第五章 细胞工程制药工艺技术基础
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第5章 植物细胞工程制药
一、外植体选择
不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物
的累积时间各异。
例如（图5－2）：延迟期，加速期，与生长曲线平行 累积，稳定期累积
P-193
二、培养条件的影响
1.培养环境的内在因素
营养成分、生物及非生物元素、通气及混合程度、pH、与接种
有关的因素
（1）接种和诱导：次级代谢产物的产率与外植体大小，细胞密 度及营养成分密切相关，如紫草细胞培养营养成分1400mg/L时 细胞干重2.8g/L，营养成分1900mg/L时细胞干重4.9g/L。
固定化反应器：网状多孔板；尼龙网套；中空纤维膜
优点：细胞位置固定，易于获得高密度细胞群及维持细胞间理化梯度， 利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。
例如：辣椒细胞固定于聚氨基甲酸乙酯泡沫中，维持23天，辣椒素产 量较悬浮培养高1000倍。
第五节 影响植物次级代谢产物累积的因素
糖原、淀粉和纤维素的结构
三、植物细胞的主要生理活性物质及其他化学组分
1.生理活性物质 （1）酶类（enzyme）:淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶 （2）维生素（vitamin）:辅酶 （3）植物激素(phytohormones):调节代谢，影响生理过程，
量微、作用大。
（4）抗生素和植物杀菌素(antibiotic):蒜，葱，萝卜
酶的合成。 （2）碳源：甘油，糖类，肌醇
（3）植物生长调节剂：极低浓度（﹤1µ mol/L）
5种天然激素：生长素（吲哚乙酸，IAA）、分裂素（6－呋喃甲基腺 嘌呤，6－FA）、赤霉素、脱落酸、乙烯
生物技术制药——第五章 植物细胞工程PPT幻灯片
动植物细胞区别
细胞壁、质体、液泡三部分是植物细胞特有的结构，动物细 胞没有。植物细胞是完整的 一个健全的植物细胞通过分化 与增殖可发于成一株完整的植物 但动物细胞不可以 。
植物细胞的主要生理活性物质及其他 化学组分
生理活性物质
生理活性物质是一类对细胞内的生化反 应和生理活动起调节作用的物质的总称。 包括：
挥发油：是一类具有芳香气味，在常温下易于 挥发的油类。
有机酸：是糖类代谢的中间产物。常见的植物 有机酸有苹果酸、柠檬酸等。
植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目 原理
培养基性质 培养基特有成分
培养结果
培养目的
植物组织培养
动物细胞培养
细胞的全能性 细胞增殖
固体培养基
液体培养基
蔗糖 植物激素 葡萄糖 动物血清
但不论何种途径，均可进一步发育成同母体相同的植株， 即所谓的植物细胞全能性。
愈伤组织再分化为胚状体是由不正常分化又回到正常分 化，表明植物细胞、组织、器官具有很大的可塑性，这 种特性为利用植物细胞工程来改良植物提供了可能性。
植物无菌培养
植物培养，即幼苗和较大植株的培养技术
愈伤组织培养，即植物体的各种组织、器官等外植体 ，经过脱分化而形成的细胞聚集体的培养
植物细胞有全能性，而动物细胞也具备 全能性吗?
