第二节 蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构测定
氨基酸与肽的定量组成测定
定量组成测定，第一步是将蛋白质水解 为基组成氨基酸。 蛋白质的水解方法有： 1、酸水解法：用6MHCl于100~120℃下在真 空的安瓿瓶内进行，水解10~24小时
特点： （1）所得的氨基酸不消旋；但色氨酸全部被破坏。 （2）天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来而转 变为相应的氨基酸，酰胺基的总量由产生的氨算出。
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蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中 氨基酸的组成、排列顺序连接方式和 二硫键的位置。 在生物化学与分子生物学中不少问题 都面临着需要知道蛋白质一级结构的 情况。如研究蛋白质的结构与功能的 关系、酶的结构与功能的关系、一级 结构与高级结构的关系等。因此，只 有把一级结构研究清楚之后，我们才 能研究生命过程中的许多复杂问题。
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（2）三价铁显色法： 含有色氨酸的样品，与铁离子的醋 酸溶液混合，加入浓硫酸，振荡之后呈 玫瑰红色，在545nm比色测定。 此法测定简便、快速，线性关系较 好。但反应混合物中的含水量对显色有 一定影响。因此，不如对-二甲基氨基 苯甲醛法使用广泛。
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氨 基 端 的 分 析
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丹磺酰氯（DNS-Cl）法：Harytley 等1956年报告了丹磺酰氯与氨基酸、肽 或蛋白质的氨基反应产生黄色的荧光， 由此产生了测定N末端的新方法，称 DNS法。 本法测定N末端的原理与DNP法有 相似之处。但比DNP法的灵敏度提高了 100倍，使用更为广泛。
对氯汞苯甲酸与巯基反应， 形成巯基的对氯汞苯甲酸 衍生物（PCMB）。PCMB 最大吸收在233nm摩尔消光 值为1.96×104。与巯基形 成硫醇盐以后，增加到2.2 ×104从图中可以看出在 250nm处差值最大，这个差 值与参与反应的试剂量有 直接关系。测定时，用含 巯基化合物支滴定固定量 的汞试剂，直至吸收差值 不再增加为止，根据汞试 剂的量可以计算出巯基数 量。由于测定是在蛋白质 的吸收范围内进行，因此 必须作蛋白质含量对吸收 36 影响的校正。
测蛋白质一级结构的方法
测蛋白质一级结构的方法
测定蛋白质的一级结构通常使用以下方法：
1. 氨基酸分析：通过氨基酸分析确定蛋白质中各种氨基酸的种类和数量，从而推断出其一级结构。
2. 胰蛋白酶消化法：使用胰蛋白酶等蛋白酶将蛋白质水解为小片段，并通过HPLC、毛细管电泳等技术分离、测序和鉴定这些片段，从而推断蛋白质的一级结构。
3. 质谱法：利用质谱仪测定蛋白质水解片段的质量，结合数据库比对和分析，推断蛋白质的氨基酸序列，从而确定其一级结构。
4. 二硫键分析：通过还原剂将蛋白质中的二硫键还原为单硫键后，再进行分析、测定二硫键位置等信息，推断蛋白质的一级结构。
这些方法在实验室中常常结合使用，以确定蛋白质的完整一级结构信息。
蛋白质的性质分类及研究方法
(术语：推定/推测蛋白质 putative protein)
优点：快速、无需纯化蛋白质、基因易分离测序 缺点：无法确定经后加工的蛋白质的最终序列、
被修饰的氨基酸和二硫键的位置
二、直接测定法（9大步）
（一）测定蛋白质一级结构 (测序) 的策略
（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目 （2）拆分蛋白质分子的多肽链 （3）断开多肽链内的二硫键 （4）分析每一多肽链的氨基酸组成 √ （5）鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基 √ （6）裂解多肽链成较小的肽段（用2种或几种不
◆蛋白质在等电点时，易沉淀析出；同时，其粘 度、渗透压、膨胀性及导电能力均为最小。
二、蛋白质的胶体性质
◆蛋白质由于分子量很大，在水溶液中形成 1～100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征；
◆可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基 酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在 颗粒外面形成一层水化层；
串联质谱技术； • 重建多肽链一级序列的重叠肽拼凑法 • 用于二硫桥定位的对角线电泳等。
第三节、蛋白质的分离、纯化和分析
一、蛋白质纯化的准备工作
准备工作要解决三个问题：
（一）明确纯化蛋白质的目的； （二）建立目标蛋白的测活方法； （三）选择富含目标蛋白的原材料。
二、蛋白质纯化的一般注意事项
1.操作尽可能在低温条件下进行。2.待纯化的材料不要太稀.3. 合适的PH。4.使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标的降解。 5.避免样品反复冷冻盒剧烈搅动，防止蛋白质变性。6.缓冲溶 液成分尽量模拟细胞内环境。7.加入防止蛋白质氧化及对目标 蛋白破坏的DTT和EDTA。8.使用灭菌溶液防止微生物生长。
（二）沉淀 根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同，而 对他们进行选择性沉降从而达到分离目的一 种粗纯化方法。它通常用于目的蛋白从大体 积的粗抽提物中游离出来。这种方法既能除 去许多杂质，又有浓缩之效。 方法包括：改变PH或改变离子强度（盐析）
蛋白质一级结构测序-1
基 • 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；
酸 A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自
测 定
面包酵母。 • 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的
所有C-末端氨基酸残基；B只能水解
Arg和Lys为C-末端残基的肽键。
E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或
蛋 多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成
结 构
多肽链(亚基).
