质粒DNA的双酶切
载体双酶切
载体双酶切技术是分子生物学领域常用的实验技术之一，它通过利用两种不同的限制性内切酶作用于同一个质粒DNA，从而实现对目标DNA片段的精确剪切和克隆。
本文将从载体双酶切技术的原理、应用和优缺点等方面进行详细介绍。
一、原理载体双酶切技术的原理主要基于两种不同的限制性内切酶对DNA的特异性切割。
首先，选择两种能够在同一质粒上切割出相互兼容的黏性末端的内切酶，并确定其最佳反应条件。
然后，将目标DNA片段与质粒进行双酶切反应，使得目标DNA片段的末端与质粒的末端具有互补的黏性末端。
最后，通过DNA连接酶的作用，将目标DNA片段与质粒连接成重组质粒，实现目标DNA片段的克隆插入。
二、应用载体双酶切技术在分子生物学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于重组质粒的构建，将外源基因插入到质粒中，用于基因克隆、表达和功能研究。
其次，还可以通过双酶切技术对质粒进行定向修饰，如引入点突变、插入序列或者删除特定片段等，用于研究基因的结构与功能。
此外，载体双酶切技术也被广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因组编辑等领域。
三、优缺点1. 优点（1）精准：通过双酶切技术可实现对DNA片段的精确切割和定向连接，保证了重组质粒的稳定性和可靠性。
（2）灵活：可以根据实验需要选择不同的限制性内切酶组合，实现对DNA的多样化操作。
（3）高效：相比传统的单酶切技术，载体双酶切技术能够提高DNA片段的连接效率和克隆成功率。
2. 缺点（1）操作复杂：双酶切技术需要充分考虑两种内切酶的选择、反应条件的优化及连接方法的调整，操作过程较为复杂。
（2）局限性：某些情况下可能无法找到适合的双酶切位点，导致目标DNA片段无法有效插入到质粒中。
（3）成本较高：需要购买多种限制性内切酶和连接酶，增加了实验成本。
综上所述，载体双酶切技术作为一种重要的分子生物学工具，在基因工程和分子生物学研究中发挥着重要作用。
随着技术的不断进步和完善，相信它将在更多领域展现出其巨大的潜力和价值。
质粒DNA的酶切鉴定原理
质粒DNA的酶切鉴定原理质粒DNA的酶切鉴定是一种常用的实验方法，用于确定质粒DNA的大小和纯度。
酶切鉴定是通过用特定的限制性内切酶切割质粒DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，并通过染色或脱染观察分离结果。
限制性内切酶是一类特殊的酶，它们能够识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
酶切鉴定的原理主要包括限制性内切酶的选择、质粒DNA酶切、琼脂糖凝胶电泳和染色观察。
首先，选择适当的限制性内切酶。
限制性内切酶是依据其能够识别的特定DNA 序列而命名的。
在酶切鉴定中，通常使用两个不同的限制性内切酶，因为单个限制性内切酶的选择性有限。
选择限制性内切酶时需考虑酶切位点的位置和数量，以及酶切位点的特异性和完整性。
其次，进行质粒酶切。
通常将质粒DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶混合，反应一段时间。
反应结束后，通过热灭活限制性内切酶，停止酶切反应。
酶切反应完成后，会得到经限制性内切酶切割的DNA片段。
然后，进行琼脂糖凝胶电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分子量测定方法。
它通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，在电场作用下，DNA片段按照大小被分离。
较小的DNA片段在电场中移动更快，较大的DNA片段移动较慢。
通过检测琼脂糖凝胶上的DNA迁移距离，可以获得质粒DNA的分子量信息。
最后，通过染色观察和图像分析来确定质粒DNA的大小和纯度。
琼脂糖凝胶电泳结束后，通常需要染色来显示DNA片段。
常见的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。
经过染色的琼脂糖凝胶可以进行观察和记录，并通过分析软件对分离的DNA片段进行测量和分析，得到质粒DNA的大小和纯度信息。
总之，质粒DNA酶切鉴定是通过限制性内切酶切割质粒DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离和染色观察来确定质粒DNA的大小和纯度。
这种方法简便易行，可用于快速鉴定质粒DNA的酶切效果和测定其分子量。
实验5质粒DNA的双酶切
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五、思考题
Ⅱ型限制性内切酶识别序列的特点是什么？这种 酶的切割有两种方式，两种切割方式分别产生怎 样的末端？
影响限制性内切酶活性的因素有哪些？
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［注定事项］ 1．分子克隆是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，
四、实验步骤
1. 质粒DNA的双酶切
➢ 反应体系：
➢ 反应条件：温度 37℃，酶切1.5h
10×H Buffer 质粒DNA 无菌水 EcoRⅠ XhoⅠ 总体积
2μL
10μL～12μL≤1μg 6μL ～ 4μL 1μL 1μL 20μL（无菌水补至总 体积）
25 °C
37 °C
2. 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果
通过本实验掌握质粒DNA双酶切的 原理和操作方法
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二、实验原理
