葛云侠 《植物生理学》实验 讲义

植物的光合速率测定-----改良半叶法[目的]学习改良半叶法测定光合速率 [原理]植物叶片的主脉两侧对称部分叶面积基本相等，其形态和生理功能也基本一致。

用物理或化学方法处理叶柄或茎的韧皮部，保留木质部，以阻断叶片光合产物的外运，同时保证正常水分供应。

然后，将对称叶片的一侧取下置于暗中，另一侧留在植株上保持光照，继续光合作用。

一定时间后，测定光下和暗中叶片的干重差，即为光合作用的积累的干物质量。

通过公式计算出光合速率。

乘以系数后还可计算出C02的同化量。

光合速率(mgDW ·m -2 s -1)=[材料、仪器、药品]1．材料：任选户外一种植物。

2．仪器及用品：(1) 剪刀；(2) 4块湿纱布；（3）带盖磁盘；(4) 30个小纸牌，去户外之前用铅笔编号（1~15；1~15）；(5) 镊子；(6) 打孔器；（7）铅笔；（8）记号笔；(9) 12个称量瓶；(10) 烘箱；(11) 分析天平；（12）干燥器；（13）毛笔。

3．药品：5％三氯乙酸。

[方法]1．取样：在户外选择较绿的植物叶片10片，要注意叶龄、叶色、着生节位、叶脉两侧和受光条件的一致性。

绿叶用纸牌编号（例如绿叶为1、2、3、4、5-10）。

增加叶片的数目可提高测定的精确度。

2．处理叶柄：为阻止叶片光合作用产物的外运，可选用以下方法破坏韧皮部。

抑制法：用毛笔蘸取5％三氯乙酸涂抹叶柄一周。

注意勿使抑制液流到植株上。

3．剪取样品：叶柄处理完毕后即可剪取样品，并开始记录时间，进行光合作用的测定。

首先按编号次序（绿叶）剪下叶片对称的一半(主脉留下)，并按顺序夹在湿润的纱布中，放入磁盘中，带回室内存于暗处。

1-1.5h 后，再按原来的顺序依次剪下叶片的另一半。

按顺序夹在湿润的纱布中。

注意两次剪叶速度应尽量保持一致，使各叶片经历相同的光照时间。

4．称干重：取4个称量瓶分别标上绿叶光照1、2，绿叶黑暗1、2，将各同号叶片照光与暗中的两半叶叠在一起，用打孔器打取叶圆片，分别放入相应编号的称量瓶中（即光下和暗中的叶圆片分开）。

每5 个叶片打下的叶圆片放入一个称量瓶中，做为一个重复。

记录每个称量瓶中的小圆片数量。

打孔器直径根据叶片面积大小进行选择，尽可能多的打取叶圆片。

注意不要忘记用卡尺量打孔器的直径。

将称量瓶中叠在一起的叶圆片分散，开盖置于105℃烘箱中烘10min 以快速杀死细胞，然后将温度降到70~80℃，烘干至恒重(40min 左右)。

取后取出加盖于干燥器中冷却至室温，用分析天平称重。

5．结果计算：光合速率(mgDW ·m -2 s -1)=式中 W 2：照光半叶的叶圆片干重(mg)；W 1：暗中半叶的叶圆片干重(mg)；A ：叶圆片面积(m 2)；t ：照光时间(S)。

若将干物质重乘以系数1.5，便可得CO 2的同化量，以mgC02·m -2S -1表示。

植物叶绿素含量测定----丙酮提取法[目的、意义]叶绿素含量是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标，学习用分光光度计并结合消光系数法来测定物质含量。

[原理]叶绿素溶于有机溶剂，如丙酮、乙醇等研磨提取或浸泡提取。

叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。

利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。

其数学表达式为：A=Kbc式中：A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。

叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。

叶绿素a和b在663nm 处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在652nm处，叶绿素a和b的吸光系数相同，因此提取液中叶绿素的总浓度（a+b）也可通过测定溶液在波长652nm处的吸光度（A652）求得，其计算公式为：C a十b（1）式中：34.5为叶绿素a和b在波长652nm处的吸光系数。

所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算：叶绿素含量（mg·g-1或mg·dm-2）= （2）式中：C为叶绿素浓度（mg·L-1）或mg·dm-2）；V为提取液总体积（ml）；A为取样鲜重（g）或取样面积（dm-2）。

[材料、仪器、药品]1．材料：植物绿色叶片。

在本实验中利用光合速率测定实验中取回室内的绿色半叶为试材。

2．仪器：(1) 分光光度计；（2）天平；(3) 研钵；(4) 滤纸；(5) 漏斗；(6) 5ml移液管；(7) 打孔器；（8）滴管；（9）剪刀；（10）25ml容量瓶；（11）毛刷；（12）擦镜纸。

[方法]1．取样：称0.5g叶片→剪碎后放入研钵→→加入80%丙酮2.5ml，少许CaCO3，石英砂→研磨成匀浆→再加入3ml 80%丙酮→继续研磨至组织变白→在暗处静止3~5min后→用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶→80%丙酮洗研钵，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后→用80%丙酮定容至刻度。

3．读取吸光度：。

第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。

将仪器波长调至652nm处，以80%丙酮做为空白对照调透光率100%，测定溶液在上述波长下的吸光度。

4．结果计算：将652nm处测得的吸光度代入公式（1）中计算叶绿素a、b浓度和总浓度。

再将叶绿素a、b浓度和总浓度代入公式（2）中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含量。

植物组织水势测定----小液流法[目的、意义]学习小液流法测定植物组织水势在栽培生产上水势也是了解植物体内水分状态，制订灌溉计划的重要指标。

[原理]水势的测定有多种方法，可分为气态平衡法和液态平衡法。

前者要求精密的仪器设备，灵敏度高，如热电偶温湿度计法；后者要求设备简单，操作方便，但灵敏度低，如小液流法和折射仪法。

小液流法亦称比重法或着色法，是水势测定的最经典方法之一。

在恒温恒压下，如果植物组织的水势低于外液的渗透势，则植物组织吸水而使外液浓度变大；反之，植物组织失水而使外液浓度变小；若二者相等，则外液浓度不变，此时外界溶液的渗透势等于植物组织的水势。

