(CsCl 密度梯度离心法)
细胞生物学研究方法
一、填空题1.透射电子显微镜由、、三部分所组成。
2.在酵母人工染色体制备过程中，要使用酶脱去酵母的细胞壁，使之成为，并且进行观察和计数。
3.观察贴壁生长的培养动物细胞可用。
4.电子显微镜使用的是透镜，而光学显微镜使用的是透镜。
5.物质在紫外光照射下发出的荧光可分为和两种，其中需要将被照射的物质进行染色。
6.用紫外光为光源观察物体比用可见光的分辨率要高，这是因为。
7.相差显微镜与普通显微镜的区别是用替代可变光阑，用代替普通物镜。
8.倒置显微镜与普通显微镜的不同在于其。
9.显微镜的分辨本领是指能够能力，用来表示。
10.电子染色是用来增强电子的散射能力。
11.在光学显微镜下见到的结构称为，在电子显微镜下见到的结构称为。
12.细菌质膜的多功能性主要表现在:具有的呼吸作用，具有的分泌作用，具有的信号传导作用。
13.显微镜的分辨率约等于光波长的，通常把这一数值看成是光学显微镜分辩力的。
14.在同位素追踪技术中，用于研究DNA的同位素标记的前体物是。
15.单克隆抗体技术是将与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。
16.可用技术来研究质膜结构的不对称性。
17.乙醇沉淀DNA的主要原理是。
18.动物细胞培养所用的合成培养基中除含多种、和外，一般还需加入。
19.用荧光显微镜观察细胞时，经吖啶橙染色的细胞中的DNA发荧光，而RNA发荧光。
20.适于观察活细胞的光学显微镜有、和等。
21.分辨率是指人的肉眼或显微镜在25cm处能够分辨到的相邻两个物体间最近距离的能力。
人眼为，普通光学显微镜为，透射电子显微镜为，扫描隧道显微镜为，以紫外光为光源的光学显微镜为。
22.光学显微镜的组成主要分为、和三大部分，光学显微镜的分辩率由、和三种因素决定。
23.用紫外光为光源观察物体比用可见光的分辨率要高，这是因为。
24.荧光显微镜是以为光源，而电子显微镜则以作为光源。
25.电子显微镜按工作原理和用途的不同可分为和。
26.利用超速离心机对细胞组分进行分级分离的常用方法有和。
一、填空题(每空0.5 分,共10 分)
答: a
6.在动物细胞培养过程中要用( c )来进行观察。
a.相差显微镜; b.荧光显微镜;
c.倒置显微镜; d.普通光学显微镜。
答：c.
7.用光脱色恢复技术可以证明膜的流动性,其原理是:( )
a.用激光束淬灭质膜上一部分膜受体的荧光素;
b.用紫外光淬灭膜蛋白和膜脂的荧光素;
答：PIP2。
11.在细胞外基质中,具有抗压作用的分子是透明质酸。
12. NO是一种气体信号分子,在体内主要由精氨酸产生,它的半衰期很短,
故只作用于邻近细胞,它作用的靶酶是鸟苷酸环化酶。
13. K+离子很难通过人工膜,但加入短杆菌肽A后,对K+的透性大大增
加,原因是。
答：短杆菌肽A起了通道蛋白的作用。
17.原核生物的核糖体同玉米的叶绿体的核糖体极为相似,相互交换亚
基仍具有功能;但同线粒体核糖体相互交换亚基就没有功能。
答：正确。
18.真核生物和原核生物核糖体RNA转录后都要进行加工，包括对某些碱
基的甲基化和间隔序列的切除，虽然甲基化对于间隔序列的切除很重
要，但是这种甲基化位点也会随同间隔序列的切除而被切除。
的。
答:错误,选择蛋白介导的细胞粘着是钙依赖性的,而免疫球蛋白超家族
蛋白介导的细胞粘着是非钙依赖性的
9.Ⅱ型内含子的剪接与核剪接机理相似,都要形成剪接体和套索结构。
答:错误,Ⅱ型内含子的剪接不形成剪接体。
10.胶原在内质网中是可溶的,在细胞外基质中是不可溶的。
答:正确;
11.Ca2+激酶同PKA、PKC、酪氨酸蛋白激酶一样,都是使都是使靶蛋白
答: b
12.前体rRNA甲基化的重要性在于( )。
大量提取质粒DNA(CsCl密度梯度离心法)
大量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）李渊越1.预约摇床、超速离心机。
2.配TB培养基（1L锥形瓶中装250 ml培养液），并灭菌。
质粒做好转化，并涂板。
、。
17.超离后，取样品，用5 ml注射器加上12#针头，抽取EB带，（离心完可见两条EB带，上面一条细浅的带为断裂的质粒DNA,应抽取下面一条粗浓的EB带）放入50ml管中。
18.以灭菌水饱和正丁醇溶液萃取EB，直到溶液澄清无色。
19.加入等体积TE（一定要加。
若不加，在无水乙醇沉淀时，会沉淀下部分CsCl）。
20.加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀（如果不充分混匀，可能会导致离下的DNA是透明的，容易随上清一起倒掉）。
6,000rpm，20min，（注意方向）去上清（注意沉淀不会贴壁，不要倒掉）。
21.加入450 µl (~900ul)水，把50mL离心管平放（注意方向），溶解，直到溶解完全（约需室温过夜）。