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限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序
列的DNA水解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个 核苷酸组成的特定序列
寄主控制的限制与修饰现象
多种细菌能合成限制性内切酶，这是它们保护自己，降 解外来DNA分子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序 列上的A或C碱基的甲基化而不被限制性内切酶攻击，而外 源DNA一旦进入细胞则立即被识别，双股DNA螺旋都被切断。 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核 酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶 限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
（l）防止因盖子未盖严密使水汽进入管内，使反应溶液体积大量增加， 造成实验失败。
（2）防止由于标签脱落，分不清样品类型。 5．由于温差原因，往往在盖上有水汽，因此样品酶切完毕或中间取样 电泳要离心2秒钟，以集中体积内溶液，否则会发现酶切后体积少了。
目的基因双酶切
目的基因双酶切
目的基因双酶切用两个限制性内切酶，质粒上就产生了两个缺口，环状质粒就变成两段线状DNA了。
回收你需要的那一段，因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末端（当然目的基因也要用这两种酶切才行），在T4DNA连接酶在作用下，它们就连到一起了。
注意事项：1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。
2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。
铺板前后注意用吹风机吹干。
3、对照的设立:为验证双酶切是否成功，可做如下对照:酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。
双酶切的优点是避免目的基因与质粒自环以及目的基因的反向连接。
双酶切的优点乎前是：防止目的基因（载体）自身连接，防止目的基因与运载体反向连接（任意桐团两点）检测目的基因是否表达出岁轮清产物，采用抗原一抗体杂交；从基因组文库获取的。
质粒双酶切构建经验！
质粒双酶切构建经验！大神教你做酶切！1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
bamhi和ecori双酶切原理
bamhi和ecori双酶切原理
双酶切技术是一种分子生物学技术，用于从DNA分子中特异性地剪切出目标DNA片段。
它的原理基于两个限制性内切酶的特异性切割作用，以及DNA的双链结构。
限制性内切酶是一类能够识别DNA特定序列并在该序列上切割DNA双链的酶。
不同的限制性内切酶具有不同的切割位点和切割方式。
双酶切技术利用两个限制性内切酶，分别在目标DNA序列的两侧切割，从而将目标DNA片段从DNA分子中剪切出来。
在双酶切实验中，首先将DNA与两种酶一起孵育，然后酶在特定序列上切割DNA，形成切割产物。
具体来说，双酶切技术的步骤如下：选择两个限制性内切酶，使它们能够在目标DNA序列的两侧切割，并且它们的切割位点不重叠。
将DNA分子与两个限制性内切酶一起反应，使它们在目标DNA序列的两侧切割。
切割后的DNA分子形成两个断裂端，其中一个断裂端是粘性的，另一个是平滑的。
将DNA分子与质粒或其他DNA分子连接，使粘性断裂端与另一个DNA分子的粘性断裂端连接，形成重组DNA 分子。
将重组DNA分子转化到宿主细胞中，使其复制和表达。
通过双酶切技术，可以将目标DNA片段插入到质粒或其他DNA分子中，用于基因克隆、基因工程、基因组编辑等研究领域。
至于BamHI和EcoRI双酶切原理可以查阅相关书籍或文献了解更多相关信息。
实验一二重组质粒DNA提取双酶切鉴定凝胶电泳紫外分光法
制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产 生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入， 使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显；
不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动， 尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以 上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈 建议跑完胶之后再用EB染色。
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2.4 双酶切体系
合计
质粒DNA 10×M buffer BamHⅠ HindⅢ ddH2O
37 ℃，1-2h
10μl 2μl 1μl 1μl 6μl
20μl
同学自己加
准备室 老师已 加好
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思考题？
❖ 为什么要对重组质粒DNA进行双酶切？
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三、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶 电泳