的
测
定
C.二硫键的断裂
蛋 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可
白 质
在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，
一 用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使
级 结 构
二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂 （ICH2COOH）保护生成的巯基，以
的 防止它重新被氧化。
测
定
SH-CH2-CH2-OH
巯
O
-SH
基 （
-OOC CHCH2 SH NH3+
） 的
C H 2O C C-O l OC CHCH2 SOCCH2
NH3+
O
CH2Cl
-OOC CH CH 2 SCH 2
O
NH 3+
ICH2CNH2 -OOC CHCH2 SCH2CNH2
NH3+
O
保 护 作用：这些反应可用于巯基的保护。
SS
多
肽
CH3 S：
链
CH2
的 选
CH2 O
RO
Br-
NH CH C NH CH C + Br C+ N
择
CH3 S+ C N
性
CH2
降 解
CH2 O
测定蛋白质一级结构的方法进展
测定蛋白质一级结构的方法进展蛋白质的一级结构，指的是蛋白质分子中氨基酸的序列，其测定包括蛋白质分子多肽链 的数目和多肽链中的氨基酸的精确序列两方面。
蛋白质的氨基酸序列测定对了解其结构与功 能以及生物进化、遗传变异的关系极有意义，对生命科学的发展更是起到了推进作用，而当 今蛋白质组的研究更需其支持。
测定蛋白质一级结构并作出肽谱的重要性在于：①可用于分 子克隆中寡核苷酸探针的制备；②为cDNA推导的氨基酸序列提供证据；③为重组DNA产生 的蛋白质作指纹分析;④蛋白质的完整结构鉴定;⑤确定翻译后修饰的位点;⑥决定簇的定位;⑦二硫键的确定。
蛋白质测序的基本思路是先将蛋白质用化学法或酶法水解成肽段， 再对肽段进行氨基酸 序列测定，其中化学法裂解的肽段一般较大，适于自动序列分析仪测定；酶法的优点是专一 性强，降解后肽段易纯化，产率较高，副反应少。
得到纯肽后需对肽段进行氨基酸测序，测 定方法主要是化学法，酶法也有一定意义。
化学法以Edman降解法最为经典，它对所有氨基 酸残基具有的普适性和近乎定量的高产率，使其成为近50年来N端顺序分析技术的基础。
近 年来,在蛋白质序列测定方面出现了一些新的技术手段,现对这些新技术作一些简单的介绍。
一、液相色谱（LC）HPLC是肽谱分析常用的工具,常用粒度为5-10μm的大孔烷基化硅胶吸附剂为色谱柱的 填料,通过增加有机溶剂的浓度进行梯度洗脱,其发展目标是加快分析速度和提高灵敏度.对 小肽的分离可选用小孔径C18载体，粒度5-10μm。
1、微柱高效液相色谱普通柱通常为4.6mmI.D.,而微柱液相色谱柱直径<2.1mm,它是由科学家Ishii首次提出 的，现在已成为Edman降解自动序列分析仪分离低微克量蛋白质和肽的基础。
它一般重现良 好，且用样量少，并能快速地进行蛋白质分析。
其流速通常为10-200μl/min,出峰时间短, 峰型尖窄,从而大大提高了检测灵敏度,可达1pmol;回收率高,因为微柱的载体少,非专一性 吸附少。
蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质结构测定的方法
应用：( Ⅰ) 研究生物大分子及其复合物在溶液中的
三维结构和功能; ( Ⅱ) 研究动态的生物大分子之间以及与配基
的相互作用; ( Ⅲ) 研究生物大分子的动态行为; ( Ⅳ) 用固体核磁共振或液体核磁共振技术研
究膜蛋白的结构与功能; ( Ⅴ) 研究蛋白质折叠,折叠动力学; ( Ⅵ) 用于药物筛选与设计; ( Ⅶ) 研究代谢组学; ( Ⅷ) 研究活细胞中的蛋白质蛋白质相互作用; ( Ⅸ) 核磁成像用于认知科学研究.
