PCR相关技术在植物病原细菌检测和鉴定中的应用

2006年第4期(总第105期)广西热带农业45

聚合酶链反应(p ol y m erase chain reaction,PCR)是1983年由美国PE—C etus公司的K ar y M ullis等[1]发明,1985年公开报道的一种体外核酸扩增系统。PCR 及其相关技术具有快速、灵敏、操作简便等优点,已广泛应用于分子生物学、医学、微生物学等领域。且在这些领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。传统的PCR技术在植物病原细菌学的检测应用已经非常广泛[2,3,4,5,6],但是由于植物病害的多样性以及植物病原细菌的复杂性,使传统的PCR技术较难满足需要,由此专家学者们研制出了许多以PCR技术为基础的相关技术,如Real-tim e fluorescent PCR,re p-PCR,Immuno-PCR,IT S-PCR等。这些方法使植物病原细菌的检测更加方便、快捷、灵敏,本文简要介绍一些PCR相关技术的原理及其在植物病原细菌检测中的应用概况。

1Real-tim e fluorescent PCR

其原理是在常规PCR的基础上,增加1条双荧光标记的核酸杂交探针,即T a q m an探针;随着实时PCR 反应体系的进行,每进行一次DNA扩增,就有一个探针被切断,同时荧光信号值被记录下来,且与扩增产物的量产生一对一的对应关系,产物的量越大,荧光信号就会越强,也即反应起始的模板数越高,就越容易达到一个荧光信号阈值,循环次数(Ct值)和反应体系的底物浓度就会形成一个严格的对应关系,根据标准曲线和Ct值,即可以准确地确定扩增基因的浓度[7]。

实时荧光PCR在全封闭状态下实现PCR扩增。荧光探针杂交,信号检测不需电泳和E B染色,可以有效地降低污染和假阳性的产生,具有操作简单、省时省力、精确性高、特异性强、安全快速、准确灵敏等优点。

漆艳香等[8]将玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆测序,根据该细菌与其它待测细菌菌株16S rDNA序列差异,设计出对玉米细菌枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针。进行实时荧光PCR检测,结果显示只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光,且灵敏度较高,反应体系中只要有2个活细菌,实时荧光PCR 就能检测到。根据此技术原理与路线,漆艳香等又分别构建了苜蓿萎蔫病菌[9]、菜豆细菌性萎蔫病菌[10]和香蕉细菌性枯萎病菌[11]的实时荧光PCR检测体系。朱建裕等[12]根据梨火疫细菌中独特含有质粒p EA29,设计了1对引物和3条探针,建立了梨火疫细菌实时荧光PCR的检测方法。

2REP-PCR

原核与真核生物中普遍存在着散布的重复DNA 序列,这些序列由于发挥着生物体基本的功能作用,因此在进化中呈高度保守的状态。REP(re p etitive ex2 tra g enic p alindrom ic)和ERIC(enterobacterial re p etitive in2 ter g enic consensus)属于这样的序列。研究发现,REP、ERIC等序列在微生物中广泛存在,随机分布且在进化中呈高度保守状态。因此,研究人员以REP、ERIC 等序列为引物,以基因组DNA为模板进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳得到不同带型,从而形成了被测菌基因组特异的指纹图谱,该技术称re p-PCR DNA指纹技术。该技术方法简单、快速、敏感和分辨率高,现普遍应用于流行病学中的致病菌株鉴定和确定

PCR相关技术在植物病原细菌检测和鉴定中的应用

宋卡魏王星云张荣意

(华南热带农业大学环植学院,海南儋州571737)

摘要:PCR及其相关技术用于体外扩增DNA、RNA具有灵敏、快速、简便等优点,已经广泛应用于植物病原细菌的检测。本文综述了real-tim e fluorescent PCR、REP-PCR、Immuno-RCR、RAPD-PCR、Nested-PCR等技术的原理及其在植物病原细菌检测和鉴定中的应用现状。

关键词:PCR植物病原细菌检测鉴定

检测

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细菌间的亲缘关系。

S.V.T s yg ankova等[13]对Xanthomonas、p seudumonas、Erwinia等病原菌进行鉴定时,发现所有被测的X. cam p estris均能通过引物K RPN2扩增出一段约600b p 的片段,接着用引物SCAR进行扩增,在所有的X. cam p estris上出现一条特异性条带,而在其他的被测菌株上不能出现.他利用这特点,进行re p-PCR,结果能有效、迅速地对被测菌株进行鉴定。J.Louws等[14]在对339个Xanthomonas进行鉴定时,也成功地应用了re p-PCR技术获得理想结果。

