5.植物外源基因转化方法及转化子的检测

3.3.2物理法诱导DNA直接转化


物理转化方法是基于许多物理因素对细 胞膜的影响，或通过机械损伤直接将外 源DNA导入细胞。它不仅能够以原生质 体为受体，还可以直接以植物细胞乃至 组织、器官作为靶受体，因此比化学法 更具有广泛性和使用性。 常用的物理方法有电激法、超声波法、 显微注射法和基因枪法。
常用植物基因转化方法特点比较
转化方法 农杆菌法 PEG法 受体材料 完整细胞 宿主范围 有 原生质 体 无 复杂 无 简单 便宜 低 可行 电击法 原生质 体 无 复杂 无 复杂 昂贵 低 可行 微针注射法 原生质体 无 复杂 无 复杂 昂贵 低 可行 基因枪法 完整细胞 无 简单 多 复杂 昂贵 高 广泛 花粉管通道法 卵细胞 有性繁殖植物 无 无 简单 便宜 低 广泛
基因枪法



基因枪法又称微弹射击法。 其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒 或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高 速射入受体细胞或组织。微粒上的DNA进入 细胞后整合到植物染色体上得到表达，从而 实现基因转化。 是继农杆菌介导法之后的第二大基因转化法。 在禾本科作物上应用较广泛。
基因枪转化的操作步骤
共培养
在含有选择压力 的培养基上诱导 细胞分化，形成 转化芽
诱导芽生长
生根，形成 转化植株
3.2病毒介导法




病毒载体是最近新出现的一种用于植物转化的载体“植物 病毒转基因系统是将外源基因插入到病毒基因组中,通过病 毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞。目前正 在研究发展的植物病毒载体系统有3种: 单链RNA植物病毒载体系统,是以单链RNA为模板经反转录 酶作用合成双链的cDNA,将其克隆到质粒或粘粒载体上,把 外源基因插入到病毒的cDNA部分,通过体外转录,将带有外 源基因的病毒DNA感染并进入植物寄主细胞。 单链DNA植物病毒载体系统,是由单链环状DNA分子组成, 一般存在成对的2个病毒颗粒，这种二连基因组可以把外源 基因插入其中1种DNA上而不影响另1种DNA基因组的复制。 双链DNA植物病毒载体系统,是将其病毒基因组中对病毒繁 殖非必需的1段核苷酸序列去掉,换上1小段外源DNA而不影 响病毒基因组正常包装”用这样重组的病毒载体感染植物 细胞以获得外源基因的转移。

PEG介导基因转化 脂质体介导基因转化
PEG介导基因转化

PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鸟氨酸、磷 酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。 PEG通过电荷之间的相互作用,与DNA形成紧密复合物,植 物细胞通过内吞作用吸收这些复合物，一般PEG浓度较低 时,不会对原生质体造成伤害,而获得的转基因植株。 来自同1个细胞,避免了产生嵌合转化体,转化稳定性和重复 性好,容易选择转化体，受体植物不受种类的限制。 但对原生质体培养和再生困难的植物难以利用,且转化率低, 一般在10-5~10-6。 这种方法首先用在模式植物烟草上,转导象Ti质粒那样比较 大的质粒。在添加PEG和外源DNA时,人们已成功地将外源 基因整合到原生质体基因组,并得到表达，利用原生质体的 全能性,目前此种方法已在多种禾谷类作物如水稻，大麦， 玉米及一些双子叶植物中获得了转基因植株。
组培条件 简单 嵌合体比 有 例 操作复杂 简单 性 设备要求 便宜 工作效率 高 单子叶植 少 物应用
4.植物基因转化系统的选择原则