传播方向看好似做圆周运动——circularly polarized
light
▪ 右圆偏振光：面对光源
E
H
电场矢量顺时针转动
左圆偏振光：面对光源
传播方向
电场矢量逆时针转动
入
圆二色性（ CD， circular dichroism）
旋光物质对左、右圆偏振光吸收不同，导致振幅变 化，从而产生椭圆偏振光的现象。
蛋白质空间结构国内外研究动态
在国际上,美国首先提出大规模测定蛋白质结 构的计划,现在已经进入第二期的产出阶段. 其他发 达国家(欧盟和日本)也相继启动自己的结构基因 组计划. 我国根据美国第一期的试验计划,发现X射线晶 体学仍然是测定结构的主要手段,这与预期的结果相符. 过去和现在情况都是这样,蛋白质结构数据库中的80% 的结构来自X射线衍射. 其他有重要贡献的手段有核磁 共振和低温冷冻电镜( cryo2EM). 由于这三种方法的 重要性,最近几年,它们都有很大的改进.
（五） 扫描隧道显微技术（STM， scanning tunneling microscope）：
STM的工作原理：
▪ 扫描隧道显微镜的工作原理是基于 量子力学中的隧道效应。对于经典 物理学来说，当一个粒子的动能E 低于前方势垒的高度V0时，它不可 能越过此势垒，即透射系数等于零 ，粒子将完全被弹回。而按照量子 力学的计算，在一般情况下，其透 射系数不等于零，也就是说，粒子 可以穿过比它能量更高的势垒，这 个现象称为隧道效应。
蛋白质的一级结构及分析
多肽具有特征性的氨基酸 组成，多肽或蛋白质以酸 水解产生游离-氨基酸 的混合物。当完全水解时 ，每一种类型的蛋白质产 生一种特征性的氨基酸比 例或混合物。20种氨基酸 几乎从不以相同的比例出 现在一个蛋白质中，有高 有低，甚至有的只出现一 次或根本不出现。
蛋白质的结构层次
1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出 蛋白质的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： α螺旋，β折叠 tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体
• 多肽与蛋白质有时混用，但一般将分子量在10000以 下的称为多肽。
• 肽或蛋白质的水解是耗能的，由于高的活化能，水 解很慢，蛋白质的肽键非常稳定，多数胞内条件下 的半衰期为7年。
肽键就是一个氨基酸的α-羧基与另一 个氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的键
水解
缩合
氨基酸连接成肽链后，由于氨基酸之间通过一个氨基酸的 氨基与另一个氨基酸的羧基缩合脱水，肽链上的一个氨基酸单位 被称为残基（residue），带有游离-氨基的一端被称为氨基（末） 端（或N端），带有游离-羧基的一端被称为羧基（末）端（或 C端）。
received Nobel Prize in Chemistry in 1958.
• In 1965, he developed the chain termination method, also known as the "Sanger method." He later received another Nobel Prize in Chemistry in 1980 "for contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids."