22.用枪小心将液体吸入1.5mL离心管中（如>450ul，可分成两管），加入十分之一体积的3 M NaAc (pH5.2)，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于4C或-20C 15-30min。
13,000 rpm 离心10min。
23.用1mL 70%预冷的乙醇洗沉淀一次，13,000rpm 离心10min。
24.去上清，以1mL TE溶解完全，测定浓度。
lysozyme-EDTA-RNase溶液溶菌酶0.4 g0.5M EDTA (pH=8.0) 25mLRNase A (100mg/mL) 120uLH2O 25mL25％蔗糖:蔗糖25 g1 M Tris-HCl（pH 8.0） 5 ml过滤，加纯水定容至100 ml，置于4 ℃保存。
0.5 M EDTA（pH 8.0）:EDTA·Na·2H2O 186.1gNaOH 约20 g加800 ml纯水溶解完全后，调pH至8.0，定容至1 L，湿热灭菌，常温保存。
密度梯度离心（density
密度梯度离⼼（density gradient centrifuge）⼀、概论在密度梯度离⼼中单⼀样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。
梯度液的密度随着离⼼本经的增⼤⽽增加。
密度梯度可以予形成，也可以在离⼼过程中⾃形成，经常，密度梯度的可以分为：速率⼀区带（Rate-30nal）离和等密度（Isopycnic）离⼼。
在速率⼀区带离⼼中混合样品的以很薄的⼀层铺在梯度液的上部，在离⼼过程中由于不同组份"颗粒"在梯度液中沉降速率的差别，⽽在离⼼的某⼀时刻形成了数个含左第⼀级份颗粒的"区带"。
离⼼过程在最垂"的样品（或者说沉降得最快的样品）形成沉殿前就停⽌了。
样品在离⼼后与梯度液⼀起收集，⽤常规技术去除梯度材料后就得了某个较纯的成份。
每个单⼀组份的沉降速率取决于它们的形状、尺⼨、密度、离⼼⼒的⼤⼩、梯度液的密度和粘性系数。
对于相类似的⽣物体组份常常形状也相似。
在速率区带离⼼中我们常常使梯度液的最⼤密度不超过样品在该梯度中浮密度。
利⽤这类⽣物组份在尺⼨上的差异的形成的沉降速率的不同，选择某⼀特定时刻，当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停⽌离⼼即可以达到分离⽬的。
与速率⼀区带离⼼法不同的是，等密度离⼼是依赖于样品颗粒的不同密度来进⾏离⼼分离的。
混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚⾄和梯度液混在⼀起。
最后⼀种⽅法依靠离⼼⼒来形成梯度（⾃形成梯度）在形成梯度的过程中由于样品各单⼀成份向它们⾃⼰的等密度区靠扰即达到了分离纯化的⽬的。
对于速率⼀区带离⼼，梯度液最⼤密度⼀般⼩于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉殿后来分离样品；⽽等密度离⼼法中，梯度液的初始最⼤密度常常超过样品各组份的密度，利⽤每个单⼀组份沉降或上浮到它们各⾃的等密度区来达到分离的⽬的。
密度梯度离⼼法的理论依据是（参考⽂献1）每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为：V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r式中V是某⼀时刻样品的沉降速度（厘⽶/秒）d：样品颗粒的直径（厘⽶），我们在初步计算时就假说样品颗粒为球体。
利用离心技术分离细胞核和叶绿体
密度梯度离心后的结果低倍镜下的叶绿体高倍镜下的叶绿体实验二利用离心技术分离细胞核和叶绿体一、实验目的：1. 了解常用的离心法；2. 理解差速离⼼心法和速率区带离心法分离样品组分的原理；3. 以分离细胞核和叶绿体为例,掌握离心的操作方法。
二、实验原理：• 离心技术：是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的实验技术。
•离心技术类型:1.差速离心法2.密度梯度离心法❶等密度梯度离心：①对象：常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。
(此法一般应用于分离大小相近，而密度差异较大的颗粒物质时)②原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移动了，形成一系列密度区。
从而使不同浮力密度的物质得到分离。
③等密度梯度离心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质。