对农杆菌敏感的植物应首先试用农杆菌载体转化系统，因为农 杆菌转化是在理论和技术操作上都比较成熟的转化系统，而且 转化效率高，转化植株的遗传稳定性最好。 原生质体培养容易的植物应该选择直接转化系统，因为其优点 是既能获得高的转化率，又能克服转基因植株嵌合体的难题。 多胚珠植物可试用花粉管通道法，因为涂抹在柱头上的外源 DNA可以随着许多花粉管进入子房，分别导入各卵细胞中，提 高转化率。 子房中有较大单胚珠的植物如核果类植物，宜试用显微注射法， 因为将外源DNA直接注入卵细胞的可能性较大。 转化难度大的植物，即对农杆菌转化不敏感，原生质体培养困 难的植物，应采用基因枪法。 根据供试外植体的特点选择相应的转化方法，如以整体植株为 试材，则应采用注射法和花粉管通道法；以叶片为外植体，则 应用农杆菌载体叶盘法或基因枪法。
根癌农杆菌（Ti质粒）
Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，Ti 质粒具有五个主要功能区域，它们分别是TDNA、质粒转移(plasmid transfer)、冠瘿碱代 谢(opine catabolism)、复制原点(ori)和毒性区 域(vir)。 T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体 上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交界 处的25bp不完全直接重复(imperfect direct repeats)，右端的序列称为右界(right border, RB), 左端的为左界(left border,LB)。T-DNA区 域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基 因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将其它序列 插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至 LB内的序列转移并整合到植物基因组。 Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。
3.3 DNA直接导入基因转化

所谓DNA直接导入转化就是不依赖农杆 菌载体和其他生物媒体，将特殊处理的 裸露的DNA直接导入植物细胞，实现基 因转化的技术。常用的DNA直接转化技 术根据其原理可分为化学法和物理法两 大类。
3.3.1化学诱导DNA直接转化

化学诱导DNA直接转化是以原生质体为 受体，借助于特定的化学物诱导DNA直 接导入植物细胞的方法。目前主要有2 种方法：PEG介导法和脂质体介导法。
3.1农杆菌介导法


农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用 方法。 它是利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 的Ti (Tumer induce)质粒上的一段T-DNA区在农 杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被 转移到植物细胞并插入到染色体基因中。利用Ti 质粒的这一天然的遗传转化特性,可将外源基因 臵换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合 到受体染色体而获得稳定的表达。 迄今所获得的近200种转基因植株中80％以上是 利用根癌农杆菌转化系统产生的。



病毒载体比较小,便于在实验中操作,而且这类载体只 要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细胞,外 源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达。 但是病毒载体的容量有限,不能包装大片段的外源 DNA基因组,寄主范围窄,复制稳定性差,转录和复制机 理复杂。 目前,用的较多的是花椰菜花斑病病毒(CaMV)和番茄 金花叶病毒(TGMV)。此法需要注意的是其他病毒侵 染植株后可能会跟所用的载体病毒之间发生信息交换, 进而导致载体病毒重新获得其致病能力”因此,其潜 在的危害性必须予以足够的重视。



微注射法：一般适合于较大花的农作物 如棉花等。利用微量注射器将基因溶液 注射进入受精子房 柱头滴加：在授粉前后，将转基因溶液 滴加在柱头上 花粉粒携带：即用基因溶液处理花粉粒， 让花粉粒吸入基因，然后授粉。


优点：利用整体植株的卵细胞、受精卵 或早期胚细胞转化DNA，无需细胞、原 生质体等组织培养和诱导再生植株等一 套人工培养过程。方法简便；单、双子 叶植物均可应用；育种时间短。 这一技术局限欲开花时间才能应用；对 DNA大小纯度要求高。机理？

电击法的转化效率与化学法相似。它除 了同样具有PEG原生质体转化的优点外， 还具有操作简便，DNA转化效率高，特 别适于瞬时表达的研究。缺点是造成原 生质的损伤。
超声波介导基因转化


超声波基因转化的基本原理是利用低声强脉 冲超声波的物理作用,击穿细胞膜造成通道,使 外源DNA进入细胞。 操作过程：取无菌的试管苗中部展开的叶片， 切成小块，并在叶片上针刺若干小孔，放入 超声小室中。同时加入5%DMSO缓冲液3ml， 质粒DNA20μg/ml 及鲑鱼精DNA40μg/ml ， 室温下超声处理30分钟。