第二节蛋白质一级结构的测定方法
蛋白质序列测定的基本战略和步骤
一 蛋白质序列测序的基本战略 1、直接法（测蛋白质的序列） 对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，
但目前只能测60个N端氨基酸。 2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列） 蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（database or
各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子交 换树脂，结合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸自 动分析仪的记录上可以看出：天冬氨酸（pI为2.98） 最先随洗脱液下来，赖氨酸（pI为9.74）最后下来， 三个中性氨基酸如:甘氨酸（pI为5.97）、苏氨酸 （pI为6.53）和亮氨酸（pI为5.98）洗脱的顺序又如 何呢? 苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结合比 较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，减 弱了树脂对氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮 氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸侧 链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。
（2）C-末端分析
A.肼解法
无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸 留在上清中。 Gln（谷氨酰胺）、Asn（天冬酰胺）、 Cys（半胱氨酸）、Arg（精氨酸）不能产 生游离的羧基末端aa。
（2）C-末端分析 B.羧肽酶水解法
羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根 据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。 应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学 实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放 出的氨基酸主要是C末端氨基酸。
氨肽酶法
氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链 的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应 时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和 数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作 动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残 基顺序。
蛋白质一年级结构的测定方法
蛋白质一年级结构的测定方法集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-蛋白质一级结构的测定1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量2.拆分蛋白质分子的多肽链非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍共价二硫桥：氧化剂或还原剂3.断开多肽链内的二硫桥过甲酸氧化法常用试剂过甲酸巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解酸水解：常用hcl,水解后除去碱水解：用于测定色氨酸含量。
很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。
5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端N-末端分析：①二硝基氟苯DNFB②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。
常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）C-末端分析：①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。
反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。
肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。
羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro外任一C末端残基的肽键。
Y可以作用于任何一个C末端残基6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套①酶裂解法：肽链内切酶。
胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定的步骤
蛋白质一级结构测定是指通过分子生物学手段，对蛋白质分子的原子结构进行详细分析并揭示其各个部分之间的相互作用及其在蛋白质结构中的位置和结构的研究。
它是确定蛋白质的结构的基本步骤，也是蛋白质结构分析的重要环节。
蛋白质一级结构测定的步骤包括：
第一步：样品准备。
首先要准备一定量的蛋白样品，蛋白样品的质量越好，结果越准确。
常用的样品准备方法有：水解、沉淀、纯化和提取。
第二步：结构图谱分析。
在样品准备好之后，就可以进行结构图谱分析，以检测蛋白质的一级结构。
主要的结构图谱分析方法有：X射线衍射、磁共振波谱、紫外光谱和电泳。
第三步：原子模型构建。
在结构图谱分析完成之后，就可以根据图谱分析的结果，构建蛋白质的原子模型，即把蛋白质中不同原子的位置及其之间的相互作用关系等信息还原到原子模型中。
第四步：模型精度评估。
当构建完原子模型之后，就可以对模型进行精度评估，也就是把原子模型与实际情况进行比较，看模型是否能够准确反映实际情况。
第五步：结构可视化。
在模型精度评估完成之后，就可以使用可视化软件将蛋白质的原子模型可视化，使得人们可以直观地观察蛋白质的原子结构。
第六步：结构分析和总结。
在蛋白质的原子模型可视化完成之后，就可以对蛋白质的原子结构进行分析，比如对模型中的原子以及原子之间的相互作用关系、结构偏移等进行分析，并对这一分析结果进行总结归纳，从而揭示蛋白质的一级结构。