❷速度梯度离心：①对象: 纯化分离叶绿体和细胞核(主要用来分离密度相近，大小不同的物质)②原理:根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。
②要求：1、样品溶液的密度必须小于悬浮介质层的最小密度；2、样品颗粒的密度必须高于悬浮介质的最大密度；3、离心时间十分重要三、实验结果分析：实验结果：实验结果：如图所示，叶绿体在混合液的梯度层中，形成一条带，聚集在密度梯度交界处；沉降系数较大的细胞组份则沉到离心管底部。
如图所示，叶绿体镜检为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒为基粒。
实验分析：此实验最难的一点就是蔗糖溶液梯度的制备。
要想制得清晰，平整的界面，需要将离心管放置于稳定的水平界面上；最重要的是，向下层溶液中加入上层溶液时，需要极小心、熟练地控制滴加的力度，并使枪头贴着离心管管壁，让液滴缓慢的流入，防止梯度层被破坏；除此之外，将配置好梯度层的的EP管放入离心机时要用试管架移动，而且离心时一定要两两平衡，之前要称量两个离心管使其相等。
医学检验主管检验师资格考试复习资料生物化学(11)临床化学常用分析技术
医学检验主管检验师资格考试复习资料生物化学（11）临床化学常用分析技术一、光谱分析（分光光度技术）利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。
特点：灵敏、快速、简便。
是生物化学分析中最常用的分析技术。
分类（一）可见及紫外分光光度法分光光度法的理论基础是朗伯－比尔定律。
mber－Beer定律：A=k·b·cA为吸光度k—吸光系数b—光径，单位：cmc—溶液浓度，单位：g/L2.摩尔吸光系数：在公式“A＝k·b·c”中，当c＝1mol/L，b＝1cm时，则常数k可用ε表示。
3.比吸光系数：在公式“A＝k·b·c”中，当c为百分浓度（w/v），b为cm时，则常数k可用E%表示，称为比吸光系数或百分吸光系数。
（二）原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法是基于元素所产生的原子蒸气中待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。
即在一定条件下，原子的吸光度同原子蒸气中待测元素基态原子的浓度成正比。
常用的定量方法有：标准曲线法、标准加入法、内标法。
1.标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程分别进行测定，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。
在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线上找出对应的浓度。
由于影响因素较多，每次实验都要重新制作标准曲线。
2.标准加入法：把待测样本分成体积相同的若干份，分别加入不同量的标准品，然后测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品加入量为横坐标，绘制标准曲线，用直线外推法使工作曲线延长交横轴，找出组分的对应浓度。
本法的优点是能够更好地消除样品基质效应的影响，较为常用。
3.内标法：在系列标准品和未知样品中加入一定量样本中不存在的元素（内标元素），分别进行测定。
以标准品与内标元素的比值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，再根据未知样品与内标元素的比值依曲线计算出未知样品的浓度。
腺病毒转染细胞步骤及方法
腺病毒转染细胞步骤及方法腺病毒(Adenovirus，ADV)是一种线性双链DNA 病毒。
腺病毒不仅可以作为哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al., 1998a,b）。
迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述表明：重组腺病毒在科学研究和治疗应用领域都具有很大的潜力，同时作为基因转移工具相对于其他病毒载体有多方面的优势。
运用了去除5' ITR、包装信号和E1 序列的全新的腺病毒骨架基因，无需进行细菌体内的同源重组步骤，无需使用多蚀斑分离方法分离目的重组腺病毒的步骤，因此较其他系统生长更快，并且大大降低了重组形成野生型可复制腺病毒的危险；无E1a，不产生复制型腺病毒，因此更为安全。
二、腺病毒载体优势1)可感染的细胞种类多，宿主范围广，几乎可以感染所有类型的细胞；2)感染效率高，重组腺病毒被广泛应用于使用脂质体转染效率较低细胞的基因转导和蛋白表达；3)包装外源基因的片段大，高达8kb；4)腺病毒载体构建及包装容易操作，易于制备出滴度高的大量病毒；5)当腺病毒感染细胞后，病毒基因组存在于细胞染色体外，不整合到细胞染色体中，避免了因整合引起的基因突变及激活致癌基因，生物安全性高。
