生化方法学及仪器应用

生化方法学及仪器应用

生化检测方法及仪器应用

两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。

终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。

一、常用生化检测项目分析方法举例

1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。（两点法）

3．连续监测法（速率法）对于酶活性测定一般应选用连

点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。

3．反应温度一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃。

4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长。

5．次波长次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长。

6．反应方向反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应。

7．样品量样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl，以0.1μl步进，个别分析仪最少能达到1.6μl。可设置常量、减量和增量。

8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl，以1μl步进。

9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl，以1μl步进。

10．总反应容量总反应容量（total reacting volum）在不同的分析仪有一个不同的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl。总反应容量太少无法进行吸光度

测定。

11．孵育时间孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间。12．延迟时间延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间。

13．连续监测时间连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，不少于4个吸光度检测点（3个吸光度变化值）。

14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采用一个校准液（calibrator）；线性好但不通过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液。每一个校准液都要有一个合适的浓度。

15．校准K值或理论K值通过校准得到的K值为校准K 值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值。16．线性范围即方法的线性范围（linearity range），超过此范围应增加样品量或减少样品量重测。与试剂/样品比值有关。

17．小数点位数检测结果的小数点位数（decimal point digit）。

（二）备选分析参数

这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能不准确。

1．样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，便可在分析前自动对样品进行高倍稀释。

2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限。若低于此限时底物已太少，不足以维持零级反应而导致检测结果不准确。

3．前区检查免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩。将终点法最后两个吸光度值的差别（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，表示已有抗原过剩，应稀释样品后重测。

4．试剂空白吸光度范围超过此设定范围表示试剂已变质，应更换合格试剂。

5．试剂空白速率连续监测法中使用，是试剂本身在监测过程中没有化学反应时的变化速率。

6．方法学补偿系数用于校准不同分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数。

7．参考值范围对超过此范围的测定结果，仪器会打印出提示。

（三）某些参数的特殊意义

1．最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。一般分析仪的最小样品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围不同）的上限得以扩大。

2．最大试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操作时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L。此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低。因此对这类检测项目最大试剂量非常重要。

3．弹性速率在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大。如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低成本。

4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰。因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境