第三章 蛋白质-B(2013)

In-gel digestion with trypsin
Specific Protein spot
Peptides
Acquired MS spectrum
(B) The MS Spectrum is then searched against theoretical mass spectra produced by computer-generated cleavage of proteins in the database
③ 第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键
④ C1α 与C4α 之间距离小于0.7nm ⑤ 多数由亲水氨基酸残基组成。
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无规则卷曲（nonregular coil）
无 规 则 卷 曲 示 意 图
（三） 蛋白质的超二级结构
超二级结构（ supersecondary structure ）
三 蛋白质的三级结构
● 整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的 基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。 ● 三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。
三级结构有以下特点：
许多在一级结构上相差很远的aa在三级结构上相距很近。
球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋 白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基 团间的相互作用成为可能。 大的球形蛋白(200aa以上)，常常含有几个结构域，
Protein in Database
Predicted peptides From hypothetical Trypsin treatment
Predicted MS spectrum
Protein Identification by MS/MS
Protein separation On gel electrophoresis MS peptide spectrum Specific protein Is excised In-gel digestion with trypsin 678.8
③ 肽段的分离纯化 ★ 电泳法
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
根据分子量大小分离
★ 离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）
根据肽段的电荷特性分离
★ 反相ＨＰＬＣ法
根据肽段的极性分离
★ 凝胶过滤
要求： ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带 ＨＰＬＣ单峰 Ｎ端单一（常用ＤＮＳ－Cl法）
● 肽段序列测定及肽链的拼接
酰胺平面
α-碳原子
非键合原子 接触半径
侧链
酰胺平面
Φ=00，ψ=00
完全伸展的多肽主链构象
Φ=00，ψ=00的多肽主链构象
可允许的Φ和Ψ值
Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在
二面角（Φ 、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻 肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。
Cα 上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ
反平行β -折叠比平行的更稳定
3 β -转角（β -turn）
也称β -回折（reverse turn）、β -弯曲（β -bend）
球状蛋白质分子中出现的180°回折，由第一个aa 残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。 β 转角的特征：
① 由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。 ② 主链骨架以180°返回折叠。
置称为蛋白质的一级结构(primary structure)。这是蛋
白质最基本的结构，它内寓着决定蛋白质高级结构和生物 功能的信息。
例：牛胰岛素的一级结构
（一）
肽和肽键的结构
肽： 一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合 而成的化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。 肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键）， 肽单位：酰胺平面，肽单位间以α-C原子相隔，构成肽链
蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个α －螺旋或β
－折叠或β －转角）组合在一起，形成有规则的、在空间
上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构 基本组合方式：α α ；β ×β ；β β β
超二级结构类型
αα
β ×β
β αβ
β -迂回
βββ
回形拓扑结构
（四）蛋白质的结构域
结构域 domain，motif(模块) 在二级结构及超二级结构的基础上，多肽 链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立的、 近似球形的三维实体。
2
β －折叠（β -pleated sheet）
两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同 肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形 成氢链，这样的多肽构象就是β -折叠片。
（1）氢键与肽链的长轴接近垂直。 （2）多肽主链呈锯齿状折叠构象 （3）侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。 平行式： 所有参与β -折叠的肽链的N端在同一方向。 反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同
Protein ID

1. 通过MS/MS分析确认 2. 搜索到的蛋白质分子量是否与胶上的一致 ? 3. 这个蛋白质是不是来自于你所期望的生物种？ 4. 这个蛋白质的等电点（pI）与你胶上相应 的等电点是否一致？
The protein is excised from a gel, in-gel tryptic digestion, and peptide fingerprinting is then identified by Mass spectrometer
MALDI-TOF analysis
Protein Peptides 678.8 679.3
Selected Parent Ion
MS/MS
Specific protein identified
Database Search
（三）多肽与蛋白质的人工合成
氨基保护：叔丁氧甲酰氯（BOC-Cl）、苄氧酰氯（CBZ-Cl）、 对甲苯磺酰氯Tosyl-Cl）。 羧基保护：苄酯、叔丁酯（成盐、成酯） 羧基活化：酰氯法（PCL5）、叠氮法、混合酸酐法、
（二） 二级结构的基本类型
1 α－螺旋（α－helix）
（1） α 螺旋的一般特征：
★ 多肽主链按右手或左手方向盘绕，形 成右手螺旋或左手螺旋， ★ 相邻的螺圈之间形成链内氢键
★ 构成螺旋的每个Cα 都取相同的二面角 Φ 、Ψ 。
典型的α 螺旋有如下特征：