1 原理
上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， -20 ℃ 冰箱中放置15min，12000g10min
弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000g×5min 去上清，管平放室温静置10min， 20 µl TE 溶解DNA
RCF = 1.12r（rpm/1000)2
RCF: 离心力（g） r: 离心半径（mm） rpm: 每分钟转速（r/min）
4.室温凝胶30分钟
过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。 时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影 响胶内部孔径形成。
5.拔梳子，放入电泳槽。
缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是 同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入 电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。
三、上样电泳
步骤
Buffer不要用成H2O，称量相对准确
2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀， 非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶 继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。 冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的
实验报告双酶切实验目的(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法。
2. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
3. 熟悉核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。
4. 熟练操作限制性核酸内切酶、DNA连接酶等分子生物学实验技术。
5. 培养实验操作规范，提高实验技能。
二、实验原理1. 双酶切法：利用两种限制性核酸内切酶分别识别并切割目的基因片段和载体质粒，产生黏性末端或平末端，以便于连接。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳：通过琼脂糖凝胶电泳分离不同分子量的DNA片段，便于观察和分析目的基因片段。
3. 核酸琼脂糖胶回收：利用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段，通过酶解、溶解、纯化等步骤获得高纯度的目的基因片段。
三、实验器材1. 仪器：DNA电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、PCR仪、移液器、微量离心机、恒温培养箱、电热恒温器等。
2. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA标记物、琼脂糖、DNA模板、DNA载体、DNA标记染料、缓冲液、DNA提取试剂盒等。
四、实验步骤1. 提取DNA模板：按照DNA提取试剂盒说明书提取目的基因片段和载体质粒的DNA。
2. 设计酶切反应体系：根据限制性核酸内切酶的识别序列，设计酶切反应体系，包括限制性核酸内切酶、DNA模板、缓冲液、DNA标记物等。
3. 酶切反应：将酶切反应体系放入恒温培养箱中，在适宜的温度下进行酶切反应。
4. 酶切产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，观察DNA条带，鉴定酶切是否成功。
5. DNA连接：将酶切后的目的基因片段和载体质粒进行连接反应，连接条件按照DNA连接酶说明书进行。
6. 连接产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，观察DNA条带，鉴定连接是否成功。
7. 核酸琼脂糖胶回收：将连接产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的基因片段。
8. 目的基因片段纯化：利用核酸琼脂糖胶回收试剂盒对回收的目的基因片段进行纯化。
9. 纯化产物鉴定：通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化产物，观察DNA条带，鉴定纯化是否成功。
双酶切连接
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了 14个质粒。
现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。
应用大体系，如100微升。
2.纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。
所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒3.酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
4.酶切、回收后的PCR产物与载体的连接:摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。
但对于初学者从头认真计算则非常有必要。
回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524µg。