同一种溶液浓度不同，比重亦不同。

当两个不同浓度的溶液相遇时，稀的溶液由于比重小而上浮，浓的溶液比重大而下沉。

当把浸过植物组织的溶液滴回到原浓度的溶液中时，如果液滴下降，说明浸泡液的渗透势高于植物组织的水势；若液滴上升，说明浸泡液的渗透势低于植物组织的水势；如果液滴不动，则表示植物组织与浸泡液的水分交换处于动态干衡中，浸泡液的渗透势等于植物组织的水势。

浸泡液的渗透势依据范特荷夫公式计算：Ψπ＝一iCRT浸泡液的液滴不动时，植物组织的水势（MPa）Ψw＝Ψπ＝一iCRT[材料、仪器、药品]1．材料：韭菜叶片。

2．仪器：(1) 5ml试管6支；(2) 10ml刻度试管6支；(3) 细滴管8~10支；（4）移液管8支；(5) 试管架1个；(6) 打孔器(0.5 cm2左右)1个或刀片1个；(7) 镊子、解剖针、滤纸。

3．药品：（1）甲烯蓝粉末；(2) 蔗糖溶液，浓度为lmol·L-1。

[方法]1．准备器具：将试验所需要试管和滴管洗净烘干。

2．配制不同浓度的蔗糖溶液：测定植物组织水势时所用的溶液，一般最常用的是蔗糖溶液。

取洁净干燥的10ml刻度试管6支编号（甲组），将1mol的蔗糖溶液稀释成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mol·L-1的6种浓度。

按下表配制不同浓度的蔗糖溶液。

配制好的溶液要充分混匀。

蔗糖系列浓度溶液配制3．准备浸泡液：取洁净干燥的5ml试管6支编号（乙组），从甲组中依次取出0.1~0.6 mol的蔗糖溶液5ml，分别加入乙组的各个试管中，盖上盖防止蒸发，放到试管架上，做为浸泡液。

4．向浸泡液中加待测样品：取10个待测韭菜叶片，用毛刷清洁叶表面，将基部和项部切掉。

所有叶片放在一起，用刀片切成0.3cm左右的切段，分别放入浸泡试管（甲组）中，每管10段。

每个试管中的叶切段数量要一致，并且每个试管中来自每个叶片的切段数量相同，以保证各个试管中的样品水势尽可能的一致，将叶片切段全部浸没在溶液中，盖上盖子。

5．溶液平衡：叶切段浸泡30min，期间轻轻摇动试管数次，以加速水分平衡。

确定着色时甲烯蓝用量：用解剖针分别放入少许甲烯蓝粉末在装有5ml水的试管中，使甲烯蓝充分溶解，将浸泡液充分混匀。

用白色做背景，直至观察到淡蓝色的，确定这时甲基蓝用量。

6．平衡情况检测：叶切段浸泡30min后，用解剖针分别放已定的甲烯蓝粉末用量在甲组每个试管中，使溶液着色，但甲烯蓝粉末不宜加过多。

将浸泡液充分混匀。

用细滴管吸取有色溶液少许，插入相应浓度的乙组试管中，使滴管尖端位于溶液中部，然后轻轻挤出1小滴有色溶液，小心抽出滴管(注意勿搅动溶液)，观察有色小液滴的升降情况并做好记录。

有色浸泡液小滴在原浓度溶液中的运动情况记载液滴表现为上升、静止不动或下降，用“↑”“―”“↓”表示。

7．结果计算：将确定的蔗糖溶液浓度带入公式Ψπ＝一iCRT中计算植物组织的水势。

式中：Ψπ为渗透势，单位为MPa；i为范特荷夫系数或等渗系数，对于不解离的蔗糖溶液为1.0；C为与组织水势相等的蔗糖溶液的摩尔浓度，或液滴上浮、下沉的两个相邻蔗糖浓度的平均值，单位为mol·L-1；R是理想气体常数，0.0083 MPa·L ·mol -1·℃-1；T是绝对温度,即273+t（t为实验时的温度）。

植物根系活力测定----甲烯蓝法[目的]学习用分光光度计并绘制标准曲线来测定物质含量[原理]根系活力测定方法：TTC法、α-萘胺氧化法、甲烯蓝法。

TTC法原理：呼吸作用中的脱氢酶活性与根系活力成正相关。

TTC (无色)+2H++2e→TTCH ( 红色) α-萘胺氧化法原理：α-萘胺的氧化能力与呼吸作用密切相关。

α-萘胺(无色)+O→α-羟基-1-萘胺( 红色)甲烯蓝法原理：植物根系对溶质吸收最初具有吸附的特点被吸附物质是以单分子层形式均匀地覆盖在根系表面根据根系对某种物质（常用甲烯蓝）吸附量来测定根的吸收面积被吸附的数量可根据供试溶液浓度的变化用比色法测出已知lmg甲烯蓝成单分层时可覆盖1.1m2的面积，据此可求出根系的总吸收面积。

总吸收面积=[（C1—C1‘）×V1+(C2—C2’)×V2]×1.1当根系在甲烯蓝溶液中已达吸附饱和而仍留在溶液中时，根系的活跃部分能把原来吸附在表面的物质吸收到细胞中去，因而可继续吸附甲烯蓝。