细胞免疫学技术优秀课件

胞的损伤和部分死亡。因此在冷冻过程要加冷冻保存剂，常
用二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。
1、冷冻保存
将待冻细胞悬液加冷冻保存剂，并配成适当浓度，分装
小管。采用两步降温法，即及时迅速地将其降温至一选择好
的临界低温作为过渡站，如一80℃低温冰箱过夜，或放在液
氮罐液面以上一层空间15~20h，然后再移放或沉入液氮中。
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细胞
密度（kg/m3）
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红细胞
＞1.092
粒细胞
1.070~1.090
淋巴细胞和单核细胞 1.060~1.075
血小板
1.030~1.035
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第一节 细胞的分离技术
一、标本的采取与保存
（三）淋巴细胞及其亚群的分离 1、淋巴细胞的分离 ①玻器吸附法 将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的
（一）外周血白细胞的分离
根据人外周血红细胞与白细胞的比重不同，其沉降 速度随之而异。
1、自然沉降法 利用RBC自然沉降率较快的分离法。
抗凝血于室温或37℃静置30~60分钟，血液即分成明 显的3层：
上层为淡黄色血浆，
紧贴红细胞上面的灰白层为白细胞
底层为红细胞
本法所得的白细胞损伤极轻微。
第一节 细胞的分离技术
第一节 细胞的分离技术
一、标本的采取与保存
（一）血液标本的采取 无菌采血，抗凝 1、机械去纤维蛋白法（玻璃珠法）采血过程中，边采边摇
采血瓶，以使小玻璃珠在血液中滚动，以机械地除去纤维蛋 白，使血液不能凝固。本法虽较麻烦，但本法简便、对淋巴 细胞的活性影响最小，且可减少血小板的混杂。
2、肝素抗凝法 肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，进而 抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，防止血液凝固。
一、标本的采取与保存
（一）外周血白细胞的分离
2、加速红细胞沉降法
利用高分子量的聚合物（明胶）使红细胞凝聚成
串钱状，借以加速红细胞沉降，使之快速与白细胞 分离。
上层富含白细胞
红细胞凝聚成串钱状沉积在底层，
本法的细胞得率比自然沉降法高，但明胶增加白 细胞粘性，对实验有所影响。
源自文库
第一节 细胞的分离技术
第一节 细胞的分离技术
一、标本的采取与保存
（三）淋巴细胞及其亚群的分离 2、淋巴细胞亚群的分离 根据表面的标志不同，建立能选择性纯化所需细胞
的技术。 ①E花环试验 分离T细胞群 ②尼龙毛分离方法 分离T、B细胞 ③亲和层析原理分离淋巴细胞亚群 去除某一细胞群 ④荧光激活细胞分离仪（FACS） 最佳分离方法 磁性微球用于细胞的分离和纯化（MACS技术 ）
细胞免疫学技术
细胞免疫学技术种类
细胞免疫学技术主要是对各种免疫细胞进行 分离、鉴定、计数，并测定其功能。
➢细胞分离技术 ➢免疫细胞表面标志和功能的检测
T细胞表面标志和功能的检测 B细胞表面标志和功能的检测 NK细胞活性的检测 吞噬细胞检测技术
第一节 免疫细胞的分离技术
一、标本的采取与保存 二、细胞分离技术 三、分离标本的保存技术
一、标本的采取与保存
（二）胸腺细胞悬液的制备 【方法】 4周龄健康小鼠，体重14~16g。 （1）小鼠颈椎脱臼处死。 （2）迅速取出胸腺。置于100目钢网上。注意无
菌，洗干净胸腺上的血管。 （3）轻轻研磨，制成细胞悬液。 （4）用台盼蓝染色，计数。活细胞数＞90%。
看视频
第一节 细胞的分离技术
第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测
一、T细胞标志及功能的检测 （二）表面抗原的检测
用单抗检测T细胞表面抗原 方法：标记抗体着染法 抗体致敏花环法
1、间接免疫荧光法 淋巴细胞+抗相应CD的单抗→洗涤→ 再加荧
3、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝法 EDTA为螯合剂，可与血 液中钙离子结合而抗凝。
马、牛、羊等大动物一般从颈静脉采血，猪从颈静脉、前腔 静脉或耳静脉采血，家禽由翼下静脉或心脏采血，兔由心脏 或耳静脉采血，犬由颈静脉或四肢静脉采血，豚鼠由心脏采 血，小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血。
第一节 细胞的分离技术
一、标本的采取与保存 （三）巨噬细胞的采取 1、人巨噬细胞的收集（斑蝥酊敷贴法） 2、小鼠腹腔巨噬细胞的制备
【方法】20-25g小白鼠 （1）小鼠颈椎脱臼处死 （2）腹部消毒，无菌注入肝素-Hanks液 （3）吸出腹腔液，洗涤，计数，调整细胞浓度
第一节 细胞的分离技术
二、细胞分离技术
玻璃平皿内，置37℃ 30 min～40min，用毛细吸管 轻轻吸取悬液，即为淋巴细胞。用适量的Hank’s液 冲洗平皿，收获即为单核细胞悬液。 ②L-亮氨酸甲基酯法
单核-巨噬细胞内富含溶酶体酶，它能摄取嗜溶酶体的L-亮氨 酸甲基酯，集中于溶酶体上，使该酯转化为对细胞本身有毒 性的L-lencyl亮氨酸甲基酯，但不影响T、B、NK等细胞。用 本法获得的淋巴细胞纯度大于99％，活力＞95％。
一、标本的采取与保存
（二）外周血单个核细 胞的分离 （PBMC）
[基本原理] 根据人类各 种血细胞的比重有所不 同，利用一种比重介于 1.075~1.092之间而接 近等渗的分层液作密度 梯度离心，使一定比重 的细胞群按相应密度梯 度分布，从而得以分离 各种血细胞群。
表7 人外周血细胞密度一览表
2、复苏 复苏解冻必须迅速，力争在20s内使细胞完全融化。
从液氮中取出后迅速移至40℃温水中，融化后要充分洗涤重 悬于新鲜培养液中，使细胞恢复活力。
第二节 免疫细胞表面标志和功能的检测
一、T细胞标志及功能的检测 （一）T淋巴细胞受体的检测 1、E受体的检测 （现多用于分离T细胞） 2、白细胞介素-2受体的检测 T细胞激活的特征 （多采用免疫组化学法）
抗CD3磁球
加入B和T 细胞中
磁球结合T 细胞
磁架进行分离
免疫磁性微 球的分离原
理
正向选择 负向选择
单克隆抗体CD3
直接法对细胞进行分类
羊抗鼠修 饰磁球
Biomag
TT细细胞胞
间接法对T细胞进行分离
第一节 细胞的分离技术
三、分离标本的保存技术
液氮深低温（－196℃）保存技术
但降温过程由于冰晶的形成和渗透压的改变，可导致细