以上就是蛋白质一级结构测定的六个步骤，在蛋白质结构分析中，蛋白质一级结构测定是最基础也是最重要的一步，只有把这一步做对了，才能够确保蛋白质的结构分析的准确性和可靠性。
蛋白质一级结构的测定
其他裂解肽的方法：
A：部分酶分解法：0.1N HCl在110度或6N HCl 在37度水解，但特异性不强，因此对大片段和 肽均不适用； B：羟胺法：反应机理是通过羟胺作用，先形成 一个琥珀酰亚胺环状物然后导致肽键的裂解。 羟胺专一性的裂解Asn-Gly的肽链，产率可达 70%以上。但酸性条件下切割Asn-Pro； C： 稀酸切割Asp-Pro肽键：蛋白质中Asp-Pro键 对酸不稳定； D：Cleavage at Trp resides by oiodosobenzoine acid (亚碘酰基苯甲酸）产率： 70%-100%
多肽的专一性降解（specific cleavage of
大于20的多肽一般需要预先进行降解，尽管目 前的测序可以一次测定60-70氨基酸残基，但 由于氨基酸组成、纯度、产率等因素的影响这 种几率比较少。多肽的降解不外于化学法和酶 法俩种。 1 化学法（大片段）
A:Cyanogen bromide (CNBr) 它选择性的切断Met残 基的羧基侧肽链，将Met转化为高丝氨酸（Homoser) 和高丝氨酸内酯(Homoserine lactone)。 在氨基酸组成分析时高丝氨酸和高丝氨酸内酯相距甚 远。高丝氨酸在丝氨酸之后，而高丝氨酸内酯在组氨 酸之后。计算时可将高丝氨酸和高丝氨酸内酯相加， 计算甲硫氨酸的量。 the protein）
• 蛋白质高级结构研究需要一级结构的知识; 蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构 如:牛胰核糖核酸酶的复性实验 基因工程中包涵体的问题 • 蛋白质一级结构与分子进化的关系; 细胞色素C是广泛存在于需氧生物线粒体呼吸链中 的起传替作用的一种蛋白质通过它可以绘出生物进 化树,一般在进化树位置相距越远,则氨基酸的顺序 差别越大. • 一级结构与遗传病(分子病); 镰刀状细胞贫血症中的血红蛋白(HbS),他仅是β -链 上第六号的Glu变为Val ，从而导致生物功能上的巨 大差异
概述测定蛋白质一级结构的基本步骤
概述测定蛋白质一级结构的基本步骤蛋白质可是个神奇的东西呀！就像我们生活中的一个小秘密，要想揭开它的神秘面纱，了解它的一级结构，那可得一步步来。
首先呢，得把蛋白质从它所在的环境中分离出来，这就好比从一堆杂物中找出我们想要的宝贝。
然后，对它进行纯化，把那些杂质都去掉，让它变得纯净纯净的，就像把宝石打磨得亮晶晶的。
接下来，就是关键的一步啦，测定它的分子量。
这就好像要知道一个人的体重一样，得有个准数呀！可以用一些专门的方法，比如凝胶过滤或者质谱法啥的。
然后呢，把蛋白质切成小小的片段。
这就像是把一个大蛋糕切成小块，这样我们才能更好地研究它呀。
这一步可以用一些酶或者化学试剂来帮忙。
再之后呀，对这些小片段进行分析。
哎呀，就像我们仔细观察每一块小蛋糕，看看它们都有啥特点。
可以用各种方法，比如氨基酸分析呀，或者测序啥的。
最后呢，把这些小片段的信息整合起来，就像拼图一样，把它们拼成一个完整的画面。
这样，我们不就知道蛋白质的一级结构啦！
你想想看呀，这就好比我们要了解一个人的故事，得从他的点点滴滴开始拼凑，最后才能知道他完整的经历。
测定蛋白质一级结构不也是这样嘛！这可是个精细的活儿呢，需要我们耐心又细心地去做。
要是不这么一步步来，那可就像没头苍蝇一样乱撞啦，怎么能揭开蛋白质的神秘面纱呢？所以呀，这每一步都很重要，都不能马虎呢！我们得认真对待，才能真正了解蛋白质的奥秘呀！你说是不是这个理儿呢？
总之呀，测定蛋白质一级结构虽然有点复杂，但只要我们按照这些基本步骤来，一步一个脚印，就一定能成功的啦！让我们一起加油，去探索蛋白质的神奇世界吧！。
蛋白质分子基础蛋白质一级结构测定
Ala ·Phe·Gly·Lys +Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val
因此，得到蛋白质的序列为：
Ala ·Phe·Gly·Lys ·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val
二硫键的确定
蛋白质用胃蛋白酶充分处理
（b）Sanger试剂处理得DNP-Ala。 （c）胰蛋白酶处理得Ala，Arg，Thr 和 Leu，Met，Phe，2Val。当以
Sanger试剂处理时分别得到DNP-Ala和DNP-Val。 （d）溴化氰处理得 Ala，Arg，高丝氨酸内酯，Thr，2Val，和 Leu，
Phe，当用Sanger试剂处理时，分别得DNP-Ala和DNP-Leu。
缺点：
不容易彻底水解，也许回收率。 蛋白酶自身溶解的产物也会污染水解的氨基酸混合物。
氨基酸的分离与含量测定
特殊氨基酸的测定
色氨酸的测定
紫外吸收法 Trp与Tyr在280nm附近的光吸收成一定比
例，可用方程计算出Trp的含量：
Trp ＝ (A288Tyr*1280) －(A280Tyr*385)
↓ 点样、滤纸中央 PH6.5 第一向电流
↓ 肽段按大小及电荷分开
↓ 滤纸暴露在过甲酸蒸汽中（－S－S－断裂）
↓ 含二硫键肽段被氧化成氧化成 一对含半胱氨磺酸的肽
↓滤纸旋转90 PH6.5第二向电流
↓ 含半胱氨磺酸的成对肽段负电荷
↑↓ 偏离对角线
↓ 茚三酮 AA顺序分析
↓ 确定二硫键的位置
由下列信息求八肽的序列。 （a）酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val
蛋白质的一级结构(共价结构)
1.蛋白质的一级结构（共价结构）蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
2.蛋白质结构层次一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）↓是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序二级结构↓超二级结构↓构象（高级结构）结构域↓三级结构(球状结构)↓四级结构(多亚基聚集体)3.一级结构的要点．4.蛋白质测序的一般步骤祥见 P116（1）测定蛋白质分子中多肽链的数目。
（2）拆分蛋白质分子中的多肽链。
（3）测定多肽链的氨基酸组成。
（4）断裂链内二硫键。
（5）分析多肽链的N末端和C末端。
（6）多肽链部分裂解成肽段。
（7）测定各个肽段的氨基酸顺序（8）确定肽段在多肽链中的顺序。
（9）确定多肽链中二硫键的位置。
5.蛋白质测序的基本策略对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。
