。
（2）低等动物细胞>高等动物细胞
2.动物难以克隆的原因
动物的基因组中，一类基因是维持生存的，在各种细 胞中都处于活动的状态。另一类基因随着组织器官和发育 阶段不同而选择性表达。
动物的体细胞已发生分化，基因组中基因的活动很不完全， 不能像受精卵那样发挥细胞的全能性
思考：
1、为何要进行两次筛选？ 第1次筛选得到杂交瘤细胞 （多种）。 第2次筛选得到能产生特异 性抗体的细胞群。
杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分 单一的特异性抗体。
这种单一类型的只针对某一特定抗原的抗体分子，就 是单克隆抗体。
（2）单抗的制备过程
1. 动物免疫 2. 分离B淋巴细胞 3. 细胞融合——淋巴
细胞杂交瘤的制备 4. 杂交瘤细胞的筛选 5. 单克隆抗体的制备
和冻存 6. 单克隆抗体的纯化
动物细胞培养条件：
• 无菌、无毒环境 • 适宜的温度—人和哺乳动物细胞最适温度为35 －37℃。 • 气体和适宜的酸碱度—需要一定量的O2等、 pH7.2-7.4 • 适宜的渗透压 • 营养物质—— •主要有：葡萄糖、氨基酸、无机盐、
维生素和动物血清等
保证细胞顺利的生长增殖
解释1：需要定期转移细、胞分装贴培壁养原因？
细胞膜连接
细胞融合、形成杂种细胞
（3）植物体细胞融合和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞融合 动物细胞融合
细胞融合原理 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性
细胞融合的方法 去除细胞壁后诱导
原生质体融合
诱导方法
电刺激 化学（聚乙二醇）
使细胞分散后 诱导细胞融合
电融合、PEG、 灭活的仙台病毒
用途
获得杂种植株
（2）单抗的制备过程
从经抗原免疫的小 鼠中分离B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
细胞融合、筛选
杂交瘤细胞（多种）
细胞培养
选出能产生特定抗体 的细胞群培养 体外培养
体内培养
从培养液中提 取单克隆抗体
从小鼠腹水中 提取单克隆抗体
• 例.(全国大纲2013) 关于动物细胞培养和植物组织 培养的叙述，错误的是
• A.动物细胞培养和植物组织培养所用培养基不同
肿瘤细胞
5、提高细胞克隆形成率的措施
6、细胞克隆的用途
二、动物的细胞融合技术及其应用
1.动物细胞融合
（1）定义
病毒颗粒黏 附细胞表面
用自然或人工方法,使两个或多个不 同的细胞或不同基因型融合成一个 细胞的过程。
细胞膜被 病毒颗粒穿通
（2）诱导融合的因素
• 生物法：灭活的仙台病毒诱导融合 • 化学法：聚乙二醇诱导融合 • 物理法：电激、激光诱导融合
注入囊胚细胞 团的细胞核
重组细胞
2.克隆羊培育过程
黑面绵羊去 核卵细胞
白面绵羊乳 腺细胞核
细胞核移植 重组细胞
电脉冲刺激 早期胚胎
胚胎移植
另一头绵羊的子宫
妊娠、出生 克隆羊多利
讨论（阅读P36）
1.体细胞羊的克隆成功证明了什么？
（1）高度分化细胞经过一定技术处理，也可回复到 类似受精卵时期的功能
释
到培养的细胞形成生长晕并增大为止。
2：
细 传代培养：
胞
将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养
培
基中，使其继续生长、增值。
养
即：细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养
瓶为传代培养。
㈢ 动
动物的组织、器官
胰蛋白酶
（分解胶原纤维）
物
单个细胞
细
加特殊培养液
如：动物血清等
胞
细胞悬浮液
培
养
原代培养
①细胞密度过大、代谢消耗引起营养枯竭 ②细胞贴壁生长和细胞的接触抑制
• B.动物细胞培养和植物组织培养过程中都要用到 胰蛋白酶
• C.烟草叶片离体培养能产生新个体，小鼠杂交瘤 细胞可离体培养增殖
• D.动物细胞培养可用于检测有毒物质，茎尖培养 可用于植物脱除病毒
三、动物的克隆繁殖
复习：根据发育的潜能，干细胞的分类：
1.动物细胞全能性的表现程度
（1）受精卵>多能干细胞>单能干细胞>高度分化的细胞