微生物的接种、分离和培养
实验五 微生物的分离、接种及培养法
实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。
2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。
二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。
在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。
三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。
2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。
3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。
四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。
具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。
（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。
（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。
然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。
微生物的分离与培养
微生物的分离与培养实验原理：一、培养基的制备培养基通过人工加入微生物的生长所必需的各种成分，包括水，碳源，单元，无机盐和生长因子各种营养物质配置而成的养料。
二、微生物的接种微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。
由于实验目的，培养基种类及容器等不同，所以接种方法不同。
用不同的接种方法以获得生长良好的纯种微生物。
三、微生物的培养不同的微生物对营养需求不同，根据这点可以通过培养基对微生物的做初步分离。
四、质粒的提取碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。
在PH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断链，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断链，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以PH4.8D的NaAc高盐缓冲液冲击去调节其PH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA，蛋白质—SDS的复合物等一起沉淀下来而被除去。
五、PCR技术DNA的半保留复制时生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋或单链。
在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制或同样的两分子拷贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶，dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
六、琼脂糖凝胶电泳许多重要的生物，如蛋白质，核酸等都具有可电离的基因，在某一特定的PH下他们可以电离正电荷或负电荷，当加上电均后，这些带点分子就会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
而电泳技术就是利用在电均的作用下，由于待分离样品中各种分子带点性质，分子大小形状等的差异，从而产生不同的迁就率，对样品进行分离，鉴定或纯化的技术。
PCR产物的回收将含有质粒DNA的荧光色带切下，溶解后填充到硅胶柱中，利用硅胶在高盐低PH下吸附DNA，在低盐和高PH条件下DNA可在被洗脱的原理，进行DNA的回收和纯化。
微生物的分离、接种和培养技术
微生物的分离、接种和培养技术一、实验的目的和内容目的：掌握微生物接种和分离纯化技术，掌握无菌操作技术。
内容：用平板划线法分离微生物；学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、基本原理在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。
因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须从中把他们分离出来。
微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。
无菌操作是微生物接种技术的关键。
接种是将微生物或微生物悬液引入新鲜培养基的过程。
由于实验目的、培养基种类及实验器皿等不同，所用接种方法不尽相同。
斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。
分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。