高度分化的植物细胞仍然有发育成完整植株的能 力，也就是保持着细胞全能性。而高度特化的动 物细胞，从整个细胞来说，它的细胞全能性受到 限制。但是，它的细胞核仍然保持着全能性，这 是因为细胞核内含有保持物种遗传性所需要的全 套遗传物质。
无论是高度分化的植物细胞还是高度分化的动物 细胞，都有全能性。只不过植物细胞的全能性更 容易表达出来，而动物细胞的全能性的表达能力 就还远赶不上植物细胞。因此，任何一个植物细 胞可以很容易的在培养环境下发育成原来的植物 。而动物细胞却没有这种能力。
细胞工程制药-复习
3.研究内容：细胞内活动和流动，外界对其影响，细胞间互相作用等。
4.关键：无菌操作。
（三）体外培养细胞的分型（根据：形态特征）
1.贴附型细胞：（1）成纤维型（2）上皮型（3）游走型（4）多形型
2.非贴附型（悬浮型）细胞
（四）接触抑制&密度抑制
1.接触抑制：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不
优点：①理化环境可控。②细胞经培养后特征均一。③培养物可直接被观测。
④提供大量均一的细胞供制备用。⑤便于进行人工筛选。
缺点：与体内环境仍存一定差异，细胞形态或功能会发生改变。
防止污染、无菌操作是动物组织培养成功的关键！
动物细胞的特性（和微生物比较）：①大，无细胞壁。②生长慢，易污染。
③需氧量少，对剪切力敏感。④以聚集体存在。⑤原代>50代死亡。
（二）标志性事件
Carrel鸡胚浸出液细胞生长促进效应无菌技术引到组织培养技术中
Thomson 1914器官培养法
Earle 1940无限传代C3H小鼠的结缔组织细胞系
1.开始：1907 Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液内，培养出神经元。
2.成熟：以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系。
一、绪论
干细胞用途：①用于药物的研究或毒性的检测。②实验室中研究基因的控制与表达。
③可以用来分化培养一些治疗细胞。
（一）名词解释
1.细胞工程制药：根据细胞生物学和工程学原理，运用体外细胞培养技术定向改变细胞遗传特征，建立和创建新型细胞系（株），并通过专门的细胞培养方法研究细胞生命现象和活动规律，采用工程化的大规模细胞培养方法，探索生产方法和工艺，制造药用生化和生物制品。
（2）毛细管法。
4.关键：无菌操作。
（三）体外培养细胞的分型（根据：形态特征）
1.贴附型细胞：（1）成纤维型（2）上皮型（3）游走型（4）多形型
2.非贴附型（悬浮型）细胞
（四）接触抑制&密度抑制
1.接触抑制：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不
优点：①理化环境可控。②细胞经培养后特征均一。③培养物可直接被观测。
④提供大量均一的细胞供制备用。⑤便于进行人工筛选。
缺点：与体内环境仍存一定差异，细胞形态或功能会发生改变。
防止污染、无菌操作是动物组织培养成功的关键！
动物细胞的特性（和微生物比较）：①大，无细胞壁。②生长慢，易污染。
③需氧量少，对剪切力敏感。④以聚集体存在。⑤原代>50代死亡。
（二）标志性事件
Carrel鸡胚浸出液细胞生长促进效应无菌技术引到组织培养技术中
Thomson 1914器官培养法
Earle 1940无限传代C3H小鼠的结缔组织细胞系
1.开始：1907 Harrison用蝌蚪的髓管放于一滴淋巴液内，培养出神经元。
2.成熟：以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系。
一、绪论
干细胞用途：①用于药物的研究或毒性的检测。②实验室中研究基因的控制与表达。
③可以用来分化培养一些治疗细胞。
（一）名词解释
1.细胞工程制药：根据细胞生物学和工程学原理，运用体外细胞培养技术定向改变细胞遗传特征，建立和创建新型细胞系（株），并通过专门的细胞培养方法研究细胞生命现象和活动规律，采用工程化的大规模细胞培养方法，探索生产方法和工艺，制造药用生化和生物制品。
（2）毛细管法。
《生物制药工艺技术》细胞工程制药技术
高浓度的NaHCO3，常用10%的CO2来平衡。 2.血清 血清添加终浓度一般为5~20%。 3.无血清培养基 • 无血清培养基用化学添加剂（包括某些动物来源的蛋 白质）维持神经细胞存活与生长而不需要在培养基中 添加血清。
细胞培养基配制
• 目前在国内市场主要是干粉型，配制培养基要注意以下 问题：
• 1）认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分， 常见的有NaHCO3、谷氨酰胺（3%Gln）、丙酮酸钠、 HEPES等。这些成分有些时必须添加的，如NaHCO3、谷 氨酰胺，有些根据实验需要决定。
• 3.贴壁生长细胞传代
• 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋 白酶液。
（二）细胞的冻存
• 细胞冻存与细胞传代保存相 比可以减少人力、经费，减 少污染，减少细胞生物学特 性变化。
细胞冻存的原理
• 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器 脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形 成冰晶。
• 2）配制时要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质 都要等培养基完全溶解之后才能添加。
• 3）配制所用的水应是当天制备的三蒸水。
• 4）所用器皿应严格消毒。 • 5）配制好的培养基应尽快过滤，无菌保存.