三、流程描述制备腺病毒颗粒的穿梭质粒及其骨架质粒，上述质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，用转染试剂RNAi-Mate 进行共转染293A 细胞，转3染6小时后更换为完全培养基，培养7-15 天，每3天左右补充一次新鲜培养基，然后收集细胞和上清液置于离心管中，冻融三次，4000 rpm 离心10 分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，腺病毒的大量扩增，而后对其纯化和浓缩后得到高滴度的腺病毒浓缩液，在293A 细胞中测定并标定病毒滴度。
在一定滴度范围内的腺病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。
四、具体步骤细胞培养活细胞计数用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000 个/ml （一般稀释倍数为100 倍），在0.1 ml 的细胞悬液中加入0.1 ml 的0.4%的台盼蓝溶液。
DNA提取过程中所用试剂的机理
DNA提取过程中所用试剂的机理1.溶菌酶的作用机制是溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。
溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。
也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。
对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。
溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收。
简言之,破坏细菌细胞壁，由于细菌在没有细胞壁时不能生存，从而杀死细菌。
2. 十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。
SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：a. 溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；b. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；c. 对RNase、Dnase有一定的抑制作用；d. SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。
质粒提取常见问题1．溶液I—溶菌液：a.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
b.葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
C. EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
昆虫病毒怎样分离与纯化
昆虫病毒怎样分离与纯化不同病毒的分离纯化过程并不相同，但所采用的技术大同小异，通过39蜂疗网调查发现病毒分离纯化主要是以下几种常用的通用技术。
1.差速离心所谓差速离心，就是对同一份样品，用高速、低速循环交替离心，高速使病毒沉淀；沉淀饴浆再悬浮，低速除去污染杂质，最终获得较纯净的病毒粗提物。
差速离心，可以除去大部分比病毒粒子大或小的杂质。
但与病毒粒子大小相似的颗粒却难以除尽，并且由于杂质的吸附作用，实际病毒获得量低，这是本法的缺点。
差速离心的高速、低速是相对而言的；所需的时间也因溶液的密度、黏度的不同而有变化。
2.密度梯度离心〔1）蔗糖密度梯度区带离心事先于离心管内分层注入不同密度（浓度）的蔗糖溶液，密度大的位于管底部，密度小的在顶部，形成一个蔗糖密度梯度。
将需离心分离的混合液置梯度的顶部，离心过程中，不同密度的粒子，移行到与本身密度相同的蔗糖密度部位，即不再向下移行，达到平衡状态，形成致密的沉淀带。
有时不同密度粒子尚未移到各自密度相同的梯度部位，但根据粒子大小、密度不同，沉降速度不同，已分别形成清晰的区带，亦可达到良好的分离目的，离心结束后，各区带可按次分部收集。
（2）平衡密度梯度离心将待分离的混合物，均匀地悬浮于适当浓度的重金属盐溶液中（如CsCl、RbCl等），经长时间离心，重金属盐溶液建立起稳定而连续的密度梯度。
待分离的粒子被离心力场驱入溶液密度与粒子本身密度相同的区域内，即达到平衡，从而获得了良好的分离效果。
3. 判断沉淀纯度可以根据紫外吸收光谱判断。
各沉淀组分（或沉淀带），稀释到一定浓度，分别置紫外分光光度计中，在波长200～300nm的范围内测定其紫外吸收值。