即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。
在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
三、材料及器材（一）菌种：大肠杆菌、枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌。
（二）培养基：肉汤培养基试管斜面，肉汤半固体培养基，肉汤固体培养基试管斜面，肉汤固体培养基平板，查氏培养基试管斜面，查氏培养基平板。
易（三）仪器及其他工具：接种环，接种针，接种钩，镊子，酒精灯，火柴，酒精棉，试管架，标签纸，恒温培养箱等。
四、方法与步骤（一）接种。
1、试管菌种转接：试管细菌菌种转接主要用于菌种的活化、分离、纯化。
（1）将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。
（2）置试管口于酒精火焰附近。
（3）将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管中，在管壁上停留片刻待其冷却。
（4）取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
（5）取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
（6）重新塞上棉塞。
（7）烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。
微生物培养与分离方法
微生物培养与分离方法大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。
只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。
一、接种与分离方法根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。
1．平板划线分离培养法对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。
临床送检的标本如痰、咽试子、泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌。
平板划线分离法通常有两种方法：（1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。
先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的1/4）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。
每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。
一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。
（2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。
方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。
琼脂斜面接种法主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。
用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。
生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。
3．穿刺接种法此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。
接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。
微生物的接种分离和纯培养
穿刺接种技术：用接种针从菌种斜面上挑取 少量菌体并竖直穿刺到半固 体培养基中；
接种无菌操作步骤
1. 将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手 的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两 只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出； 2. 右手拿接种环，竖直伸入火焰中，环端 及伸入试管中部分均充分灭菌；
I
冷却至 45℃左右
每皿约倒入15ml
肉汤培养基
II
III
0.2ml 0.2ml
0.2ml
微生物的计数
血球计数法 平板活菌计数法
计繁殖数法只适宜于单细胞状态的微生物 或丝状微生物产生的孢子
血球计数法
一、实验原理
血球计数器是一特制的厚载玻片，上面 刻有一定面积的方格，将盖玻片盖上后，由 于两者之间存在着距离使之形成一定容积的 小室。滴入待测样品后，使样品均匀充满小 室，在显微镜下计算小室内的菌数，换算成 单位体积的样品中所含的菌数。
度。
思考题
1. 微生物的纯种分离通常采用那些方法，并说明个 方法的特点。
2. 什么叫微生物的污染？如何防止？ 3. 从两种方法计数得出的菌液浓度是否一致？分析