（二）细胞培养用溶液
1.平衡盐溶液 （balanced salt solution,BSS)
任务二 动物细胞培养
一、动物细胞培养技术概述
（一）动物细胞培养技术及其应用 细胞培养技术是从体内组织取出细胞，在体
外模拟体内的环境下，使其生长繁殖，并维持 其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可 以是细胞群(组织块)。
细胞培养的应用
1、科学研究：
药物研究开发与基础研究 2、生物制药
细胞培养基配制
• 目前在国内市场主要是干粉型，配制培养基要注意以下 问题：
• 1）认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分， 常见的有NaHCO3、谷氨酰胺（3%Gln）、丙酮酸钠、 HEPES等。这些成分有些时必须添加的，如NaHCO3、谷 氨酰胺，有些根据实验需要决定。
• 3.贴壁生长细胞传代
• 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋 白酶液。
（二）细胞的冻存
• 细胞冻存与细胞传代保存相 比可以减少人力、经费，减 少污染，减少细胞生物学特 性变化。
细胞冻存的原理
• 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器 脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形 成冰晶。
• 2）配制时要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质 都要等培养基完全溶解之后才能添加。
• 3）配制所用的水应是当天制备的三蒸水。
• 4）所用器皿应严格消毒。 • 5）配制好的培养基应尽快过滤，无菌保存.
（二）细胞培养用溶液
1.平衡盐溶液 （balanced salt solution,BSS)
任务二 动物细胞培养
一、动物细胞培养技术概述
（一）动物细胞培养技术及其应用 细胞培养技术是从体内组织取出细胞，在体
外模拟体内的环境下，使其生长繁殖，并维持 其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可 以是细胞群(组织块)。
细胞培养的应用
1、科学研究：
药物研究开发与基础研究 2、生物制药
细胞工程制药
基因重组技术
1）显微注射法：利用纤 维操作技术系统和显 微注射技术将外源基 因直接注入实验动物 的受精卵原核，使外 源基因整合到动物基 因组，再通过胚胎移 植技术将整合有外源 基因的受精卵移植到 受体的子宫内继续发 育，进而得到转基因 动物。
基因重组技术
2）逆转录病毒感染法：用逆转录病毒作为载体 去感染受精卵（不适合显微操作)，反转录病 毒感染效率高，但却不会招致寄主细胞的死亡， 被它感染或转化的动物细胞常可持续许多世代。
生产用动物细胞的要求与获得
三、常用生产用动物细胞特性 1、WI-38：人二倍体细胞系 核型2n=46，成纤维细胞，能产生胶原，
BME培养基+ 10%小牛血清，pH=7.2，同功 酶B型G-6-PD，倍增时间24h，有限寿命50代， 安全，用于制备疫苗。
2、MRC-5 从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。
3）胚胎干细胞（ES）
4）体细胞克隆
杂交瘤技术（hybridoma technique）
即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单 克隆抗体技术。它是在体细胞融 合技术基础上发展起来的。克勒 （Kohler）和米尔斯坦 （Milstein）（1975）证明，骨 髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融 合，形成能分泌针对该抗原的均 质的高特异性的抗体——单克隆 抗体，这种技术通称为杂交瘤技 术。这一技术的基础是细胞融合 技术。骨髓瘤细胞在体外可以连 续传代，而脾细胞是终末细胞， 不能在体外繁殖。如将小鼠的骨 髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子 的淋巴细胞融合，则融合细胞既 具有肿瘤细胞无限繁殖的特性， 又具有淋巴细胞能分泌特异性抗 体或因子的能力，同时也克服了 免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的 缺点，融合的细胞称为淋巴细胞 杂交瘤。
二、生产用动物细胞的获得
--第五章细胞工程制药工艺技术基础
传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞 悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养， 称为传代培养。
基本概念
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞， 大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40-50代，这种 传代细胞为细胞株。
细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状 态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养 条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