质粒DNA的提取与酶切
实验五质粒DNA的提取与酶切地球科学学院606班宫魁六组200928006841083一、实验原理：（一）、质粒是一种双链的共价闭合DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行复制，并使子代细胞保持他们恒定的拷贝数。
从细胞的生存看，没有质粒存在基本上不影响细胞的存活，所以质粒是寄生性的自主复制子。
根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程技术和方法，使质粒将某种基因带入受体细胞表达它的遗传性状，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或者产生某种新的物质。
目前质粒已广泛用于DNA分子的无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构和功能的较好的模型。
质粒一般来自细菌，分离和纯化质粒DNA的方法很多，但都包括以下几个步骤，细菌的培养和质粒的扩增、菌体裂解、质粒DNA的纯化。
在细胞内，质粒以超螺旋的形式存在，在一些条件下，一条链发生一处和多处断裂则另一条链就能自由的旋转是分子内的扭曲消除形成松弛型的开环DNA分子。
加热或者碱处理虽然可以解开双链中的氢键，但随着冷却或pH恢复到中性它们又很好的复性到原来的共价闭合构形，线性DNA分子却仍然处于变性状态。
细菌裂解时常用溶菌酶和SDS或NaOH和SDS的混合物作为裂解液，使菌体充分裂解。
此时，细菌染色体DNA可以形成折叠状染色体的结构附着在细胞膜碎片上，离心时它们容易沉出。
质粒DNA存在于清液中，其中还含有可溶性蛋白质，核糖核蛋白和tRNA等，在提取过程中加入蛋白水解酶和核糖核酸酶能使它们降解。
通过碱性酚（pH8.0）和氯仿—异戊醇混合液抽提，可除去蛋白质等杂质。
异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层，变性蛋白层和有机层维持稳定。
经反复抽提可得到纯度较高的质粒DNA。
（二）、限制性内切酶以双链DNA为底物，环状和线性DNA均可作为底物。
在合适的的反应条件下，是两条核糖链上特定的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段。
实验5质粒DNA的双酶切
III 型酶
2种不同的亚基 2种不同的亚基 ATP、Mg2+、 EcoP1:A异性位点序 列
切割位点 序列特异性切割 在DNA克隆中的 用途
Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，
并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的 双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随 机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工 程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。 这类酶如EcoB、EcoK等。
限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切 断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
特性
限制和修饰活性 蛋白质结构 辅助因子
I 型酶
单一多功能的酶 3种不同的亚基 ATP、Mg2+、 EcoB:TGANTGCT 距特异性位点至少 不是 无用
II 型酶
单一的成分 单一的成分 Mg2+ 旋转对称 位于特异性位点 是 十分有用
粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末
端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末 端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G’AA|TTC ……3’ 3’…… C T T|AA’G …...5’ |表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC 或CTTAAG，这就是回文顺序。 ‘表示在双链上交错切割 的位置，切割后生成两个DNA片段，各有一个单链末端， 两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA连接酶的作用而“粘合” 双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT’|ATC …… 3’ 3’…… CTA’|TAG …… 5’ 切割后形成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶 连接起来
制备1％琼脂糖凝胶（含 0.5μg/mLEB），120V电 泳20分钟（最高电压不超过5V/cm）。
质粒双酶切后成功的标志
质粒双酶切后成功的标志
质粒双酶切后成功的标志是一项重要的实验步骤，该步骤会确保质粒酶切效果良好，有助于后续的基因工程操作。
下面将详细介绍质粒双酶切成功的标志。
1.凝胶电泳分析
最常用的检测质粒双酶切成功的方法是凝胶电泳分析。
通过电泳分离DNA，可以确定DNA的长度和完整性。
在凝胶电泳中，如果双酶切割作用有效，DNA会被切成两个或多个不同大小的碎片，这些碎片会在凝胶中形成不同的带状图案。
如果没有发生双酶切割，DNA将完整地保留，形成一个单独的带状图案。
2.碱基序列分析
双酶切后的DNA片段可以被进一步分离并测序，以确保正确的酶切位点。
这被称为限制性片段长度多态性（RFLP）分析。
