RT-PCR实验报告课件

逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr （reverse transcription pcr）和实时pcr （real time pcr ）共同的缩写。

逆转录pcr ，或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr) ，是聚合酶链式反应(pcr) 的一种广泛应用的变形。

在rt-pcr 中，一条rna 链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr 进行dna 扩增。

由一条rna 单链转录为互补dna(cdna) 称作“逆转录”，由依赖rna 的dna 聚合酶（逆转录酶）来完成。

随后，dna 的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna 的dna 聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr 。

原先的rna 模板被rna 酶h 降解，留下互补dna。

rt-pcr 的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna 。

rt-pcr 广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna 的含量。

（检测基因表达的方法，参见northern blot 法。

）rt-pcr 有时候也会指代实时pcr(real-time pcr) 。

为了与逆转录pcr 相区别，通常被写作“定量pcr ”(quantitative pcr) 或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr) 。

实时pcr实时pcr(real-time pcr) ，属于定量pcr （q-pcr ）的一种，以一定时间内dna 的增幅量为基础进行dna 的定量分析。

real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。

一种是在ds dna 中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna 序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe ）。

real time pcr 与reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna 来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。

这两种rt pcr 的组合又被称之为“定量rt-pcr （quantitative rt-pcr ）”rt-pcr 技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna 引物amv （m-mlv）：逆转录酶dntp ：脱氧核苷酸rnase ：rna 酶抑制剂pcr buffer ：rt-pcr 缓冲液mgcl2 ：2 价镁离子pcr 各步骤的目的（一）预变性：破坏dna 中可能存在的较难破坏的二级结构。

使dna 充分变性，减少dna 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的dna 模板，最好不要吝啬这个步骤。

此外，在一些使用热启动taq 酶的反应中，还可激活taq 酶，从而使pcr 反应得以顺利进行。

（二）变性-- 退火-- 延伸循环：①模板dna 的变性：模板dna 经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna 双链或经pcr 扩增形成的双链dna 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna 与引物的退火( 复性) ：模板dna 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板dna 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：dna 模板-- 引物结合物在taqdna 聚合酶的作用下，以dntp 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复制链。

（三）pcr 仪扩增循环后72 度延伸10 分钟用pcr 仪扩增时,( 变性. 退火, 延伸) 循环完成后, 继续72 度延伸了10 分钟的原因：1. 延伸时间取决于待扩增dna 片段的长度。

（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqdna 聚合酶，72 度时的碱基掺入率为35-100bp/s ，因此延伸速率为1kb/min 。

2. 根据延伸速率推得，扩增1kb 以内的dna 片段1min 即可，而3-4kb 则需要3-4min ，依次照推。

通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min ，这样做是使pcr 反应完全以提高扩增产量。

3. 继续72 度延伸了10 分钟除了可以使pcr 反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq 酶进行pcr 扩增时在产物末端加 a 尾的作用，可以直接用于ta 克隆的进行。

什么是半定量pcr半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction ,sqrt-pcr ）是近年来常用的一种简捷、特异的定量rna 测定方法，通过mrna 反转录成cdna，再进行pcr 扩增，并测定pcr 产物的数量，可以推测样品中特异mrna 的相对数量。

以半定量rt-pcr 为基础建立起来的mrna 含量测定技术，较含内标化的rt-pcr 定量测定的mrna 的方法更为简便可行。

这种方法不另设‘内标准, 排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。

步骤： 1. 抽提rna，2. 反转录获得cdna，3. 以cdna 为模板做pcr 注意：步骤1，rna 抽提质量一定要好，注意污染。

内参的选择，常用的有βactin 和gapdh 俩中。

步骤3，半定量rt-pcr 应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！半定量rt-pcr 与荧光定量real-time pcr 最大的区别就在于semi-pcr 需要跑电泳根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低而real-time pcr 则无需电泳可以实时监测整个pcr 的全程并且由给出的ct 值及standard curve 来判断gene 拷贝数的高低。