温度
氧气
pH值
渗透压
哺乳动物细胞最 佳培养温度为 37℃，鸡细胞为 39℃～40℃，而 昆虫类细胞为
离体培养的气 体含有5％CO2 和95％空气， 其中氧浓度为 21％。有时充
绝大多数低于 6.8或超过7.6会 对细胞产生严重 影响动物细胞， 甚至使细胞死亡。
血液中有四个缓冲体
正常血浆渗 透压范围为 （690～ 859kPa）
杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，
有SP2/O、J558L和NSO等。能在无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生
长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。
2020/6/25
9
常见生产用动物细胞系
昆虫细胞株系
Sf21：是从秋黏虫（Spodoptera frugiperda，fall armyworm)卵巢细胞中分离得到 的，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。 Sf-9：是从秋黏虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到，最常用的昆虫表达细胞。倍增时 间为18～24小时，能高效表达外源基因。 TN-5B1-4：是从粉纹夜蛾（Trichoplusia ni，TN）卵细胞匀浆中分离得到的，无血清 培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比SF9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。
基本概念
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞， 大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40-50代，这种 传代细胞为细胞株。
细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状 态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养 条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
温度
氧气
pH值
渗透压
哺乳动物细胞最 佳培养温度为 37℃，鸡细胞为 39℃～40℃，而 昆虫类细胞为
离体培养的气 体含有5％CO2 和95％空气， 其中氧浓度为 21％。有时充
绝大多数低于 6.8或超过7.6会 对细胞产生严重 影响动物细胞， 甚至使细胞死亡。
血液中有四个缓冲体
正常血浆渗 透压范围为 （690～ 859kPa）
杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，
有SP2/O、J558L和NSO等。能在无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生
长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。
2020/6/25
9
常见生产用动物细胞系
昆虫细胞株系
Sf21：是从秋黏虫（Spodoptera frugiperda，fall armyworm)卵巢细胞中分离得到 的，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。 Sf-9：是从秋黏虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到，最常用的昆虫表达细胞。倍增时 间为18～24小时，能高效表达外源基因。 TN-5B1-4：是从粉纹夜蛾（Trichoplusia ni，TN）卵细胞匀浆中分离得到的，无血清 培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比SF9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。
教学课件第五章植物细胞工程制药
愈伤组织(callus）：
由外植体组织增生的细 胞产生的一团无定型的 疏松排列的薄壁细胞。
Each “callus” is a cluster of cells that start differentiating as they grow in a special medium.
继代培养（subculture）：愈伤组织在
具有群体效应，无贴壁依赖性及接触抑制性 培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低 培养过程具有结构与功能全能性
第三节 植物细胞培养的基本技术
植物材料的准备
培养基的组成
植物激素 是指植物代谢过程中自身形成的植物
生长调节剂，在极低浓度时即能调节植物的生长 和发育过程，并能从合成部位转运到作用部位而 发挥作用。迄今为止，已发现植物组织中可形成 五种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、脱 落酸和乙烯。
培养基上生长一段时间后，营养物枯竭， 水分散失，并已经积累了一些代谢物，此 时需要将这些组织转移到新的培养基上。
次级代谢产物特征：
有明显的分类学区域界限 其合成需在一定的条件下才能发生 缺乏明确的生理功能 是生命的多余成分
次级代谢：特殊蛋白质内源化合物的合