通过与参考序列进行比较，可以确定酶切了哪些位点，并确认是否达到了预期的酶切效果。
这种方法通常在基因工程实验中使用，以确保重组质粒和转导体的正确性。
3.荧光素酶标记
质粒DNA上添加荧光素酶标记可以直接检测双酶切效果。
荧光素酶标记是一种绿色荧光蛋白，能够很容易地与DNA结合。
通过观察荧光素酶标记的荧光强度和分布，可以判断DNA是否成功双酶切割。
4.质粒测序
质粒测序是一种非常精确的检测方法。
通过使用测序仪器测量质粒双酶切后片段的每个碱基，可以确保酶切效果正确。
这种方法通常在对基因序列进行研究时使用，以确定基因在双酶切后发生的变化。
总之，质粒双酶切后成功的标志是可以通过精确的实验方法来检测，如凝胶电泳分析、碱基序列分析、荧光素酶标记和质粒测序。
这些方法可以帮助科学家确保质粒DNA的完整性和正确性，从而保证后续的基因工程操作的精确性和有效性。
实验二 阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定
实验二阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定实验目的：练习质粒的抽提及双酶切的实验过程，熟悉相关操作。
实验材料及设备pMD-T重组质粒；内切酶Xba I 及Pst I；10×M Buffe r；琼脂糖；电泳仪及电泳所需试剂。
实验步骤A 大肠杆菌的扩繁及质粒DNA碱裂解法抽提挑取筛选平板上的白色菌落，接种到5ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期↓取培养液倒入2 ml eppendorf管中，4℃下12000 rpm离心2分钟，去上清↓沉淀中加入150 μl溶液I（50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0)），剧烈振荡使菌体悬浮，室温下放置5分钟↓加入250 μl新配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1％SDS, 临用前配制)盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，室温下放置5分钟↓加入180 μl预冷的溶液III（5 mol/L KAc 60ml, 冰醋酸11.5ml, H2O 28.5ml, 定容至100ml , 并高压灭菌）盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀↓冰浴10分钟，4℃下12000rpm离心10分钟↓上清液移入干净eppendorf管中，计算体积↓加入各1/2体积的Tris-饱和酚以及氯仿/异戊醇(24：1)，混匀20℃下12000 rpm离心10分钟，取上清, 计算体积↓加等体积的氯仿/异戊醇（24：1），12000 rpm离心10分钟↓将上清移入干净eppendorf管中，计算体积↓加入2倍体积的无水乙醇↓混匀后置于-20℃冰箱中30分钟↓然后4℃下12000 rpm离心10分钟↓弃上清，将管口敞开倒置于纸巾上使所有液体流出，用70％乙醇、无水乙醇各洗沉淀一次↓将管倒置于纸巾上使液体流尽，室温干燥↓将沉淀溶于100 μl TE缓冲液(pH8.0，（含20μg /ml RNaseA )中，储于-20℃冰箱中备用B 双酶切反应1、在PCR管中配制下列酶切体系（1×M Buffer）：重组质粒10 ul（未稀释的原液）ddH2O 6 ul10×M Buffer 2ulXba I 1ul (15 U )Pst I 1ul (15 U )总体积20ul2、反应管置37℃下，酶切反应3～4小时。
dna双酶切实验报告
DNA双酶切实验报告实验报告：DNA双酶切实验引言：DNA是生物体中的一种重要的遗传物质，它携带着生物体的遗传信息。
DNA双酶切是一种常用的实验技术，可以将DNA分子切成特定的片段，以便于进一步研究和分析。
实验目的：1.了解DNA双酶切技术的原理和操作步骤；2.学习如何使用限制性内切酶来进行DNA分子的切割；3.观察并分析DNA酶切产物。
实验材料：1. 限制性内切酶：如EcoR1；2.DNA样本；3.缓冲溶液；4. 质量Marker DNA。
实验步骤：1.提取DNA样本并酶切准备：a.从合适的生物材料中提取DNA样本；b.通过酶解实验，将DNA样本切割成等长片段。
2.准备酶切反应体系：a.将提取得到的DNA样本和限制性内切酶一同加入到缓冲溶液中；b.缓冲溶液包含有助于酶切反应进行的成分。
3.酶切反应：a.将酶切反应混合物加热至适宜温度，一般为37℃，使酶能够有效地发挥作用；b.反应时间根据酶的特性和所需结果而定，一般为数小时。
4.分析酶切产物：a.通过琼脂糖凝胶电泳将酶切产物进行分离；b. 将DNA样本和Marker DNA一同加载到琼脂糖凝胶孔中；c.运行凝胶电泳，使DNA片段能够迁移并被分离。
结果与讨论：观察琼脂糖凝胶电泳结果，可以看到DNA样本在电场作用下迁移，并被分离成多个片段。
根据DNA片段的大小和迁移距离，可以确定酶切产物的大小和数目。
在实验中，如果酶切产物正好与所期望的片段大小一致，则说明酶切反应成功。
若产物片段大小与预期不符，则可能由于酶切条件不恰当或酶切位点发生突变等原因。
结论：通过本实验，我们了解了DNA双酶切技术的原理和操作步骤，并成功使用限制性内切酶将DNA样本切割成特定的片段。
同时，通过琼脂糖凝胶电泳分析，我们正确判断出酶切产物的大小和数目。
实验结果为我们进一步研究和分析DNA提供了基础。
总结：DNA双酶切实验是一种重要的遗传学研究手段，通过限制性内切酶的作用，可以将DNA分子切割成特定的片段，能够有效地研究和分析DNA的结构和功能。
质粒DNA的提取、酶切及目标序列的PCR扩增