看其是否具有核蛋白的特征性光谱。
核蛋白的特征光谱为：最小吸收值在245nm左右，最大吸收值在260nm左右，260nm 于280nm吸光度的比例大干1，小于2，越接近2，纯度越高。
载体的种类6
一 质粒（plasmid）载体
（一）质粒（plasmid）概述
质粒是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股 DNA（部分质粒为RNA）。 ,存在于细胞质中，质粒编码 非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、 毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可 丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建 的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切 位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。
质粒电泳图
2 大肠杆菌质粒的类型
F因子F进因供编子体码编菌在码向在细受细菌体菌菌表表传面面递产产色生生体性性D菌N菌A毛或毛。质。F粒因F。子因F的子因特的子性决特为定性可编以为码促可 以促的进性供菌体毛菌可在向供受体体与菌受传体菌递间色形体成D交N通A通或连质接粒结。构，F因从子而 决 定编可码使的两性个菌杂交毛细可菌在间供形体成胞与浆受内体连菌接间桥。形成交通连接结构，
（3）λ噬菌体的衍生物 λ噬菌体:λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子， 它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在 细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒， 裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内 λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子 代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。液体 培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的 噬菌体颗粒。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十菌体 裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体 DNA来开展进一步的工作。
细胞分裂过程中染色体的标记问题分析
细胞分裂过程中染色体的标记问题分析1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制，他们将大肠杆菌放在含有15N标记的NH4Cl培养基中繁殖了15代，使所有的大肠杆菌DNA被15N所标记，可以得到15N-DNA。
然后将细菌转移到含有14N标记的NH4Cl培养基中进行培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法法观察DNA所处的位置。
由于15N-DNA的密度比普通DNA(14N-DNA)的密度大，在氯化铯密度梯度离心时，两种密度不同的DNA分布在不同的区带如下图所示。
从而证明了DNA的复制时半保留复制。
在新高考评价背景下，这一结论往往结合细胞分裂的情境命题，考查考生综合运用能力和科学思维素养。
很多学生对这类题目不知从哪里分析解答，一直是困扰师生的一个难题。
很多老师对这类题目进行了“巧用图解，突破DNA复制与细胞分裂中染色体标记问题”的探讨。
但由于过程繁琐，虽然老师反复降解仍有很多学生不能较好解答此类题目。
我的做法抛开分裂过程，重点关注复制次数，化解难点。
具体做法是以两条链都被标记的DNA分子在没有标记元素的条件下复制为出发点，构建第一次复制、第二次复制后着丝点分裂前每条染色体上两条染色单体标记情况，及着丝点分裂后每条染色体产生的两条子染色体的标记情况模型。
在对上面图解分析后，我们不难看出：若是真核生物染色体上DNA双链都被标记，在没有标记元素的条件下复制一次，所产生的每条染色体上两条染色单体都具有放射性，着丝点分裂后产生的两条染色体都具有放射性；第二次复制，所产生的每条染色体上只有一条染色单体都具有放射性，着丝点分裂后产生的两条染色体只有一条具有放射性。