成、代谢及分解作用的综合体现。
保证良好的混合状态，从而获得良好的气体传递 பைடு நூலகம்果
第四节 影响植物次级代谢产物 积累的因素
生物条件 外植体、季节、休眠、分化等
物理条件 温度、光（光照时间、光强、光
质）、通气（O2）、pH和渗透压等
化学条件 无机盐（N、P、K等）、碳源、植物
生长调节剂、维生素、氨基酸、核 酸、抗生素、天然物质、前体等
培养方法
固体培养
琼脂培养 固定化培养
细胞工程制药工艺技术基础共35页文档
细胞工程制药工艺技术基础
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
பைடு நூலகம்
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
பைடு நூலகம்
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
5 植物细胞工程制药
快速繁殖实现工厂化育苗(特点：繁殖快，性状稳定，整 齐一致，无病虫害，周期短，周年生产。)
（三）植物细胞工程育种 1.利用培养变异，筛选优良突变体 植物离体培养，能够明显提高突变率，并且 会有各种各样的生理和形态突变，如株高、花色、 植株形态、生育期、耐性等。可以从中选择优良 突变体，培育新品种。
1962年Marshing和Skoog在烟草培养中筛选 出至今仍被广泛使用的MS培养基。 1964年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼 陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体 植株。
3、应用研究阶段（20世纪70年代以后）
1971年，Takebe 等从烟草原生质体得到再生 植株，首次获得原生质体植株再生成功。 1972年，Carlson 等通过两个烟草物种之间原 生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。
植 所采用技术 物 的理论基础 细 胞 工 程 通常采用的
植物细胞的全能性
植物组织培养 植物体细胞杂交
技 术 手 段
二、植物细胞工程的主要应用
（一）种苗脱毒 茎尖培养可以得到无病毒苗木已成为解决病
毒病危害和品种退化问题的一个重要途径。
（二）快速繁殖
许多植物名贵是因为繁殖系数太低，种子结 实率低或者不结种子，而营养繁殖又很慢。利用 组织培养再生植株，进行大量繁殖，可以大大提 高繁殖系数。目前组织培养快速繁殖已在许多植 物上应用， 最早是兰花（60年代）。
（四）离体种质保存 随着地球不断开发、生态环境破坏，种植资 源日趋枯竭，大量有用基因损失。利用组织培养 法，低温保存（－196℃）或试管保存，为保存和 抢救濒临灭绝的生物带来希望。 （五）细胞培养生产有用物质（生物 制品） 利用细胞培养生产次生物质，如药物、色素、 食品添加剂、酶、农药等。有些极其昂贵的生物 制品，如抗癌首选药物--紫杉醇等，可以用大规模 培养植物细胞来直接生产。
（三）植物细胞工程育种 1.利用培养变异，筛选优良突变体 植物离体培养，能够明显提高突变率，并且 会有各种各样的生理和形态突变，如株高、花色、 植株形态、生育期、耐性等。可以从中选择优良 突变体，培育新品种。
1962年Marshing和Skoog在烟草培养中筛选 出至今仍被广泛使用的MS培养基。 1964年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼 陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体 植株。
3、应用研究阶段（20世纪70年代以后）
1971年，Takebe 等从烟草原生质体得到再生 植株，首次获得原生质体植株再生成功。 1972年，Carlson 等通过两个烟草物种之间原 生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。
植 所采用技术 物 的理论基础 细 胞 工 程 通常采用的
植物细胞的全能性
植物组织培养 植物体细胞杂交
技 术 手 段
二、植物细胞工程的主要应用
（一）种苗脱毒 茎尖培养可以得到无病毒苗木已成为解决病
毒病危害和品种退化问题的一个重要途径。
（二）快速繁殖
许多植物名贵是因为繁殖系数太低，种子结 实率低或者不结种子，而营养繁殖又很慢。利用 组织培养再生植株，进行大量繁殖，可以大大提 高繁殖系数。目前组织培养快速繁殖已在许多植 物上应用， 最早是兰花（60年代）。
（四）离体种质保存 随着地球不断开发、生态环境破坏，种植资 源日趋枯竭，大量有用基因损失。利用组织培养 法，低温保存（－196℃）或试管保存，为保存和 抢救濒临灭绝的生物带来希望。 （五）细胞培养生产有用物质（生物 制品） 利用细胞培养生产次生物质，如药物、色素、 食品添加剂、酶、农药等。有些极其昂贵的生物 制品，如抗癌首选药物--紫杉醇等，可以用大规模 培养植物细胞来直接生产。
第五章 植物细胞工程制药
固定化培养常采用固体培养，优点是操作简便易行、培养所占空间 小。
缺点是：
（1）培养基中营养物质的浓度差导致愈伤组织生长不平衡； （2）气体交换不畅，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，堆积有害物 质； （3）静止状态下，由于重力作用和向光性导致细胞群体不均匀； （4）培养时需测定一些生理生化指标，此时需转入液体中，会改变 组织的形态和生理状态。
第五节 影响植物次级代谢产物积累的因素