******大学教学实验报告实验项目名称：质粒DNA的提取、酶切及目标序列的PCR扩增实验项目性质：综合性实验计划学时：课程实习班级：姓名：学号：指导教师：2010 年5 月26日摘要本实验通过碱裂解法提取并纯化大肠杆菌DH5α（含重组了约500bp DNA 片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）中的质粒DNA，并对该质粒DNA进行双酶切及目标序列的PCR扩增，学习并掌握基因工程操作中最常用的载体质粒DNA 提取方法及其纯化技术、DNA酶切分析实验的基本操作和PCR实验操作技能，理解限制性内切酶的特点，加深对聚合酶链式反应的原理的理解。
结果显示，提取的质粒DNA量较多，且含有插入目的片段，但仍伴有大分子DNA碎片，提取纯化质粒DNA的操作有待提高。
本文为基因工程中质粒DNA提取和纯化等提供一定的参考价值。
关键词：质粒DNA 双酶切PCR1、前言质粒( Plasmid)是一种染色体外稳定的遗传因子，大小从1～200 kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力[1]，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，它可将有用的外源基因通过基因工程的手段送入细胞中进行繁殖和表达，是分子生物学试验中常用的工具[2]。
质粒DNA 是基因工程的常用载体。
大肠杆菌因其易操作，发酵周期短，备受分子生物学工作者的青睐。
因此，大肠杆菌质粒DNA 的提取成为分子生物学实验中最基础和最重要的工作。
质粒的质量关系到分子克隆的全过程。
目前,常用的质粒提取方法除了有碱裂解法[3-4]、煮沸法等，还有许多改进的方法报道(如贺竹梅[5]、李云峰[6]等)。
同时各试剂公司也开发出多种质粒提取试剂盒。
本文以碱裂解法提取质粒DNA并进行纯化，分别以双酶切与PCR技术检验提取的重组质粒中是否含有插入的目的片段。
2、材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验材料大肠杆菌DH5α（含重组了约500bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）2.1.2实验试剂LB培养基，3mol/L醋酸钾（pH5.2），TE缓冲液（pH8.0），无水乙醇，75%乙醇，RNaseA（10mg/ml），goldview DNA染色剂，氯仿，琼脂糖；BamH I（1 U /μL）、HindⅢ（1 U /μL）、10×K buffer、6×上样缓冲液、0.5×TBE等；1U/μL的Taq酶，10 ×PCR buffer，1 mmol/L 的dNTP，克隆基因特异引物F1、F2（各1µmol/L），marker DNA，ddH2O。
质粒双酶切教案
质粒双酶切教案教案标题：质粒双酶切教案教学目标：1. 理解质粒双酶切的原理和应用；2. 掌握常用的双酶切酶的特点和操作方法；3. 能够设计和实施质粒双酶切实验，并进行结果分析。
教学准备：1. 教师准备：质粒双酶切实验器材和试剂、电子白板或黑板、投影仪、计算机等；2. 学生准备：实验笔记本、实验室衣物和个人防护用品。
教学过程：步骤一：引入（5分钟）1. 教师通过展示质粒双酶切实验的图片或视频，引起学生的兴趣和好奇心；2. 提问学生对质粒双酶切的了解程度，了解学生的基础知识。
步骤二：讲解质粒双酶切的原理和应用（10分钟）1. 教师通过简洁明了的语言，讲解质粒双酶切的原理，即限制性内切酶识别特定的DNA序列并切割；2. 介绍质粒双酶切在分子生物学研究中的应用，如基因工程、DNA测序等。
步骤三：介绍常用的双酶切酶的特点和操作方法（15分钟）1. 教师介绍一些常用的双酶切酶，如EcoRI、BamHI等，并讲解它们的特点和识别序列；2. 详细讲解双酶切酶的操作方法，包括反应体系的组成、酶的加入量和反应条件等。
步骤四：设计和实施质粒双酶切实验（20分钟）1. 学生分组进行实验设计，包括选择适当的双酶切酶、质粒DNA和反应条件；2. 学生按照实验设计进行实验操作，并记录实验过程和结果；3. 教师在实验过程中进行指导和解答学生的问题。
步骤五：结果分析和讨论（10分钟）1. 学生根据实验结果进行数据分析，包括酶切产物的大小和数量等；2. 学生进行实验结果的讨论，探讨实验中可能存在的误差和改进方法；3. 教师总结实验结果，强调质粒双酶切的重要性和应用价值。
步骤六：作业布置（5分钟）1. 教师布置相关的课后作业，如实验报告撰写、相关文献阅读等；2. 鼓励学生积极参与相关科研项目或竞赛，拓宽对质粒双酶切的应用和研究。
教学反思：通过本节课的教学，学生能够了解质粒双酶切的原理和应用，掌握常用的双酶切酶的特点和操作方法，并能够设计和实施质粒双酶切实验。
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点双酶切：1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。
因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。
有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。
2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。
3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。
酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。
4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。
5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。