6. 直接法（测蛋白质的序列）两种以上特异性裂解法 N CA 法裂解 A1 A2 A3 A4B 法裂解 B1 B2 B3 B4用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。
7. 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）核酸测序，一次可测600-800bp8. 测序前的准备工作9. 蛋白质的纯度鉴定纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。
（两种以上才可靠）⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带⑵DNS —cl （二甲氨基萘磺酰氯）法测N 端氨基酸10. 测定分子量用于估算氨基酸残基n=方法：凝胶过滤法、沉降系数法11. 确定亚基种类及数目多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：⑴非共价键结合8mol/L 尿素，SDS SDS-PAGE 测分子量⑵二硫键结合过甲酸氧化：—S —S —+HCOOOH → SO 3Hβ巯基乙醇还原：举例:： 血红蛋白 (α2β2)（注意，人的血红蛋白α和β的N 端相同。
）分子量： M拆亚基： M 1 、M 2 两条带拆二硫键： M 1 、M 2 两条带分子量关系： M = 2M 1 + 2M 212. 测定氨基酸组成主要是酸水解，同时辅以碱水解。
生物化学 第2章 蛋白质(2)
目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:
1 3 材料的选择； 蛋白质初步提纯；
2 组织匀浆的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；
5 目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白 质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋 白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质 特定的折叠结构受到破坏。
600g,3 min.上清 沉淀：细胞核 6000g,8 min.上清 沉淀：线粒体，叶绿体， 溶酶体，过氧化酶体 沉淀：细胞质膜，高尔基 体和内质网膜的碎片 沉淀：核糖体亚基
40000g.30 min.上清 100000g.90 min.上清
细胞液
平衡密度梯度离心： 用不同的离心速度、依据被分离物的密度而进 行分离的效果；通常是将没有纯化的物质铺在密度 溶液（如蔗糖溶液，氯化铯溶液为介质，离心管内 的溶液密度从底部到顶部是浓至稀的梯度）的顶层， 通过离心（160000g，3h）细胞内各成分不停地下 沉分别达到与溶液的密度相等时的位置。其介质的 密度范围宽于被分离组分的密度。
二 蛋白质一级结构测定 蛋白质测序的一般步骤：
首先目标蛋白质分离纯化得到高度纯净的蛋白质 样品。 （1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目，末端分析， 分析多肽链的N末端和C末端。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。断裂链内二硫键。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成，酸水解或碱水解。 （4） 多肽链部分裂解成肽段，专一性酶解。 （5） 测定各个肽段的氨基酸顺序。 （6） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （7） 确定多肽链中二硫键的位置。
（五）电泳后的蛋白质检测：
考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据 考马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。 对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的 分离情况；如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋 白质的色带切下之后进行脱色,测定脱色液光吸收值,能对 该蛋白质进行定量分析。
专业课生物化学蛋白质2-一级结构
第二节（一） 蛋白质测序的策略
测 确定aa残基的数 目或分子比，如： 测 定 完全水解 H残基2个，O残 拆断 定 多 基3个等 A法裂解+测序 裂 分 多 肽 确定中间次序 HOW+THO+OU+SER+LA 二 HOWTHOOUSERLA 多 肽 链 HO+WT+HOO+USE+RLA B法裂解+测序 肽硫 链 链 键 组 分析N末端和C末端 N末端为H, C末端为A 数 成 目 使多肽链完全打开 aa
偶联
环化断裂
ATZ(不稳定中间产物)
转化
此方法还可以用来测 定氨基酸顺序。
N末端分析（四）
氨肽酶法 方法：
氨肽酶是肽链外切酶(外肽酶)，能从多肽链的N端 逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放 的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力 学曲线，就能知道该蛋白质的N末端残基顺序。 缺点：
•主要的化学键
肽键，二硫键
一级结构是蛋白质空间构象和特异生 物学功能的基础。
肽链间/内的连接——二硫键：
-OOC-CH-CH
+NH 3
-SH + HS-CH2-CH-COO2
-HH
+NH 3
-OOC-CH-CH
+NH 3
-S S-CH2-CH-COO2
+NH 3
二硫键
胱氨酸
二硫键的连接种类有多 种。可以稳定肽链空间 结构；赋予肽链一定生 物活力。
胰岛素全合成： 带保护基的21肽和30肽衍生物分别用Na-液NH3处 理后，用连四硫酸钠和亚硫酸钠进行S-磺酸化，经初步 提纯后得到21肽和30肽的SS03- 衍生物。A链和B链按1.2： 1.0混合，以巯基乙酸还原，然后在空气中氧化。
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蛋白质一级结构 的测定
一、蛋白质一级结构定义(primary structure)
在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成
进行排列，并进一步折叠成特定的空间结构前者我
们称为蛋白质的一级结构，也叫初级结构或基本结
构。
核心：蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序,包 括二硫键的位臵。 意义：是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋 白质生理功能的必要基础。