在植物组织培养过程中，影响植物次级代谢产物产生和 累计的因素有：
（1）生物条件：如外植体、季节、休眠等 （2）物理条件：如温度、光、通气等 （3）化学条件：如无机盐、碳源、维生素等 （4）工业培养条件：如培养罐类型、通气等
一、外植体选择
不同外植体的悬 浮细胞培养物，它们的 最大次级代谢产物的积 累时间各异，同一化合 物可以在不同的外植体 的不同生长阶段中积累 ，无论是延迟期、加速 期、对数期还是稳定期 都能够大量积累次级代 谢产物。
1.生理活性物质
生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质 的总称。
（1）酶
有机催化剂，生物体内所有的反应都是在酶的催化作用下 进行的。
酶的特性：
①酶具有高效率的催化能力，其效率是一般无机催化剂的107~1013倍 。
②酶具有专一性，每一种酶只能催化一种或一类化学反应。 ③酶在生物体内参与每一次反应后，它本身的性质和数量都不会发生 改变。 ④酶的作用条件较温和，酶所催化的化学反应一般是在比较温和的条 件下进行的。
9.分生组织培养：即生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端 分生组织细胞。（分生组织是在植物体的一定部位，具有持续或 周期性分裂能力的细胞群。）
10.外植体：用于植物组织（细胞）培养的器官或组织，即从活 体植物上切下来用于培养的组织或器官。植物根、茎、叶、花 、果、胚珠、胚乳、花药、花粉等都可以作为外植体。
第五章动物细胞工程制药
生产用细胞库：从原始细胞库来，或从单一安瓿 来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然 后经培养扩增到一定数量后，再分装储存形成的 细胞库。
生产用细胞库也必须建立档案，而且需要进行无 菌性和无细胞交叉污染的检查，生产时需确定其 最高使用的传代数。
第四节 动物细胞的培养条件和培养基
培养成功必备条件：
2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法
化学法
物理法
病毒法
细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 显微注射法
原生质融合法 染色体介导法
基因枪法
微细胞介导法
鬼影红细胞介导法
重组逆转录病毒介导法 重组DNA病毒介导法 多瘤病毒样颗粒介导法
① 所有与细胞接触的设备、器材和溶液，都必须保持绝对 无菌，避免细胞外微生物的污染
② 必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质，避免 即使是极微量的有害离子的掺入
③ 保证有适量的氧气供应 ④ 需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物 ⑤ 有良好的适于生存的外界环境 ⑥ 及时分种，保持合适的细胞密度
一、动物细胞的培养条件
a. 磷酸钙沉淀法：将溶解的DNA加在Na2HPO4 中，逐渐加入CaCl2溶液，当 Na2HPO4和CaCl2形成 沉淀，DNA包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉 淀物，当沉淀物与细胞表面接触时，通过吞噬作用 将DNA导入胞内。 优点：方法简单，可进行共转化
b. 电穿孔法：借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场， 使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔，外源DNA沿小孔 进入细胞。 特点：转化效率较高，但进入的DNA拷贝数较低
基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒 子； ④ 多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占 全部蛋白质的20~30%； ⑤ 用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选 阳性克隆； ⑥ 如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
细胞工程制药工艺技术基础
41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
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细胞工程制药工艺技术基础
41、俯仰终宇宙，不乐复何如。 42、夏日长抱饥，寒夜无被眠。 43、不戚戚于贫贱，不汲汲于富贵。 44、欲言无予和，挥杯劝孤影。 45、盛年不重来，一日难再晨。及时 当勉励 ，岁月 不待人 。
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2013-9-22
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动物细胞培养条件
对培养条件要求严：动物无细胞壁保 护，细胞膜直接接触外界。对物理化学 因素耐受力很弱，容易受伤害。与细菌 和植物细胞相比，动物细胞培养条件要 求苛刻，周围环境十分敏感。
对培养基的要求高：需要容易利用、丰 富的相对低分子量的营养物，包括12种 必需氨基酸，8种以上维生素，多种无机 盐和微量元素，多种附加成分。能源： 单糖，葡萄糖，谷氨酰氨。氮源：氨基 酸单体化合物。
很复杂，要求有多种 氨基酸、维生素、葡 萄糖、血清
