第二节 蛋白质一级结构的测定方法

氨基酸的分离和含量测定
氨基酸的颜色反应： 紫色在 570nm比色 茚三酮与 Pro生成 黄色产物， 在440nm 比色
层析
基于不同物质在流动相和固定相之间的分 配系数不同而将混合组分分离的技术。当 流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固 体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组 分沿固定相移动的速度不同而分离。能用 于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。
白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学
发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综 述及专著文献较多。
三 测定前的准备工作
测序前的准备工作：
蛋白质的纯度鉴定
要求：纯度97%以上，均一。 鉴定方法：
测定蛋白质的分子量
估算氨基酸残基数，确定肽 链数 ⑴ 聚丙烯酰 胺凝胶电 泳 (PAGE) 要求一条带 ，双向电泳。 方法： SDS-PAGE，凝胶过 滤法，沉降系数法 ⑵ DNS—Cl （二甲氨基萘 磺酰氯）法测N端氨基酸。 (3) 亲和层析 (4) western 印迹法等
（1）N-末端测定 C.二甲基氨基萘磺酰氯法
在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰 氯DNS-Cl）可以与N-端氨基酸的游离氨基 作用，得到丹磺酰-肽。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性 质，检测灵敏度可以达到110-9mol。
氨肽酶法
氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链 的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应 时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和 数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作 动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残 基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以 亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。
稳定SH基的方法：
（B）氨乙基化
非共价结合 尿素， SDS-PAGE，盐酸胍， 高浓度 的盐
2）末端分析
（1）N-末端测定 A. 二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)
（1）N-末端测定 B.氰酸盐法
异硫氰酸苯酯（PTC或PITC）与N末端的 α－氨基发生的反应，生成PTC－钛,在弱 酸中自发环化转变成PTH－衍生物。该试 剂称为Edman试剂。 由于PTH－衍生物从多肽链上脱落下来 对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋 白质的一级结构。
氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的方法
若要测定某蛋白质样品的氨基酸组成，事先 把样品经酸水解，调节水解液的pH为3，使所有的 氨基酸都带负电荷，由于各种氨基酸侧链基团的 复杂性，各种氨基酸所带的电荷强度差异比较大， pH3时,对于酸性氨基酸来说虽然也带正电荷，但 由于谷氨酸γ-羧基和天冬氨酸的β-羧基，都有 不同程度的离解，导致整个分子偏中性，对于碱 性氨基酸来说，本来结合质子的能力就很强，此 时，它所带的正点荷强度就更大。 酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺 转变为相应的谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果 好，在洗脱过程中，使用不同pH和离子强度的洗 脱液。经氨基酸自动分析仪洗脱下来的氨基酸， 按顺序进行染色，由记录仪自动描绘出各种氨基 酸的光吸收图谱。

PDB(Protein Data Bank):蛋白质结构数据库 PDB 原来有由美国Brookhaven 国家实验室负 责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学 研究的需要，1998年由美国国家科学基金委员会、 能源部和卫生研究院资助，成立结构生物学合作 研究协会（Research Collaboratory for Structure Bioinformatics,RCSB） PDB由 RCSB 管理。 PDB是目前最主要的蛋白质分子结构数据库
碱水解
一般用5 mol/L氢氧化钠于真空或充氮条件 下进行，1100C煮沸10-20小时。 由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的 破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。 该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。
酶法裂解
胰蛋白酶 （赖氨酸）Lys——X （精氨酸）Arg—— X(X ≠ Pro) 胰凝乳蛋白酶 （糜蛋白酶） （酪氨酸）Tyr——X （色氨酸）Trp——X （苯丙氨酸）Phe——X (X ≠ Pro) 嗜热菌蛋白酶 X--Leu（亮氨酸）,Ile（异亮氨酸）, Phe（苯丙氨酸）, Trp（色氨酸），Val（缬氨酸）,Tyr（酪氨酸），Met（甲硫氨酸） 胃蛋白酶 Phe （苯丙氨酸） ，Trp（色氨酸）Tyr （酪氨酸）， Leu （亮氨酸）——X 不能水解Pro羧基参与形成的肽键。 Glu蛋白酶 Glu（谷氨酸）——X Arg蛋白酶 Arg（精氨酸）——X Lys蛋白酶 X——Lys（赖氨酸） Pro蛋白酶 Pro——X
①薄膜层析
将多肽链完全酸水解成游离氨基酸，
然后进行Dansyl标记，聚酰胺薄膜层析，
此方法在蛋白质结构分析中是一种超微量
的分析术，但此方法用于定量分析尚不够
准确。
②氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的 方法
离子交换色谱法：利用离子交换原理和液 相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和 阴离子的一种分离分析方法，利用被分离 组分与固定相之间发生离子交换的能力差 异来实现分离。离子交换色谱主要是用来 分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛 地应用于无机离子的分离，而且广泛地应 用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、 蛋白质等的分离。
3）氨基酸组成分析 ②离子交换层析法
离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生 离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱 的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中 存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的 离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子 交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。 固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相 互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相 的运动而运动，最终实现分离。
二、蛋白质一级结构的测定方法
研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元
结构从氨基酸算起，已有150年的悠久历史，直到
1955年，Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺 序，为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在 分子生物学的发展进程中是一个重要突破。 目前关于核酸的一级结构研究，由于Sanger等发
一级结构的测定方法
1. 多肽链的分离
1）肽链的拆开
蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共
价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多 肽链，采用的化学处理方法有：
①过甲酸氧化
Hale Waihona Puke Baidu
②巯基乙醇还原
③ Cleland‘s试剂的还原作用
稳定SH基的方法：
（A） 烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物
第二节
蛋白质一级结构 的测定
一、蛋白质一级结构定义(primary structure)
在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成
进行排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我
们称为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结
构。
核心：蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序,包 括二硫键的位臵。 意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋 白质生理功能的必要基础。
各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子 交换树脂，结合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸 自动分析仪的记录上可以看出：天冬氨酸（pI为2.98） 最先随洗脱液下来，赖氨酸（pI为9.74）最后下来， 三个中性氨基酸如:甘氨酸（pI为5.97）、苏氨酸 （pI为6.53）和亮氨酸（pI为5.98）洗脱的顺序又如 何呢? 苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结合比 较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，减 弱了树脂对氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮 氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸侧 链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。 综上所述：影响离子交换树脂分离氨基酸的因 素： （1）氨基酸分子所带的电荷； （2）氨基酸分子的极性； （3）氨基酸分子的形状和大小。
及测定的一般步骤
蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多 肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以 及－S－S－定位等。
蛋白质测序的一般步骤
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。 （3） 断裂链内二硫键。 （4） 分析多肽链的N末端和C末端。 （5） 测定多肽链的氨基酸组成。 （6） 多肽链部分裂解成肽段。 （7） 测定各个肽段的氨基酸顺序 （8） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （9） 确定多肽链中二硫键的位臵。