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靶细胞或组织的预处理 微粒子弹的制备 装备基因枪 轰击 过渡培养 进行筛选培养或直接分化再生植株
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便携式基因枪

基因枪法转化的优点有：

无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感， 限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。 靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细 胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。 操作简单快速
2.植物基因转化的受体


原生质体 悬浮细胞 胚性愈伤组织 胚状体 叶片切块 其它受体：如花、子房、离体条件下的 子叶、胚轴、茎段、根和体细胞胚、花 粉等
3.植物转基因的方法



外源基因的间接转化法（载体介导法） 农杆菌介导法 病毒介导法 外源基因的直接转化法 化学诱导DNA直接转化 物理法诱导DNA直接转化 花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）

植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用 土壤农杆菌的毒性区基因被激活


T-DNA的切割和T复合物生成
T复合物由土壤农杆菌经植物细胞膜进 入植物细胞 T-DNA整合到植物染色体上

农杆菌的 活化
挑单克隆
收集细胞
用液体MS培 养基重悬细 胞
将预培养的 外植体放 入菌液中 侵染
取出外植体在 无菌滤纸上 吸干菌液
第五讲 植物外源基因导入方法 及转化子的检测
1.概述



人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变 异来创造新物种和新品种。但常常存在着杂交 不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在 诱变的非定向性。 植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之 一。它是指用人工分离和修饰过的外源基因通 过载体、媒体或其他物理、化学方法导入植物 细胞中并得到整合和表达，并通过对转化植株 的鉴定选择，从而使其遗传性状发生改变的技 术。创造出人类所需要的新品种或新物种。 外源DNA通过载体介导实现其转化的系统称之 为基因载体转化系统。


超声波所特有的机械作用，热化作用和空化 作用，穿透力大，在液体和固体中传播衰减 小，界面反射造成叶片组织受超声波作用的 面积较大等特点，使得转化效率较高。 该方法有以下优点，操作简单，设备便宜， 不受宿主范围限制，转化率高等。与其他方 法相比具有更大的潜力，但该转化系统尚待 进行深入研究，使之完善。
显微注射介导基因转化



显微注射进行基因转化是一种比较经典的技术， 其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别在动 物细胞或卵细胞的基因转化，核移植及细胞器的 移植方面应用很多，并已取得重要成果。植物细 胞的显微注射在以前使用很少，但近年来发展很 快，并在理论技术上有所创新。 其原理比较简明，是利用显微注射仪将外源DNA 直接注入受体细胞质或细胞核中。显微注射的一 个重要问题是必须把受体细胞进行固定。 转化的成功率高 可以省去选择性标记的麻烦
电激法介导基因转化


电激法是利用高压电脉冲作用在原生质体膜上 “电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促 进外源DNA的摄取。此法在动物细胞中应用较 早并取得很好效果，现在这一方法已被广泛用 于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作 物中更有发展潜力。 电击的处理方式对转化率有着决定性的作用， 有两种不同的处理方式：一种是较低的电压， 处理较长的时间（350V/cm 54s）；另一种是 高电压，短时间处理（1－1.25kV/cm,10s)。一 般常用第二种处理方式。

但该方法转化率低，外源DNA整合机理不清楚。 且形成 多拷贝
3.4花粉管通道法

花粉管通道法是将外源的DNA片段在自 花授粉后的特定时期注入柱头或花柱， 使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转 化受精卵或其前后细胞。这一技术可以 应用于任何开花植物。该方法是有我国 科学家周光宇等（1983）建立并在长期 科学研究中发展起来的。


脂质体介导基因转化


脂质体法是用脂类化学包裹DNA成球体，通过植物 原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。 脂质体是由磷脂组成的膜状结构,用它包装外源DNA 分子,然后与植物原生质体共保温,于是脂质体与原生 质体膜结构之间发生相互作用,而后通过细胞的内吞 作用而将外源DNA导入植物的原生质体 这种方法具有许多方面的优点：包括可保护DNA在 导入细胞之前免受核酸酶的降解作用,降低了对细胞 的毒性效应,适用的植物种类广泛,重复性高,包装在脂 质体内的DNA可稳定地贮藏等。