非常敏感，仅能耐受 很苛刻的环境条件 进行间接（有丝）分 裂，即先有染色体的 纵裂 15-50
较复杂，要求有多种 无机盐、维生素、蔗 糖、植物生长调节剂
较敏感 间接分裂
环境影响 繁殖方式
倍增时间/时 2013-9-22
24-72 14
动物细胞大规模培养方法
优点：操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧
悬浮培养
较好，容易扩大培养规模； 缺点：由于细胞体积较小，较难采用灌流培养。 主要设备：通气搅拌灌式和气升式。
贴壁培养
优缺点与悬浮培养正好相反。 常用设备：转瓶和固定床式生物反应器。另外，贴 壁培养在传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从 基质上消化下来。
微载体培养
成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养
4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个 体？
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体
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项目
大小/μm
微生物细胞
球菌φ0.5-φ1 杆菌φ0.5-φ7 放线菌φ0.5-φ1.4 酵母φ1-φ30 有，细菌由氨基糖及 壁酸为主组成 以悬浮为主
有SP2/O、J558L和NSO等。能在无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生
长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。
2013-9-22 9
常见生产用动物细胞系
昆虫细胞株系
Sf21：是从秋黏虫（Spodoptera frugiperda，fall armyworm)卵巢细胞中分离得到 的，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。
纤维（fibroblast）细胞系，贴附型生长，2n=46。细胞倍增时间24小时，寿命50
代，第一个被用于制备疫苗。
2013-9-22
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常见生产用动物细胞系
哺乳动物细胞株系
CHO细胞：从中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）中分离的上皮样 （epithelial）细胞系，贴附型生长体性，是目前使用最为普遍和成熟的宿主细胞。 属于贴壁生长细胞，可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白 质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。 BHK：从幼仓鼠的肾脏（baby hamster kidney, BHK）中分离的成纤维样细胞， 非整倍体，2n=44。用于增殖病毒，制备疫苗和重组蛋白。两种重组凝血因子Ⅷ， Bayer的Kogenate FS、Aventis Behring的Helixate分别于1989和1994被FDA获 准上市，1999年FDA批准Novo Nordisk的重组凝血因子VIIa（NovoSeven）上市， 用于治疗血友病。 杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，
哺乳动物细胞
淋巴细胞 其他大小约为φ10-φ100
植物细胞
φ20-φ40 φ100-φ1200
细胞壁 液体培养生长方式
无，其细胞膜由类脂 和球蛋白组成 以贴壁为主
有，由纤维素、果胶 为主组成 以悬浮为主
营养要求
简单，以碳水化合物、 无机及有机氮源、微 量元素为主
一般，可耐受较粗犷 的环境条件 细菌及放线菌以繁殖 为主；酵母以芽生为 主；霉菌以形成孢子 繁殖为主 0.5-5
生物制药工艺学
Biopharmaceutical Technology
第五章 动物细胞工程制药技术
动物细胞工程主要应用技术 细胞培养 细胞融合
动物细胞工程是指按照人们预 定的设计，根据细胞生物学及 工程学原理定向改造动物细胞 遗传性的技术。
单克隆抗体
动物细胞工程
核 移 植
胚胎移植
动物细胞反应动力学、动物细胞反应器
2013-9-22
合成培养基是用化学成分 明确的试剂配制的培养 基，组分稳定，可大量供 应。在动物细胞培养中最 常用培养基7－8种，如 BME、MEM、DMEM、 IMEM、M199等。合成培 养基中添加5％-10 ％的小牛血清。在杂交瘤 培养中，一般为10％～20 ％的胎牛血清。血清的加 入对培养非常有效，但对 培养产物的分离纯化和检 测会组成一定的不便。
无血清培养基（serum free medium, SFM）是全部用已 知成分组配的不加血清的合 成培养基，通常加入适宜的 促细胞生长因子，保证细胞 良好生长，是最适合于制药 生产的培养基。产品纯化容 易，组分稳定，可大量配 制。已有各种无血清培养基 上市。 已有商品化的无血清培 养液，如淋巴细胞无血清培 养基、内皮细胞无血清培养 基、杂交瘤细胞无血清培养 基、巨噬细胞无血清培养基 等。
血液中有四个缓冲体 系，碳酸盐、磷酸盐、 血红蛋白和血浆蛋白 缓冲体系。
渗透压
正常血浆渗 透压范围为 （690～ 859kPa）
11
动物细胞培养基的制备
培养基