（1）N-末端测定 C.二甲基氨基萘磺酰氯法
在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰 氯DNS-Cl）可以与N-端氨基酸的游离氨基 作用，得到丹磺酰-肽。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性 质，检测灵敏度可以达到110-9mol。
氨肽酶法
氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链 的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应 时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和 数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作 动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残 基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以 亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。
3）氨基酸组成分析 ②离子交换层析法
离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生 离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱 的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中 存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的 离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子 交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。 固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相 互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相 的运动而运动，最终实现分离。
PDB(Protein Data Bank):蛋白质结构数据库 PDB 原来有由美国Brookhaven 国家实验室负 责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学 研究的需要，1998年由美国国家科学基金委员会、 能源部和卫生研究院资助，成立结构生物学合作 研究协会（Research Collaboratory for Structure Bioinformatics,RCSB） PDB由 RCSB 管理。 PDB是目前最主要的蛋白质分子结构数据库
2）末端分析
（2）C-末端分析
A.肼解法
无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸 留在上清中。 Gln（谷氨酰胺）、Asn（天冬酰胺）、Cys （半胱氨酸）、Arg（精氨酸）不能产生游 离的羧基末端aa。
（2）C-末端分析 B.羧肽酶水解法 羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根
明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对比
之下，关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸
迅速。
(GC MS)等方法的相继出现。
使结构分析的速度也显著加快。至今已完成近千种
蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少， 而且工作人员也大大减少。 当年Sanger分析胰岛素用了整整十年的时间，今天 运用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右的蛋
及测定的一般步骤
蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多 肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以 及－S－S－定位等。
蛋白质测序的一般步骤
（1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。 （3） 断裂链内二硫键。 （4） 分析多肽链的N末端和C末端。 （5） 测定多肽链的氨基酸组成。 （6） 多肽链部分裂解成肽段。 （7） 测定各个肽段的氨基酸顺序 （8） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （9） 确定多肽链中二硫键的位臵。
各种氨基酸侧链基团的性质对于氨基酸与离子 交换树脂，结合的情况有相当复杂的影响。在氨基酸 自动分析仪的记录上可以看出：天冬氨酸（pI为2.98） 最先随洗脱液下来，赖氨酸（pI为9.74）最后下来， 三个中性氨基酸如:甘氨酸（pI为5.97）、苏氨酸 （pI为6.53）和亮氨酸（pI为5.98）洗脱的顺序又如 何呢? 苏氨酸应当带有较多的正电荷，与树脂结合比 较紧，不易被洗脱下来，但是由于羟基具有极性，减 弱了树脂对氨基酸的吸引力。所以反而比甘氨酸和亮 氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸侧 链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。 综上所述：影响离子交换树脂分离氨基酸的因 素： （1）氨基酸分子所带的电荷； （2）氨基酸分子的极性； （3）氨基酸分子的形状和大小。
稳定SH基的方法：
（B）氨乙基化
非共价结合 尿素， SDS-PAGE，盐酸胍， 高浓度 的盐
2）末端分析
（1）N-末端测定 A. 二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)
（1）N-末端测定 B.氰酸盐法
异硫氰酸苯酯（PTC或PITC）与N末端的 α－氨基发生的反应，生成PTC－钛,在弱 酸中自发环化转变成PTH－衍生物。该试 剂称为Edman试剂。 由于PTH－衍生物从多肽链上脱落下来 对其余部分没有影响，所以常用来测定蛋 白质的一级结构。
氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的方法
