蔗糖酶的提取分离

蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究

摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。

关键词：蔗糖酶、酶学性质

1前言

蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。

本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。

2材料与方法

2.1 材料与设备

2.1.1 实验材料

酵母、活性干酵母、壳聚糖

2.1.2 试剂及配制方法

葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na

2HPO

4

、KH

2

PO

4

、MgSO

4

、NaCl、NaOH、Na

2

CO

3

、盐

酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。

95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3)

葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。

1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。

10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml

0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液

1%戊二醛溶液：将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至100mL 0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液：称取16.4g无水乙酸钠，溶解于800ml蒸馏水，用冰乙酸调节其ph至4.5，然后定溶至1000mL。

1mol/L NaoH溶液：4gNaoH溶解于100ml蒸馏水中

2.1.3实验器材

微生物恒温培养箱、紫外分光光度计、超净工作台

高速离心机、恒温水浴锅、层析柱(1.0 cm×10 cm)、梯度混合器、核酸蛋白检测仪、台式记录仪

移液管、注射器、分光光度计、水浴锅、铁架台等。

2.2 实验方法

2.2.1酵母发酵液制备

2.2.1.1培养基配置

斜面培养基（豆芽汁葡萄糖培养基）：

豆芽汁浸汁 100mL

葡萄糖 5.0g

琼脂 2.0g

自然pH

0.1MPa高压蒸汽灭菌20min

摇瓶培养基：

蔗糖 20.0g/L

蛋白胨 5.0 g/L

Na

2HPO

4

4.0 g/L

MgSO

4

0.5 g/L

KH

2PO

4

1.0 g/L

pH 5.0~5.5

0.1MPa高压蒸汽灭菌20min

2.2.1.2试验方法

2.2.1.2.1斜面培养基的制备及斜面接种

称取新鲜豆芽10.0g置于烧杯中，再加入100mL水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足到100mL，即制成10%豆芽汁。按每100mL10%豆芽汁加入5.0g葡

萄糖，煮沸后加入2.0g琼脂，加热融化，补足水到100mL。分装、加塞、包扎，0.1MPa高压蒸汽灭菌20min。

将灭过菌的斜面菌种培养基摆成斜面放置一段时间看有无染菌，用未染菌的斜面培养基接种菌种，该操作在超净工作台上完成。

2.2.1.2.2斜面菌种的培养

将接种后的斜面试管培养基置于28℃的恒温培养箱中培养2d至斜面培养基上长满菌体。

2.2.1.2.3液体培养

准确称取蔗糖糖20.0g，蛋白胨5.0g，Na

2HPO

4

4.0g，MgSO

4

0.5g，KH

2

PO

4

1.0g，

加1000mL水加热，调pH5.0~5.5，每50mL培养基加到250mL三角瓶，包扎，0.1MPa 高压蒸汽灭菌20min。将斜面菌体用接种环接种两环，在28℃的恒温摇床110r/min中培养2d。

2.2.2酵母蔗糖酶的部分纯化

2.2.2.1.破碎细胞

取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30 mL去离子水，研磨30 min，在冰箱中冰冻约10 min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次。将研磨液转移至大离心管中，12000 r/min离心15 min，弃去沉淀。留0.5 mL 上清液为第一组分。

2.2.2.2.加热除杂蛋白

将上清液转入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50℃的水浴中，保温30 min。在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的转速离心20 min，弃去沉淀。留0.5 mL上清液为第二组分。

2.2.2.

3.乙醇沉淀

量出上清液的体积，加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30 min)，于冰浴中温和搅拌20 min。然后以12000 r/min的转速离心25 min，小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的转速离心25 min，取出0.5 mL上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步操作。