天然培养基是直接取自于动 物组织提取液或体液作 为培养基，如血浆凝块、血 清、淋巴液、胚胎浸出液 等。营养价值高，但成分复 杂，而且不稳定，来源也受 到限制，不宜大量培养和生 产使用。 血清是天然培养基中最有 效和最常用的培养基，来源 有胎牛血清、新生牛或成牛 血清、马血清、鸡血清、羊 血清及人血清，最广泛应用 的为胎牛血清和新生牛血 清。
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动物细胞培养过程的检测与工艺控制
细胞活性与形态检测
溶解氧的检测与控制
培养基成分检测与代谢控制
基质消耗的检测 、 代谢控制
pH值检测与控制
温度检测与控制
搅拌剪切检测与控制
目标产物的检测与控制
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动物细胞培养技术的应用
• 蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体
基本概念
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞， 大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40-50代，这种 传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状 态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养 条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具 有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。
使细胞贴附载在微小颗粒载体上，贴附面积大，供 细胞贴附生长、增殖。载体体积很小，比重较轻， 在轻度搅拌下即可使细胞自由悬浮于培养基内，充 分发挥悬浮培养的优点。理想的微载体有葡聚糖、 聚丙烯酰胺、明胶或纤维素
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动物细胞大规模培养的操作方式
分批式 半连续式 灌流式
当细胞和培养基一起加入反应器 后，在细胞增长和产物形成过程 中，不断地将部分条件培养基取 出，同时不断地补充新鲜培养 基。
受一种抗原决定簇的刺激，大量增殖形成一个具有相同遗传特性的细胞
克隆群，产生一种化学结构完全相同，在结构上与抗原决定簇互补的特 异抗体即单克隆抗体。因此，进入机体的每一种抗原能被针对其不同抗
原决定簇的各种抗体所识别，而每一种抗原决定簇又可由1000-8000种
不同的抗体所识别。
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概
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动物细胞大规模培养的操作方式
简单连续培养装置
1－培养基贮槽 2－流出液接受器 3－蠕动泵 4－恒温水浴 5－磁力 搅拌器 6－培养槽中搅拌转子 7－温度调节器 8－培养基加入管 9－培养液 流出管 10－输送管
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动物细胞种质保存
动物细胞种质保存的形式有组织块、细胞悬浮物及细 胞单层培养物等。保存方式有常温（20-30℃）、低温 （4℃）及超低温冰冻法（-70℃）3种。
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础
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常见生产用动物细胞系
人源细胞株系
Namalwa：从淋巴瘤病人中分离获得的类淋巴母细胞，非整体核型，2n=12～ 14，单X染色体，无Y染色体。表达IgM悬浮生长。外源基因的表达水平较高，可用 无血清培养基高密度培养。已成功地表达了rhEPO、rhG-CSF、tPA等，已用于大 规模生产干扰素，并批准上市。 WI-38:美国Wistar研究所从正常人胚肺组织分离获得的二倍体（diploid）成
动物细胞培养的基本过程
动物胚胎或幼龄动物的 组织、器官
胰蛋白酶 剪碎
单个细胞
制成 原 代 培 养
细胞悬 浮液
细 胞 贴 壁
细胞系 部分细胞“癌变”， 无限传代
细胞株
细胞
动物细胞培养不能 最终培养成动物体
50代细胞
剥离、分瓶 传代培养
10代细胞
实例
取动物器官 和组织
幼龄鼠
剪碎组织
胰蛋白酶处理
细胞培养 单个细胞
动物细胞培养 基本概念 动物细胞大规模培养方法 动物细胞培养操作方式 动物细胞培养条件 动物细胞培养基的制备 动物细胞培养过程的检测与工艺基的制备
基本概念
动物细胞培养：就是从动物有机体中取出相关的组织， 将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中， 让这些细胞生长和增殖。 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。 培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培 养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞 悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养， 称为传代培养。