影响反相高效液相色谱分离的因素

实验二 影响反相高效液相色谱分离的因素

一、实验目的

1. 了解高效液相色谱仪器结构；

2. 熟悉溶质结构、溶剂组成和固定相对溶质保留值的影响；

3. 了解影响反相高效液相色谱分离的因素。

二、实验原理

1. 反相色谱保留机制：疏溶剂理论

溶质的疏水性、流动相的极性（表面张力）和固定相的烷基链长影响溶质的保留。 2. 影响溶质分离的因素

n ：柱长、柱效

α：流动相组成与性质、固定相性质、柱温等 k ：流动相组成与性质、固定相性质、柱温等

三、实验条件

色谱柱：C18（150 mm×4.6mm ；250 mm×4.6mm ）

流动相：甲醇-水（100，95/5，90/10）；流速：1.0（0.8，0.6，）mL·min -1 检测：UV 254 nm 样品：苯、萘、蒽

四、操作步骤

1. 流动相组成对分离的影响

在C18（150 mm×4.6mm ）和1.0 mL·min -1流速下，依次更换流动相，在每个体系中，均注入

2. 流动相流速对分离的影响

在C18（150 mm×4.6mm ）和甲醇-水（90/10）下，依次更换流动相流速，在每个体系中，均

⎪⎭⎫

⎝⎛+⎪⎪⎭

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⎝⎛-=

k k ααR ,,11n 4

11212

注入5 μL苯-甲苯-萘混合样品，记录色谱图，计算对应的n、k和R。

3. 柱长对分离的影响

更换色谱柱，在甲醇-水（90/10，v=1.0 mL·min-1）体系中，注入5 μL苯-甲苯-萘混合样品，

、α和R。

记录色谱图，计算对应的k

五、数据处理

1.根据操作步骤1，绘制lgk～CH3OH％曲线。

2.根据操作步骤1、2和3，说明流动相组成、流速和柱长对k和R的影响。

六、思考题

1.根据本实验的主要结论，指出下列各组物质在反相色谱中的洗脱顺序。

（1）苯、苯酚和萘；（2）苯酚、邻甲酚和2,4-二甲酚；（3）正丁醇、仲丁醇和叔丁醇

2. 在反相柱上欲分离三个相邻的组分，初试未达到完全分离。如何实现完全分离？