由于克隆核苷酸序列比测定核苷酸序列更快、 更有效、信息更多，因此有不少电子数据库问世， 储存的序列资料以惊人的速度不断扩充，并且个 人电脑可以方便利用。如果现在需要确定一个新 蛋白质的序列，研究者所做的第一件事就是将新 蛋白质的序列与数据库中的其它已知序列进行比 较，确定其中是否存在同源性。这些数据库中比 较有名的就是美国National Biomedical Researsh Foundation（国家生物医学研究基金 会）主持的PIR（Protein Information Resource，蛋白质信息库或Protein Identification Resouece 蛋白质鉴定库）,美国 政府支持的Gene Bank [Gene Sequence Data Bank（基因序列数据库）]，还有欧洲的EMBL （European Molecular Biology Laboratory,欧 洲分子生物学实验室数据库）。
常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸（磺酸）在 105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。近年来 用4 mol/L的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应 用。
此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。
缺点是色氨酸被沸酸完全破坏，含有羟基的氨基酸如丝氨 酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺侧 -COO+ 链的酰胺基被水解成了羧基。
氨基酸的分离
色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配， 以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物 中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最 终达到分离的效果。 色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流 动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之 间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不 相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分 在固定相上相互分离。根据物质的分离机制，又 可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、 凝胶色谱、亲和色谱等类别。
蛋白质序列测定的基本战略和步骤
一 蛋白质序列测序的基本战略 1、直接法（测蛋白质的序列） 对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端， 但目前只能测60个N端氨基酸。 2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列） 蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（database or databank）可以在Altas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff,M.O.ed. 1972-1978,Vols 1-5, Washington,DC:National Biomedical Researsh Foundation)中找到。然而现在大多数蛋白质序列 信息都 是从基因核苷酸序列（经过密码子）翻译成氨基酸序列的。
据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。
应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学 实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放 出的氨基酸主要是C末端氨基酸。
羧肽酶法
羧肽酶A： 除Pro、Arg（精氨酸）、Lys （赖氨酸）外的所有C端氨基酸 羧肽酶B：只水解Arg、Lys
羧肽酶 法测 C 末端
C-末端分析 C. C-端氨基酸选择性氚标记法： 使用氚标记是测定C-端氨基酸最好的办法， 专一性强，灵敏度高，但是这种方法不能用于C端脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp） 还原法：利用硼氢化锂将C-端氨基酸还原成 －氨基醇。然后碱多肽水解，用色谱法鉴定 －氨基醇的类别。
3）氨基酸组成分析
酸水解
2）末端分析
（2）C-末端分析
A.肼解法
无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸 留在上清中。 Gln（谷氨酰胺）、Asn（天冬酰胺）、Cys （半胱氨酸）、Arg（精氨酸）不能产生游 离的羧基末端aa。
（2）C-末端分析 B.羧肽酶水解法 羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根
明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对比
之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸
迅速。
但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪
以及气相色谱、质谱(GC MS)等方法的相继出现。
使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种
蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少， 而且工作人员也大大减少。 当年Sanger分析胰岛素用了整整十年的时间，今天 运用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右的蛋