在日本,Ralstonia solanacearum小种4和小种1广泛存在于西红柿、马铃薯等植物上,除非进行致病性测试,否则很难将两者区分,Mitsuo H orita等[15]人利用小种4中存在特异性序列(AK IF-AK IR)和(21F-21R),并将其作为引物,利用re p-PCR技术,最后得到了特异带型。该方法能够准确、快速、灵敏地进行致病菌株的鉴定。

3Immuno-PCR

免疫PCR是在酶联免疫吸附实验基础上建立起来的一种新方法,由S ano等[16]在1992年首次报道,它同时具备抗原抗体反应的专一性和PCR的强特异扩增能力。它是将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上,用PCR扩增代替E LISA的酶催化底物显色,根据扩增产物存在与否判断抗原存在情况。其一般程序是这样的,首先在酶联板上包被捕获抗原的抗体,然后加入待检抗原,再加入DNA分子标记的检测抗体,温育后充分洗涤,PCR扩增黏附于抗原/抗体复合物上的DNA分子,最后对PCR产物进行分析[17]。

在该项技术的基础上,张红[18]等采用了免疫磁珠吸附与PCR相结合的技术,对瓜类细菌性果腐病病原快速检测,经研究表明,其技术检测时间周期为4h,最低菌悬液检出量为1×10cfu/m l,而且不需进行细菌DNA提取。该技术方法省时、快捷、准确,估计会在口岸检疫工作中起到重要的作用。

4RAPD-PCR

RARD技术由William s和W elsh首先提出(William s等1990),是利用一个随机序列的寡核酸作引物,通常为10个核甘酸,以生物基因组的DNA作模板进行PCR扩增反应,扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离,所得多态性可反映基因组DNA相应区域的多态性,因而可用于对不同类群细菌和不同致病变种亲缘关系的鉴定、系统进化发育的研究等等。

姬广海等[19]用40个引物对中国水稻条斑病菌、稻短条斑病菌和李氏禾条斑病菌等14个代表菌株进行了RAPD分析。H oc q uellet A等[20]应用RAPD方法检测了柑桔黄龙病亚洲种与非洲种基因的多态性并获得4个鉴别基因。X iaotin g Q in等[21]在研究柑橘和咖啡上的致病菌X y lella f astidiosa时,发现传统的PCR法较难鉴别,他们应用了RAPD-PCR法,扩增产物存在C foⅠ多态性,利用这特点较好的鉴别了该致病菌。K hoodoo等[22]也充分使用了该方法,对天南星科等植物的细菌性枯萎病病原物不同致病变种Xanthomonas axono p odis p v.die ff enbachiae进行遗传多态性分析,从而进行鉴定。

5Nested-PCR

巢式PCR(nested PCR)是一种PCR改良模式,它由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成,首先对靶DNA进行第一步扩增,然后从第一次反应产物中取出少量作为反应模板进行第二次扩增,第二次PCR引物与第一次反应产物的序列互补,第二次PCR扩增的产物即为目的产物。

王茂华等[23]根据玉米细菌性枯萎病病菌IT S区域序列,选择特异性序列,设计了一对引物,该引物能从参试菌株中扩增出特异性条带,然后与扩增IT S区域的通用引物结合,建立了检测和鉴定该病菌的nested-PCR技术,该技术检测灵敏度达到了4个细菌细胞。吴琼等[24]在研究该病菌时,通过对该病原菌及其近似种的16S rDNA的序列测定和分析,设计了该病原菌的特异性引物,最后采用nested-PCR技术,准确区分了该病菌及其近似种,且检测灵敏度在DNA水平上达到10-3n g,检测纯培养细菌达到2CFU/m l的水平。

6展望

PCR及其相关技术的进步极大的促进了植物细菌病害研究的发展,为植物细菌病害的研究注入了新鲜的血液,植物细菌病害的检测由最初的症状观察、形态观察、生理生化分析、到血清学、免疫学的发展,再到今天的PCR检测,经历了由宏观到分子水平的过渡,检测技术的准确性、灵敏性、快捷性都在不断地提高。但是,PCR技术发展的同时,其在植物病原细菌检测方面也存在着一些不足,如PCR反应绝大部分只能利用病原物的核酸或纯培养物作为PCR模板,若以受侵染植物组织的核酸粗提液或材料浸泡液作为模板, PCR反应将会受到严重抑制;另外,一些尖端的PCR 技术方法还需要特配的仪器,这只能满足一些条件较好的单位,若想在全国的检疫系统、大学、研究院配备,还是有一定的难度,这就大大阻碍了应用PCR技