6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。
选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。
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• 平头末端：Ⅱ型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生 平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT’|ATC …… 3’
3’…… CTA’|TAG …… 5’ 切割后形成两种片段，片段末端同样可以通过DNA连接酶连接起来
Ⅲ型限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在 识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸 对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆
➢ Ⅱ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割 双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种 限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷 酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9 个、10个和11个核苷酸的。Ⅱ型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序， 即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割 可以有两种方式：
• 水浴锅 • 移液枪和枪头 • 制冰机 • 浮板 • R-pGEX-4T-1质粒DNA • XhoⅠ酶 • EcoRⅠ酶 • 10×H Buffer • 无菌水 • 小离心管
四、实验步骤
• 质粒DNA的双酶切 反应体系：
EcoRⅠ XhoⅠ 10×H Buffer 质粒DNA 无菌水 总体积
一、实验目的
• 通过本实验让学生掌握质粒DNA双酶切的 原理和操作方法
பைடு நூலகம்
二、实验原理
• 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水 解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由4～6个核苷酸组成的特定序 列
• 多种细菌能合成限制性内切酶，这是它们保护自己，降解外来DNA分 子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序列上的A或C碱基的甲 基化而不被限制性内切酶攻击，而外源DNA一旦进入细胞则立即被识 别，双股DNA螺旋都被切断，这种现象被称为寄主控制的限制与修饰 现象
• 粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互 补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G’AA|TTC ……3’
3’…… C T T|AA’G …...5’
|表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是 回文顺序。 ‘表示在双链上交错切割的位置，切割后生成两个DNA片段，各 有一个单链末端，两条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA连接酶的作用而“粘合”
• 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶
• 限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情 况不同，分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型
➢ Ⅰ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上 切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类 限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结 构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等
1μL 1μL 2μL 10μL～12μL≤1μg 6μL ～ 4μL 20μL（无菌水补至总体积）
反应条件：温度37℃，酶切1.5h • 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果 • 紫外线投射仪观察结果 • UVP凝胶成像系统记录结果（电泳图）
五、思考题
• Ⅱ型限制性内切酶识别序列的特点是什么？这种 酶的切割有两种方式，两种切割方式分别产生怎 样的末端？
影响限制性内切酶活性的因素：
• DNA的纯度 • DNA的甲基化程度 • 酶切消化反应的温度 • DNA的分子结构 • 溶液中离子浓度及种类 • 缓冲液的pH值
双酶切的两种酶介绍
• XhoⅠ酶（TaKaRa公司） 识别序列和切割位点：
• EcoRⅠ酶（TaKaRa公司） 识别序列和切割位点：
三、仪器、材料与试剂
• 影响限制性内切酶活性的因素有哪些？
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