误差产生的原因，由此比较一下两者的优缺点及 各自的适用范围。 4. 平板活菌计数中，为何选择生长有25～250个菌 落的平板？
碰到火焰，以免烧死菌体 6. 血球计数器要洁净干燥，滴入菌液时在盖玻片与
载玻片间不能有气泡 7. 血球计数时显微镜光线不宜太亮
实验安排（三人一组）
斜面接种：每组三支 液体接种：每组三支（大肠、四联、枯草各一支） 穿刺接种：每组二支（四联一支、变形一支） 平板划线分离：每人划一块平板（混合菌液) 稀释分离：I、II、III各一块平板（混合菌液) 血球计数：写出小格数目，并算出酵母菌液
微生物的接种与分离纯化技术及培养方法
微生物的接种与分离纯化技术及培养方法
（一）接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
1、接种工具和方法
1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀
2、常用的接种方法
•１）划线接种２）点植接种３）穿刺接种４）倾注接种
•５）涂布接种６）液体接种７）注射接种８）活体接种
(二)、分离纯化
1 稀释倾注平板法：
1、先稀释样品，加入平板
2、倒平板时注意培养基温度
3、混合均匀
３、平板划线法：.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.
四格法
平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。
2、划线方法
微生物的培养方法
（一）一般培养法（需氧培养）
•培养温度:25~37℃；接种后平板、试管、三角瓶，置于恒温培养箱
（二）、厌氧培养方法
1、简易的厌氧培养法：
•（1）庖肉培养法
•（2）铁丝圈厌氧培养法
•（3）焦性没食子酸法
2、厌氧罐法
3、厌氧手套箱法
A、厌氧缸法：厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
•接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内
培养。
B、厌氧罐法：装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合气(N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V)。
（三）二氧化碳培养法
•1、烛缸法2、二氧化碳置換法
•3、化学法：每一升用重碳酸钠0.4克与浓盐酸0.35亳升加入
•4、二氧化碳培养箱法。
细菌的分离纯化和接种实验
细菌的分离纯化和接种实验引言细菌的分离纯化和接种实验是微生物学研究中常用的实验方法之一。
通过这个实验，我们可以将混合细菌群体中的某种特定细菌分离出来，并进行纯化和培养。
本文将介绍细菌的分离纯化和接种实验的步骤和注意事项。
材料和方法实验材料•需要分离的混合细菌样品•无菌培养基•培养皿•灭菌的培养液•灭菌的试管和移液器•灭菌的培养箱•实验台实验步骤1.准备工作–消毒实验台和所需实验用具，保证实验环境无菌。
–准备好无菌培养基和培养皿。
2.分离细菌–从混合细菌样品中取一小部分，加入无菌培养基中。
–用无菌的移液器均匀涂抹混合液在无菌培养皿上。
–将培养皿密封好，放入灭菌的培养箱中进行培养。
3.纯化细菌–经过一段时间的培养，观察培养皿中的菌落情况。
–选择一个孤立的菌落，用无菌的移液器将其转移到另一个无菌培养皿中。
–重复上述步骤，直至获得纯化的菌落。
4.培养细菌–将纯化的菌落转移到新的无菌培养基中。
–用无菌的移液器均匀涂抹细菌液在无菌培养皿上。
–将培养皿密封好，放入灭菌的培养箱中进行培养。
5.接种实验–准备好待接种的培养基和细菌培养液。
–用无菌的移液器取适量的细菌培养液，加入到待接种的培养基中。
–轻轻摇动培养基，使细菌均匀分布。
–将接种好的培养基放入培养箱中进行培养。
6.结果分析–经过一段时间的培养，观察接种后的培养基中细菌的生长情况。
–记录菌落的数量和形态特征，如颜色、形状等。
注意事项•实验过程中要保持实验环境的无菌状态，严禁对细菌样品和培养基进行交叉污染。
•实验操作要轻柔，避免对细菌造成机械损伤。
•实验结束后，要对实验用具进行正确的处理和消毒，防止细菌的传播和感染。
结论细菌的分离纯化和接种实验是微生物学研究中常用的实验方法。
通过这个实验，我们可以从混合细菌群体中分离出特定细菌，并进行纯化和培养。
这些分离纯化的细菌可以用于后续的微生物学研究和实验，为我们深入了解细菌的特性和功能提供了重要的基础。
在实验操作过程中，我们要严格遵守无菌操作的要求，保证实验的可靠性和准确性。
实验三：细菌分离接种技术和培养
实验三 细菌分离、接种技术和培养法
目的要求：
1、掌握细菌分离培养的基本要领和方法。
2、掌握平板划线、斜面培养基等接种方法。
3、熟悉细菌分离培养的环境和条件。
实验内容：
1、 细菌划线分离培养：连续划线分离培养法 分区划线分离培养法
2、 纯培养获得与移植：试管间的斜面移植； 可疑菌落纯培养移植
Staphylococcus epidermidis on blood agar With on hemolysis
细菌纯培养
细菌斜面 纯培养法
细菌纯培养
液体培养基
半固体培养基穿刺培养
实验报告：
1、细菌分离培养和纯培养的实验过程。 2、本次细菌分离培养的结果。
细菌划线分离培养
Streptococcus pyogenes on blood agar, illustration b-hemolysis.