结果如下表（以一条染色体上的DNA双链都被标记，在不含标记元素的条件下复制为例）：复制次数着丝点分裂前每条染色体的染色单体着丝点分裂形成的两条染色体第一次复制两条染色单体都被标记两条染色体都被标记第二次复制一条染色单体被标记，一条不被标记一条染色体被标记，一条不被标记经过这样的分析，在结合有丝分裂和减数分裂染色体的行为，对题目就不难作出回答。
试验室离心机离心方法 试验室离心机操作规程
试验室离心机离心方法试验室离心机操作规程试验室离心机分别方法不一，适用场合也不尽相同。
目前主流的离心分别方法紧要是差速离心法和区带离心法，其实在试验室离心技术制备超离心法一文中有提及两种离心方法，今日笔者对这两种方法的原理及应用介绍进试验室离心机分别方法不一，适用场合也不尽相同。
目前主流的离心分别方法紧要是差速离心法和区带离心法，其实在试验室离心技术制备超离心法一文中有提及两种离心方法，今日笔者对这两种方法的原理及应用介绍进行补充和完善。
1. 差速离心法：很多具有生物活性的生物大分子和亚细胞器是不稳定的，需要低温高速离心，常用的是差速离心法。
通过离心后倒出上清液和沉淀分开，把分别出来的上清液再增大转速离心，分别出第二部分沉淀，这样不断增大转速，逐级分别出所需要的物质。
利用这种方法可以有效地分别大小上差别较大的颗粒，但不能分别大小相像的颗粒，而且所分别出来的组分往往是不均一的，杂有其他种类的颗粒。
2.区带离心法：其中又可以分为两种：速率区带离心和等密度速率区带离心。
1）速率区带离心法：这是将小量悬液放在一平缓的密度梯度液上，用此梯度液来稳定颗粒的沉降。
由于离心，颗粒离开起始区带而移动，移动的速度是由颗粒的大小、形状和它们所受试验室离心机的离心力来决议的。
离心一段时间历，各种颖粒将依照它们的相对速度移动而各个分开，成为一系列区带。
用这种方法我们可以将沉降速度差为20%或者更大的颗粒。
2）等密度区带离心法：这是将要分别的颗粒悬液放至密度梯度液上，或者实际上将颗粒溶于制作梯度的溶液中。
通过离心，颗粒或者上浮或者下沉，达到与它们本身密度相同的液体处在这里它们没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移动了。
这些颗粒可成为一系列区带，每种颗粒在它本身的密度区。
所以，这是一种利用颗粒浮密度的大小分别颗粒大小的方法。
使用的介质通常是氯化铯（Cscl）和硫酸铯（Cs2SO4）。
前者适合于DNA分别，后者适合于RNA分别。
(CsCl 密度梯度离心法)
中量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）李渊越1.将菌液倒入装有50mL TB的锥形瓶中，或从培养好的平板上挑取单克隆，锥形瓶置于37℃摇床350rpm 培养16-20h,至OD600到10-12。
（OD600到40为用TBS培养基在我们的培养条件下所能达到的最高浓度，在此浓度时，菌处于对数生长期）2.将培养好的菌液到入国产50mL离心管中，每管不超过45mL。
（有实验表明，若往离心管中装入超过45mL的液体，离心后，液体的终体积仍为45mL。
因此，一次不应离超过45mL的液体，否则将污染离心机。
）3.室温离心5,000rpm，5min。
弃上清，控干。
4.加P1-RNase至终体积到7mL，震荡重悬至菌均匀分散。
（按该法最多只能裂解45mL 13OD的细菌，如需裂解更多细菌，请按比例增加。
否则将导致细菌裂解不完全，反而提到更少的菌。
）5.加14mL P2，盖上盖子，上下颠倒混匀2min。
（该步一定要混匀，以达到将细菌完全裂解的目的。
加入P2后可见溶液澄清粘稠，该步反应时间不应过久）6.加7mL P3。
（P2和P3之间反应时间不要超过5min。
混匀后可见絮状沉淀。
该步若置于冰上，沉淀效果更好。
但位于室温的反应以足以达到实验需要。
）用H2O配平至对称管重量差<0.1g。
7.室温（4度更好，但没有必要。
）离心，10,000 rpm, 5min。
8.将上清用滤纸过滤至另一国产的50mL管中。
加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀后室温（不可置于4度。
若置于4度，将会使部分盐析出）静置10min。
（分子克隆p35）9.室温离心10,000rpm 15min。
10.弃上清，在加1.8mL H2O溶解完全后，平均分至两个1.5mL管中，再分别往每管中加入二分之一体积的PEG8000，4C沉淀2小时。
11.3,000 rcf离心3min，弃上清。
（可以不要非常完全控干）12.加1.55mL CsCl溶液溶解至沉淀完全溶解。
基因工程复习笔记
基因工程复习笔记第一章一、电泳电泳(eletrophorosis) :带电荷的分子在电场中以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动.移动速度称为电泳迁移率。
影响因素：1 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。
2. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。
3当电场强度一定,电泳介质相同,电荷相同的分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状(构型)。
4分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。
指示剂：溴酚蓝（Bb）：常用指示剂。
分子量670，分子筛效应小，近似于自由电泳，呈蓝紫色。
二甲苯青(Xc)：分子量554.6，呈蓝色，迁移速度比Bb慢。
染料：溴化乙锭（EB）1、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点：比琼脂糖凝胶的分辨率高的多；回收DNA样品纯度高，无色透明，韧性好，银染的凝胶干燥后可长期保存；能装载的DNA量大，达每孔10μgDNA。
2 、SDS-PAGE 原理：SDS是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上相同密度负电荷。
SDS与蛋白质结合使蛋白质构象改变，成为形状近似雪茄状的长椭圆棒，SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。
蛋白质-SDS复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒的长度，即蛋白质分子量有关。
二、PCR技术定义：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，以DNA为模板，在引物、dNTPs、Taq酶的作用下，经变性－退货－延伸反复循环，使某个基因在体外特异性地扩增。
PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物，通过PCR 扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。
影响因素：（1）Taq DNA聚合酶（具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配对）。
（2）引物（primer）一般引物设计为长15—30bp；位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA；引物的碱基组成：尽可能提高G+C含量，避免连续相同碱基排列或内部回文序列，避免形成引物二聚体。
差速离心法与密度梯度离心法的比较
差速离心法与密度梯度离心法的比较安徽省阜南一中——刘敬夏高中生物教学中涉及两种生物实验技术:差速离心法和密度梯度离心法。
1.概念1.1差速离心法（differential centrifugation）是根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。
差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。
此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
1.2密度梯度离心法（density gradient centrifugation）是在密度梯度介质中进行的依密度而分离的离心法。
各组分会依其密度分布在与其自身密度相同的液层中。
密度梯度可以离心前预先制备或在离心中自然形成。
可用于分析型或制备型的离心分离。
2．原理2.1差速离心法是用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离。
2.2密度梯度离心中单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。
3．转速控制3.1差速离心用两个甚至更多的转速。
3.2密度梯度离心只用一个离心转速。
4．待分离的材料4.1 差速离心是适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分。
比如（高中生物必修一《分子与细胞》第三章细胞的基本结构第二节细胞器——系统内的分工合作）各种细胞器的分离。
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
4.2密度梯度离心的物质是密度有一定差异的。
例如（高中生物必修二《遗传与进化》第三章基因的本质第三节 DNA的复制）生物大分子DNA的分离。
氯化铯密度梯度离心：用氯化铯浓盐液，以强大离心力的作用，盐的分子被甩到离心管的底部。
同时，扩散作用使溶液中Cs＋和Cl－离子呈分散状态，与离心力的方向相反，经过长时间的离心，溶液达到一种平衡状态。