若要测定某蛋白质样品的氨基酸组成，事先 把样品经酸水解，调节水解液的pH为3，使所有的 氨基酸都带负电荷，由于各种氨基酸侧链基团的 复杂性，各种氨基酸所带的电荷强度差异比较大， pH3时,对于酸性氨基酸来说虽然也带正电荷，但 由于谷氨酸γ-羧基和天冬氨酸的β-羧基，都有 不同程度的离解，导致整个分子偏中性，对于碱 性氨基酸来说，本来结合质子的能力就很强，此 时，它所带的正点荷强度就更大。 酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺 转变为相应的谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果 好，在洗脱过程中，使用不同pH和离子强度的洗 脱液。经氨基酸自动分析仪洗脱下来的氨基酸， 按顺序进行染色，由记录仪自动描绘出各种氨基 酸的光吸收图谱。
氨基酸的分离
色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配， 以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物 中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最 终达到分离的效果。 色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流 动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之 间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不 相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分 在固定相上相互分离。根据物质的分离机制，又 可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、 凝胶色谱、亲和色谱等类别。
据酶解的专一性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。
应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶的动力学 实验，以便选择合适的酶浓度及反应时间，使释放 出的氨基酸主要是C末端氨基酸。
羧肽酶法
羧肽酶A： 除Pro、Arg（精氨酸）、Lys （赖氨酸）外的所有C端氨基酸 羧肽酶B：只水解Arg、Lys
羧肽酶 法测 C 末端
氨基酸的分离和含量测定
氨基酸的颜色反应： 紫色在 570nm比色 茚三酮与 Pro生成 黄色产物， 在440nm 比色
层析
基于不同物质在流动相和固定相之间的分 配系数不同而将混合组分分离的技术。当 流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固 体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组 分沿固定相移动的速度不同而分离。能用 于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。
C-末端分析 C. C-端氨基酸选择性氚标记法： 使用氚标记是测定C-端氨基酸最好的办法， 专一性强，灵敏度高，但是这种方法不能用于C端脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp） 还原法：利用硼氢化锂将C-端氨基酸还原成 －氨基醇。然后碱多肽水解，用色谱法鉴定 －氨基醇的类别。
3）氨基酸组成分析
酸水解
白质只需要几天，可见新技术的应用和发展对科学
发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的综 述及专著文献较多。
三 测定前的准备工作
测序前的准备工作：
蛋白质的纯度鉴定
要求：纯度97%以上，均一。 鉴定方法：
测定蛋白质的分子量
估算氨基酸残基数，确定肽 链数 ⑴ 聚丙烯酰 胺凝胶电 泳 (PAGE) 要求一条带 ，双向电泳。 方法： SDS-PAGE，凝胶过 滤法，沉降系数法 ⑵ DNS—Cl （二甲氨基萘 磺酰氯）法测N端氨基酸。 (3) 亲和层析 (4) western 印迹法等
①薄膜层析
将多肽链完全酸水解成游离氨基酸，
然后进行Dansyl标记，聚酰胺薄膜层析，
此方法在蛋白质结构分析中是一种超微量
的分析术，但此方法用于定量分析尚不够
准确。
②氨基酸自动分析仪就是利用离子交换的 方法
离子交换色谱法：利用离子交换原理和液 相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和 阴离子的一种分离分析方法，利用被分离 组分与固定相之间发生离子交换的能力差 异来实现分离。离子交换色谱主要是用来 分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛 地应用于无机离子的分离，而且广泛地应 用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、 蛋白质等的分离。
蛋白质序列测定的基本战略和步骤
一 蛋白质序列测序的基本战略 1、直接法（测蛋白质的序列） 对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端， 但目前只能测60个N端氨基酸。 2、间接法（测核酸序列推断氨基酸序列） 蛋白质化学家收集的一个蛋白质资料库（database or databank）可以在Altas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff,M.O.ed. 1972-1978,Vols 1-5, Washington,DC:National Biomedical Researsh Foundation)中找到。然而现在大多数蛋白质序列 信息都 是从基因核苷酸序列（经过密码子）翻译成氨基酸序列的。
一级结构的测定方法
1. 多肽链的分离
1）肽链的拆开
蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共
价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多 肽链，采用的化学处理方法有：
①过甲酸氧化
②巯基乙醇还原
③ Cleland‘s试剂的还原作用
稳定SH基的方法：
（A） 烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物
常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸（磺酸）在 105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。近年来 用4 mol/L的甲基磺酸代替盐酸，效果比较好，被广泛应 用。