所以由上可见semi-pcr 不如real-time pcr 精确。

至于rt 应该指reverse transcription 。

为了便于区分我们更偏好使用qpcr 来特指real-time pcr同时要注意realtime-pcr 的定性问题，有时候你扩增出来的很有可能只是引物二聚体。

所以要利用melting curve ，如果是第一次做一个目的基因的realtime-pcr ，还是要在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定与你要扩增的目的基因大小一致。

rt-pcr 只能通过模板pcr 后扩增的结果间接的反应初始模板的量。

而realtime-pcr 的结果直接可以看到初始模板的量。

所以，realitime-pcr 更精确些。

篇二：rt-pcr 实验方法逆转录pcr (rt-pcr)实验四逆转录pcr (rt-pcr) 【实验目的】1．了解用逆转录pcr 法获取目的基因的原理。

2．学习和掌握逆转录pcr 的技术和方法。

【实验原理】聚合酶链式反应（pcr ）过程利用模板变性，引物退火和引物延伸的多个循环来扩增dna 序列。

因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，是一个指数增实验四逆转录pcr (rt-pcr)【实验目的】1 ．了解用逆转录pcr 法获取目的基因的原理。

2 ．学习和掌握逆转录pcr 的技术和方法。

【实验原理】rt-pcr 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异，细胞中rna 病毒的含量和直接克隆特定基因的cdna 序列。

rt-pcr 比其他包括northern 印迹、rnase 保护分析、原位杂交及s1 核酸酶分析在内的rna 分析技术，更灵敏，更易于操作。

rt-pcr 的基本原理（图 4.1 ）。

首先是在逆转录酶的作用下从rna 合成cdna ，即总rna中的mrna 在体外被反向转录合成dna 拷贝，因拷贝dna 的核苷酸序列完全互补于模板mrna，称之为互补dna（cdna）；然后再利用dna 聚合酶，以cdna 第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dntp ）为材料，在引物的引导下复制出大量的cdna 或目的片段。

在rt 时，有 3 种引物可选择（表 4.1) 。

用1）和2）方法，理论上是扩增的所有的cdna，还要用此产物做pcr 的模板继续扩增。

如果用3）方法，先要去/retype/zoom/7b17bdaf89eb172ded63b7a3?pn=2&x=0&y=1268&raww=535&rawh=340&o=png_6_0_0_135_265_601_383_892.979_1262.879&type=pic&aimh=305.04672897196264&md5sum=388ad1889e15cfe390decc00721a2ce0&sign=8ccc656492&zoom=&png=48793-106221&jpg=0-0"target="_blank"> 点此查看由图 4.1 不难看出，随机引物法是三种方法中特异性最低的。

引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cdna。

这种方法经常用于获取 5 末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的rna 模板获得cdna。

为了获得最长的cdna，需要按经验确定每个rna 样品中引物与rna 的比例。

随机引物的起始浓度范围为50 到250ng 每20μl 反应体系。

因为使用随机引物从总rna 合成的cdna 主要是核糖体rna ，所以模板一般选用poly(a)+rna 。

oligo(dt) 起始比随机引物特异性高。

它同大多数真核细胞mrna 3 端所发现的poly(a)尾杂交。

因为poly(a)+rna 大概占总rna 的1 %到2％，所以与使用随机引物相比，cdna 的数量和复杂度要少得多。

因为其较高的特异性，oligo(dt) 一般不需要对rna 和引物的比例及poly(a)+ 选择进行优化。

建议每20μl 反应体系使用0.5 μg oligo(dt) 。

oligo(dt)12-18适用于多数rt-pcr 。

基因特异性引物（gsp）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。

gsp 是反义寡聚核苷，可以特异性地同rna 目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dt) 那样同所有rna 退火。

用于设计pcr 引物的规则同样适用于逆转录反应gsp 的设计。

gsp 可以同与mrna 3 最末端退火的扩增引物序列相同，或gsp 可以设计为与反向扩增引物的下游退火。

已经制备好的双链cdna 和一般dna 一样，可以插入到质粒或噬菌体中，为此，首先必需有适当的接头(linker) ，接头可以是在pcr 引物上增加限制性内切酶识别位点片段，经pcr 扩增后再克隆入相应的载体；也可以利用末端转移酶在载体和双链cdna 的末端接上一段寡聚dg 和dc 或dt 和da 尾巴, 退火后形成重组质粒, 并转化到宿主菌中进行扩增。