Streptococcus pneumoniae on blood agar, illustration a-hemolysis.
Staphylococcus aureus on blood agar, illustration b-hemolysis.
3、 液体培养基增菌和培养（示教）
4、 半固体培养基穿刺培养（示教）
说明：
病原菌的人工培养一般采用35～37℃，培养时间多数为18～24 h，但有 时需根据菌种及培养目的作最佳选择，如细菌的药物敏感试验则应选用对数 期的培养物。将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散 作用，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称为分离培养。一般 经过18～24 h培养后，单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团，称为 菌落（colony）。挑取一个菌落，移种到另一培养基中，生长出来的细菌均 为纯种，称为纯培养（pure culture）。从混杂的微生物群体中获得只含有 某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。微生物在固体培养 基生长形成的单个菌落一般是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取 单菌落而获得一种纯培养。
实验五 微生物的接种、分离与培养技术
合不紧密，用接种针容易挑起
，多数表面较光滑、湿润、较
粘稠，易挑取，质地均匀，色
泽多样。
细菌菌落特征：剖面图
细菌菌落特征：常见的平面正面图
吸管或吸嘴；如果只取少量而且勿需定量也可用接种
环，视实验目的而定
三、实验器材与试剂
菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆
菌等营养琼脂斜面
Hale Waihona Puke 培养基：肉汤营养琼脂斜面、肉汤营养液体
培养基
仪器和其它用品：接种环、酒精灯、无
菌玻璃吸管等
图1 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀
实验五
微生物的接种、分离
与培养技术
一、目的要求
熟练掌握从固体培养基和液体培养基中转
接微生物的无菌操作技术 明确无菌操作的重要性
二、基本原理
高温对微生物具有致死效应，因此在微生物的转
接过程中，一般在火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接 种环，以达到灭菌的目的，但一定要保证其冷却后方 可进行转接，以免烫死微生物。 如果是转接液体培养物，则用预先已灭菌的玻璃
四、操作步骤
火焰旁打开培养物试管帽 火焰旁挑菌落
火焰旁接种
空白组 静置培养
斜面接种时的无菌操作
(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞
斜面接种法及接种后菌落生长示意图
接种后菌落生长示意图菌苔(lawn)
细菌菌落的特征
一般都较小，菌落与培养基结
微生物的接种分离和纯培养
接种工具：接种环、接种针、 移液管和刮铲等
○ 接种必须在严格无菌的环 境中进行！
试验材料
菌种：四联球菌，大肠杆菌，枯 草杆菌，变形杆菌，混合菌液
培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养 基，牛肉
膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏蛋 白胨半固体培养基
其他：接种针，接种环，培养皿， 吸管，记号笔等
以无菌操作用接种环 沾取待分离的混合菌 液；
左手持盛培养基的三 角瓶，在火焰附近， 用右手手掌边夹取棉 塞，将三角瓶转移到 右手，瓶口过火；
左手持培养皿底并使 其面向火焰，划线， 划线距离恰当（尽量 靠近，但线与线勿碰 到）。
左手取一无菌培养皿， 在火焰边稍稍打开皿 盖，倒入培养基15ml 左右，放在桌面上轻 轻摇匀，待凝后即成 平板；
微生物的接种分离和纯培养
什么是纯种培养？
自然界中的微生物都是杂居在一起的，通过分离，
01
使它们由混杂状态到单个个体在固体培养基上成为
一个菌落，就获得纯种。
原理是将待分离的样品进行一定的稀释，使之分散，
02
在固体培养基上形成单个菌落，再转接到适当的培
养基上，就认为是纯种。
接种技术
接种技术是将微生物接到适 于生长繁殖的人工培养基或 生物体内的过程。
穿刺接种技术
一．用接种针以无菌操作挑取少许菌体穿刺与半固体培养基中间，刺至管底， 再按原途退出。穿刺时要做到手稳、动作轻巧、快速；
二．塞紧棉塞后，放入37℃恒温培养箱内培养24小时观察结果。
实验步骤之二分离法
01
琼脂平板划线分离法
02 稀释分离法
琼脂平板划线分离法
牛肉膏蛋白胨琼脂培 养基加热熔化后，冷 却至45℃左右；
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理微生物纯种分离、培养及接种技术是微生物学中最基本的实验技术之一。
其目的是从混合的微生物菌群中分离出单一的微生物菌落，并在适宜的培养条件下进行纯化和生长，以获得纯种微生物。