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中量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法）
李渊越1.将菌液倒入装有50mL TB的锥形瓶中，或从培养好的平板上挑取单克隆，锥形瓶置于37℃摇床
350rpm 培养16-20h,至OD600到10-12。
（OD600到40为用TBS培养基在我们的培养条件下所能达到的最高浓度，在此浓度时，菌处于对数生长期）
2.将培养好的菌液到入国产50mL离心管中，每管不超过45mL。
（有实验表明，若往离心管中装入超过45mL的
液体，离心后，液体的终体积仍为45mL。
因此，一次不应离超过45mL的液体，否则将污染离心机。
）
3.室温离心5,000rpm，5min。
弃上清，控干。
4.加P1-RNase至终体积到7mL，震荡重悬至菌均匀分散。
（按该法最多只能裂解45mL 13OD的细菌，如需裂解更
多细菌，请按比例增加。
否则将导致细菌裂解不完全，反而提到更少的菌。
）
5.加14mL P2，盖上盖子，上下颠倒混匀2min。
（该步一定要混匀，以达到将细菌完全裂解的目的。
加入P2后可见溶
液澄清粘稠，该步反应时间不应过久）
6.加7mL P3。
（P2和P3之间反应时间不要超过5min。
混匀后可见絮状沉淀。
该步若置于冰上，沉淀效果更好。
但位于室温的反应
以足以达到实验需要。
）用H2O配平至对称管重量差<0.1g。
7.室温（4度更好，但没有必要。
）离心，10,000 rpm, 5min。
8.将上清用滤纸过滤至另一国产的50mL管中。
加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀后室温（不可置于
4度。
若置于4度，将会使部分盐析出）静置10min。
（分子克隆p35）
9.室温离心10,000rpm 15min。
10.弃上清，在加1.8mL H2O溶解完全后，平均分至两个1.5mL管中，再分别往每管中加入二分之
一体积的PEG8000，4C沉淀2小时。
11.3,000 rcf离心3min，弃上清。
（可以不要非常完全控干）
12.加1.55mL CsCl溶液溶解至沉淀完全溶解。
10,000 rcf 3min离心，弃去不溶物质。
13.往2mL超速离心管中加入50ul 2mg/mL EB。
加之前用卷纸把枪头外壁的EB擦干。
（将外壁的EB擦干
是为了防止EB残留在离心管的管口。
）
14.将DNA移至2mL超速离心管中,并用H2O将体积补至2mL。
（此时，溶液的密度为3.10g/2mL，共含1.55g CsCl。
）
15.配平至对称管重量差<0.02g，封口。
（该步配平时，可按1ulH
O重0.001g来补加H2O进行配平以缩短时间。
）在封口
2
后，上下颠倒混匀。
16.打开超速离心机，按Memu -> Programme -> Plasmid-CsCl -> OK。
（该步为149,000rpm 2h 升速max 降速
6。
）
17.按Vacuum 至真空度<400后按 Start。
（不等真空度至<400其实也可启动，但这可能将造成离心机反复升降速，故制
定此规则。
）等升至最大转速后才能离开。
（该步为离心机安全操作必须，请务必做到。
）
18.2h后，取出转头，离心管。
若转头内有液体需将其洗净，擦干。
（因为此时泄漏的液体含有EB，因此需要
将其洗净，擦干。
）
19.先用8号针头在离心管上部插个洞，再用1mL注射器抽出所需的红色DNA条带至1.5mL离心管
中。
20.加入1mL水饱和正丁醇，上下颠倒混匀（勿用振荡器）约20下。
（或更多，使上部液体尽可能变红。
）将
1.5mL管置于离心机中，按Short键 5秒，松手。
弃去上层液体。
（离心的目的是为了加速液面分层，因此
也可省去。
）
21.重复20步2-3遍，至下层看不到红色后再萃取一遍。
（再萃取一遍的目的是为了确保EB完全去除。
）
22.往溶液中补加等体积的H2O，平均分成若干管，使每管终体积为400ul。
往每管中分别加入1mL(2.5
倍体积)无水乙醇，颠倒混匀。
13,500 rpm 5min 4C。
弃上清。
（该步的目的是为了除去溶液中残留的CsCl。
）23.加1mL预冷的70%乙醇洗一遍。
13,500 rpm 5min 4C。
弃上清。
（该步的目的是为了除去21步中管壁上残留
的部分含CsCl的液体。
）
24.加400ul H2O或TE溶解。
（对于高拷贝质粒，45mL菌液将获得500-1,500ug左右质粒。
）
试剂
P1
50mL P1+5mg RNase，4C保存。
P2
P3
异丙醇
PEG8000
CsCl溶液
准确称取31.00gCsCl，加H2O定容至30.0mL。
2mg/mL EB
水饱和正丁醇
无水乙醇
70%乙醇。