① 二面角：Φ = -57°, Ψ = - 48°，是一种右手螺旋 ② 每圈螺旋：3.6个a.a残基， ④ 氨基酸残基侧链向外 ⑤ 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中 心轴平行。 高度：0.54nm ③ 每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm
Edman法
A 耦联 PITC ＋ H２N—A-B-C-D pH8—9，40℃ PTC——A-B-C-D B 裂解 无水三氟乙酸（TFA） ATZ—A + H2N—B-C-D C 转化 PTH—A
PTC肽：苯氨基硫甲酰肽 ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸） PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）
2. 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）
A4 B4
基本战略：片段重叠法＋氨基酸顺序直测法
要点：a.测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分
b.测定肽键的N－末端和C－末端 c.应用两种或两种以上的肽键内切酶分别在多肽键的专一位Βιβλιοθήκη Baidu上
断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而
得到一系列大小不等的肽段。 d.分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序 e.将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋
出现顺、反两种构型．
酰胺平面与α-碳原子的二面角（ φ和ψ ）
二面角
两相邻酰胺平面之间，能以共同的Cα为 定点而旋转，绕 Cα-N 键旋转的角度称 φ 角 ，绕 C-Cα键旋转的角度称 ψ角。 φ和 ψ称作
二面角，亦称构象角。
肽链的二面角
★只有α碳原子连接的两个键（Cα—N和Cα-C） 是单键，能自由旋转。 ★环绕Cα—N键旋转的角度为Φ 环绕Cα—C键旋转的角度称Ψ
结构域是球状蛋白的折叠单位 较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。 结构域一般有１００－２００氨基酸残基。 结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构 域之间可以发生相对移动。 结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白 质的总体功能。例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为 NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶 的脱氢功能区。 结构域间的裂缝，常是酶的活性部位，也是反应物的出入口
Steps in protein identification by mass spectrometry
In-gel digestion With trypsin
MS analysis of Peptide fingerprinting
Database Search
m/z Acquired MS spectrum
5肽 名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸 写法： Ｎ Ser-Gly--Try-Ala---Leu C （或ＳＧＹＡＬ）
（二） 一级结构的测定 1.直接法
对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但 目前只能测60个N端氨基酸。 两种以上特异性裂解法 N C A 法裂解 A1 A2 A3 B 法裂解 B1 B2 B3
肽平面
★ 肽键的结构特点：
（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间形成共振杂化体。
（2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。
（3）肽键具有平面性，组成肽键的4个原子和2个Cα几乎 处在同一平面内（酰氨平面）。 （4）肽键亚氨基在pH0---14内不解离。 （5）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能
白质分子的全部氨基酸序列。
● 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化
① 化学裂解法
—Met—X— 产率85%
溴化氰
②
酶法裂解 Lys —— X Arg —— X Tyr——X Phe——X (X ≠ Pro) (X ≠ Pro) Trp——X
★ 胰蛋白酶 ★ 胰凝乳蛋白酶
★ 胃蛋白酶
Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)
3. 质谱法（Mass spectrometry-MS）
样品在质谱仪的离子源中通过一定的方式发生电离， 形成带电的分子或分子碎片，再借助电场或磁场的作用 使这些离子依质荷比（m/z）的不同获得分离，并按质荷
比大小为序冲击检测器，从而得到质谱图，对样品进行
鉴定。
1886年发明质谱仪的离子源，1942年第一台商品化质谱 仪问世，分析对象主要是小分子。20世纪80年代电离质谱技 术-电喷雾电离质谱（ESI-MS）和基质辅助激光解吸电离飞行 时间质谱（MALDI-TOF）两项技术使质谱技术发生了革命的 变革，质谱技术真正走入了生命科学的研究领域。
⑥ 肽键上C=O氧与它后面（C端）第四个残基上的N-H
氢间形成氢键。
（2） R侧链对α—螺旋的影响
① 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基, (如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成稳定的α —螺 旋。如多聚Lys、多聚Glu。
② Gly在肽中连续存在时，不易形成α —螺旋。
③ R基大（如Ile）不易形成α —螺旋 ④ Pro、脯氨酸中止α —螺旋。 ⑤ R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α —螺旋的形 成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α —螺旋。
第三节 蛋白质的结构
蛋白质分子的构象与结构层次
蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。 一级结构： 氨基酸顺序 二级结构： α螺旋、β折叠、β转角，无规卷曲 三级结构： α螺旋、β折叠、β转角、松散肽段 四级结构： 多亚基聚集
一级结构
primary structure
蛋 白 质 结 构 的 主 要 层 次
活化酯法。
缩合剂： DCCI（二环己基碳二亚胺）直接接肽
二 蛋白质的二级结构
蛋白质的二级结构（secondary structure）指肽链
主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主
轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象 单元．
（一） 相邻肽键的空间结构
肽单位与α -碳原子的二面角
二级结构
secondary structure 超二级结构 supersecondary structure 结构域 Structure domain Tertiary structure
三级结构
四级结构
quariernary structure
一 蛋白质的一级结构
多肽链中氨基酸的连接方式和排列顺序，包括二硫键的位