一、实验器材和试剂1.灭菌针2.毛细胞计数板3.显微镜4.平板接种器、针头5.无菌匀浆棒、吸管6.细菌培养基7.消毒液二、实验步骤1. 样品处理及制备首先需要选择一份待测试的样品，包括土样、水样、空气、食品等，然后将样品采集到无菌容器中，再将其送到实验室。
在进行样品处理之前，需要先进行简单的初步处理，将样品进行稀释或者过滤，将其中的杂质和大颗粒物去除，以利于后续实验的操作。
接下来需要进行制备培养基，根据不同的微生物种类，需要选择适当的培养基进行培养。
通常情况下，我们可以使用凝胶培养基、液体培养基、甜菜汁培养基等，以满足微生物在不同环境下生长所需的营养物和成分。
2.分离纯化分离纯化是该实验的关键步骤。
将经过预处理的样品移到无菌试管中，打开试管口，加入适量的制备好的培养基，然后利用匀浆棒或吸管将混合物均匀混合。
然后利用平板接种器将混合物接种到培养基平板上，使其密切接触。
然后将接种好的平板置于恒温箱中，以利于微生物的生长和营养物质的自我繁殖。
在接种后2-7天内，不同类型的微生物将在培养基平板上生长出不同的菌落，每一种菌落都代表一种单一的微生物。
将这些菌落分离提取，并再次进行培养，就能得到单纯的微生物菌种。
3.纯种微生物菌种接种在获得单纯的微生物菌种之后，需要将其再次接种到培养基中进行培育。
将相应体积的纯种菌种接种到培养基平板上，使其能够生长繁殖。
在接种后约24小时内，微生物将在培养基中生长出许多菌落。
根据菌落的特征和形态，可以对不同的微生物进行鉴定和分类。
如果需要进行更加深入的分析，可以对微生物菌种进行进一步培养、萃取定量和测序等工作，以获取更多的相关信息。
三、实验注意事项1. 实验前需要保证实验室内部环境和仪器均为无菌状态。
实验11微生物的分离、培养
目 录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验总结
01 实验目的
掌握微生物分离、培养的基本原理
微生物分离
通过选择适当的培养基和分离方 法，将目标微生物从混合样本中 分离出来。
微生物培养
在适宜的生长条件下，使目标微 生物生长繁殖，获得纯培养物或 特定微生物群体。
在医学领域的应用
在医学领域，微生物分离、培养技术可用于疾病诊断和治疗。通过对病原微生物的分离、培养和研究， 可以深入了解疾病的发病机制和传播途径，为疾病的预防和治疗提供有力支持。
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在生物工程领域的应用
微生物分离、培养技术在生物工程领域有着广泛的应用，如用于生产生物制品、生物燃料等。随着生物工程技术的不 断发展，该技术的应用前景将更加广阔。
在环境治理领域的应用
微生物分离、培养技术也可应用于环境治理领域，如污水处理、土壤修复等。通过分离、培养具有特定功能的微生物 ，可以实现环境的有效治理和修复。
生长曲线绘制
通过定时测量菌落大小或菌液OD值， 绘制生长曲线，分析微生物的生长规 律。
生长速率计算
根据生长曲线，计算不同时间段的生 长速率，了解微生物的生长动态。
生长条件优化
根据生长曲线，分析微生物的生长条 件需求，优化培养条件，提高生长速 率和产量。
生长限制因素分析
根据生长曲线，分析影响微生物生长 的限制因素，为进一步优化培养条件 提供依据。
微生物培养
将分离得到的微生物接种到适宜的培养基上，在 适宜的温度和湿度条件下进行培养。
观察与记录
定期观察微生物的生长情况，记录生长曲线、菌落特征 等信息。
微生物的培养与分离方法
微生物的培养与分离方法接种与分离方法根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。
1．平板划线分离培养法对混有多种细菌，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。
平板划线分离法通常有两种方法：①分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的细菌的分离。
先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的¼）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。
每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。
一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。
①连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。
方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。
2.琼脂斜面接种法主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。
用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。
生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。
3．穿刺接种法此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。
接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。
双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。
4．液体培养基接种法用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。
用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。
此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。
微生物的接种、分离和培养
实验六微生物的接种、分离和培养一、目的要求1．理解和掌握微生物接种、分离基本技术的原理与操作要领。
2．熟悉微生物接种、分离的无菌操作过程。
3．了解微生物需氧培养的方法。
4．学会观察和描述微生物的各种培养性状。
二、实验原理1. 微生物接种指将微生物纯种或含菌材料转移到另一营养基质上的过程。
根据不同的目的可采用的不同的接种方法，如平板划线法、斜面划线法、浸洗法、涂布法、倾注法、穿刺法、点植法和影印法。
2. 微生物分离指依据微生物的特征，采用各种方法从含菌样品中获得由单一个体（如单一菌体或孢子）或一段菌丝生长繁殖形成的微生物群体的过程。
常用的分离方法有：平板划线法、稀释涂布平板分离法、稀释倾注平板分离法和单细胞分离法。
平板分离法的基本原理包括两个方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
3. 微生物培养指微生物被接种到营养基质后，在一定条件下生长繁殖的过程，分需氧培养法和厌氧培养法。
本实验所做的需氧培养法，是采用生化培养箱和恒温摇床进行的。
4. 微生物的培养形状培养性状是微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。
平板菌落特征、斜面和液体培养特征、半固体穿刺培养特征等培养性状，是鉴定微生物的重要形态学依据。
菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的眼可见的子细胞群体。
菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用培养基、培养温度和时间等条件不同而存在不同程度的差异。
实验5细菌的接种及分离培养
观察记录菌落形态和特征
01
菌落形态
观察并记录不同细菌在培养基上 形成的菌落形态，如圆形、椭圆 形、不规则形等。
菌落特征
02
03
菌落大小和颜色
记录菌落的色素、透明度、边缘 形状、表面特征（光滑或粗糙） 等。
观察并记录菌落的大小和颜色， 这些特征有助于鉴别不同种类的 细菌。
测定细菌的生长曲线
1 2
生长曲线绘制
观察与记录
定时观察细菌的生长情况，记 录菌落形态、颜色、大小等信 息，以便后续分析。
分离纯化
对于需要分离纯化的细菌，可 采用划线法、稀释涂布法等方 法进行分离纯化，获得单一菌 落。
保存菌种
将分离纯化后的菌种进行保存 ，以便后续实验使用。可以采 用甘油管藏、冷冻干燥等方法
进行保存。
04 实验结果分析
实验结果：通过实验，我们 成功地分离培养出了纯种的 细菌，并观察到了其在不同 培养条件下的生长情况。具
体数据如下表所示
| 培养条件 | 菌落数 | 生长情 况|
实验总结
| --- | --- | --- |
| 温度37℃、湿度适宜 | 120 | 良好 |
| 温度4℃、湿度适宜 | 0 | 无生 长|
结果分析
分析实验结果，比较不同细菌之间的差异，探究其原 因。
结论总结
根据分析结果，得出关于细菌接种及分离培养的结论， 并指出实验中可能存在的误差和不足之处。
05 注意事项与实验总结
注意事项
安全注意事项 实验应在无菌环境下进行，避免外界细菌污染。
使用后的器材和培养基应进行正确的消毒处理，避免交叉污染。
实验目的
本实验旨在学习细菌的接种及分离培养技术，掌握无菌操作技术和显微观察技 术，了解细菌的生长特性和培养条件。
微生物的接种、分离和培养以及无菌操作和接种室的消毒(2)
微生物的接种、分离和培养以及无菌操作和接种室的消毒（2）2、平板划线分离法平板划线分离法是接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到分离微生物的一种方法。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的。
（1）倒平板溶化牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平板，水平静置待凝。
（2）在酒精灯光焰上灼烧接种环，待冷，取一接种环金黄葡萄球菌、大肠杆菌混合菌液。
（3）左手握琼脂平板稍抬起皿盖，同时靠近火焰周围，右手持接种环伸入皿内，在平板上一个区域作之形回划线，划线时例接种环与平板表面成30-40°角度轻轻接触，以腕力在表面作轻快的滑动，勿使平板表面划破或嵌进增基内。
（4）灼烧接种杯，以杀灭接种环上尚残余的菌液，待冷却后，再将接种环伸入皿内，在第一区域划过线的地方稍接触一下后，转动90°，在第二区域继续划线。
（5）划毕后再灼烧接种杯，冷却后用同样方法在其他区域划线（图7-8、9）。
（6）全部划线完毕后，在平皿底用特种蜡笔注明菌种、日期、组别、姓名。
将整个培养皿倒置放入恒温箱培养。
（7）37℃经过24-48小时培养后取出观察。
注意菌落的开关、大小、颜色、边缘、表面结构、透明度等性状。
附一无菌操作环节（1）接种室应保持清洁，用煤粉酚皂液擦洗台面及墙壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。
每次使用前，均应用紫外灯灭菌。
定期对接种室作无菌程度的检查。
（2）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、工作衣、戴口罩。
工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用。
不准穿到其它地方去，并要定期更换、消毒。
（3）接种的试管、三角并瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。
移入接种室内的所有物品，均须在缓冲室用70%酒精擦试干净。
（4）接种前，双手用70%酒精或新洁尔消毒，操作过程不离开酒精灯火焰；棉塞不乱放；接种工具使用前后均需火焰灭菌。
（5）培养箱应经常清洁消毒。
附二接种室的消毒方法1、紫外线灭菌接种室使用前打开紫外灯照射约30分钟，就能使空气和室壁表面基本上无菌。
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实验六微生物的接种、分离和培养一、目的要求1．理解和掌握微生物接种、分离基本技术的原理及操作要领。
2．熟悉微生物接种、分离的无菌操作过程。
3．了解微生物需氧培养的方法。
4．学会观察和描述微生物的各种培养性状。
二、实验原理1. 微生物接种指将微生物纯种或含菌材料转移到另一营养基质上的过程。
根据不同的目的可采用的不同的接种方法，如平板划线法、斜面划线法、浸洗法、涂布法、倾注法、穿刺法、点植法和影印法。
2. 微生物分离指依据微生物的特征，采用各种方法从含菌样品中获得由单一个体（如单一菌体或孢子）或一段菌丝生长繁殖形成的微生物群体的过程。
常用的分离方法有：平板划线法、稀释涂布平板分离法、稀释倾注平板分离法和单细胞分离法。
平板分离法的基本原理包括两个方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
3. 微生物培养指微生物被接种到营养基质后，在一定条件下生长繁殖的过程，分需氧培养法和厌氧培养法。
本实验所做的需氧培养法，是采用生化培养箱和恒温摇床进行的。
4. 微生物的培养形状培养性状是微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。
平板菌落特征、斜面和液体培养特征、半固体穿刺培养特征等培养性状，是鉴定微生物的重要形态学依据。
菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的眼可见的子细胞群体。
菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用培养基、培养温度和时间等条件不同而存在不同程度的差异。
若所用培养基、培养温度和时间等条件相同，则同一种菌所形成的菌落形态具有相对的稳定性和专一性。
三、实验材料1. 菌种大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），热带假丝酵母（Candida tropicalis），毛霉(Mucor sp.)，根霉（Rhizopus sp.），黑曲霉(A.niger)，青霉(Penicillium sp.)，混合菌液。
2. 培养基营养琼脂斜面和平板，半固体营养琼脂直立柱，PDA 斜面和平板。
3. 接种工具接种环，接种针，涂布棒，无菌吸管等。
4. 其他酒精灯，生化培养箱等。
四、实验方法与步骤（一）实验项目接种前的准备：接种的试管、培养皿等应做好标记，注明菌种的名称，日期、接种者等。
表6-1实验项目实验项目所用菌种所用培养基方法提示名称用量分离方法1.平板划线分离法混合菌滴营养琼脂平板2皿左手拿平板，并负责开启皿盖，右手持接种环，取菌少许后在平板上作分区划线。
分离方法2.稀释倾注平板分离法大肠杆菌营养琼脂平板1皿①取稀释好的菌液1mL加入灭菌的空平皿②加入15mL45℃的融化琼脂，水平转动平皿3.稀释涂布平板分离法大肠杆菌营养琼脂平板1皿取稀释好的菌液0.1mL加入到平板上→用灭菌涂布棒涂开涂匀（二）各种接种方法的操作步骤所有待接种的培养基在接种前都要先贴好标签，整个接种过程都必须在酒精灯旁进行。
1．斜面接种斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。
具体操作如下：（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后才能点燃酒精灯。
（2）用斜面进行接种时，将原菌种管和待转接斜面试管夹在左手的大拇指和其它四指之间，斜面朝上，并处于水平位置。
（图6-1，1）1 2 34 5 6图6-1 斜面划线接种示意图（3）先将原菌种管和待转接斜面试管的硅胶塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）右手拿接种环（与日常拿笔一样）在火焰上将环金属丝部分烧红灭菌，然后将其余要伸入试管部分的金属柄也反复通过火焰灭菌。
（图6-1，2）（5）用右手小指、无名指或手掌将原菌种管和待转接斜面试管的硅胶塞同时拔出并把硅胶塞握住，不得任意放在桌上或与其它物品相接触，再以火焰烧管口（图6-1，3）。
（6）将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管，接种环在接触菌种前先在试管壁上或未长菌落的培养基面上接触一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种，然后用接种环轻轻沾取少量菌苔，接着将接种环自菌种管抽出。
抽出时勿与管壁相碰，也勿通过火焰（图6-1，4）。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入待接斜面试管中，自斜面培养基底部向上划线，使菌体沾附在培养基的斜面上，划线时环要平放，勿用力，否则会使培养基表面划破（图6-1，5）（8）接种完毕后将接种环抽出，灼烧一下管口，塞上硅胶塞，塞棉塞时勿要用试管口去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。
（图6-1，6）。
（9）接种环放回原处前要在火焰上彻底灭菌，接种致病菌时更要注意这点。
将棉塞旋紧。
注意：棉塞与火焰的距离要适当，以免棉塞燃烧。
2．穿刺接种（1）操作方法见图6-2，可以水平穿刺，也可以垂直穿刺，所使用的接种针要笔直。
（2）将接种针自培养基中心刺入，直到接近管底，但勿穿透，然后沿原穿刺途径慢慢拔出。
图6-2 穿刺接种示意图3．平板接种（1）划线接种见分离划线法。
（2）涂布接种用无菌吸管吸却菌液注入平板后，用灭菌的玻璃在平板表面作均匀涂布（图7-3）。
（3）三点接种法①标明三点位置：欲使点接的三点分布均匀，可用记号笔先在平板底部以等边三角形状标上三点。
②取接种针：拿接种针，先在火焰上烧红灭菌，并在平板培养基的边缘冷却且蘸湿。
③沾取孢子：将灭过菌并蘸湿的接种针伸入菌种管,用针尖沾取少量霉菌孢子。
④点接：操作方法基本同穿刺接种，以垂直法或水平法把接种针上沾着的孢子以垂直的方向轻轻的点接到平板培养基表面预先做好标记的部位。
注意在点接时切勿刺破培养基。
4．分离方法（1）涂布平板分离法涂布平板分离法是样品经过适当稀释后，用无菌吸管吸取0.1mL于固体培养基平板中，用无菌玻璃涂棒将稀释液均匀地涂布，使样品中的菌体经过培养后能在平板表面上形成单个菌落。
（图6-3）（2）稀释倾注平板分离法倾注平板分离法是最常用的纯种分离法,先将待分离的材料作一系列的稀释（如1:10,1:100,1:1000,1:10,000……),然后分别取不同稀释液少许（一般取0.1mL）,与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合,摇匀后,倾入灭过菌的培养皿中,待琼脂凝固后,保温培养一定时间即可出现菌落.如果稀释得当,平皿上就可出现分散的单个菌落,这个菌落可能就是由一个细胞繁殖形成的.随后挑取该单个菌落,或重复以上操作数次,便可得到纯培养。
（图6-4）（3）平板划线分离法划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
常用的划线方法有下列二种：用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线1～2 条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。
划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
（图6-5）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。
划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
图6-3 稀释涂布平板分离法图6-4 稀释倾注平板分离法a（适用于浓度较低的菌液）b（适用于浓度较高的菌液）图6-5 平板划线分离法（三）培养细菌于37℃恒温箱中培养，24 h 后开始观察生长情况。
酵母菌、霉菌28℃恒温箱中培养，48h 后开始观察生长情况。
注意：平板应倒置培养。
（四）微生物培养形状观察参照下表容，认真观察和记录接种的各种细菌、酵母菌、霉菌的培养性状。
表6-2微生物培养性状观察容常用描述述语平板菌落特征大小微菌落（﹤1mm 〉、小菌落（1—2mm ）、中等大菌落 （2—4mm ）、大菌落（4—6mm ）、巨大菌落（﹥6mm ） 形态 圆形、假根状、不规则状、丝状、卷发状、菌丝状等隆起度 扩展、稍起凸、隆起、凸面、乳头状等 边缘 整齐、缺刻状、圆锯齿形、波状、裂叶状等透明度 透明、半透明、不透明表面形状 平滑、粗糙、颗粒状、同心环状、放射状、丝状、树状等表面光泽 闪光、不闪光、金属光泽等 颜色 无色、灰白色、金黄色、红色、黑色等质地粘液状、蜡状、干燥、湿润等 （划直线接种）斜面培养性状生长程度 生长良好、微弱、不生长 菌苔形态 线状、串珠状、根状、扩展状、棘状菌苔隆起度扁平、凸起观察容常用描述述语 表面形态 平滑、粗糙、颗粒状等 透明度 透明、半透明、不透明 质地 粘液状、腊状、干燥、湿润 颜色无色、灰白色、金黄色、红色、黑色 刺培养性状半固体穿 生长程度良好、较好、一般、微弱、不生长沿穿刺线 生长形状 线状、棘状、珠状、绒毛状、根状、扩散生长图6-6 菌落形态特征菌落总体形状和边缘状况可由菌落上方俯视观察，而菌落高度则由平板边缘水平观察。
图6-7 细菌菌落的隆起度（A）边缘（B）、表面形状及透明度（C）图6-8 细菌在琼脂培养基中穿刺图6-9 细菌在明胶培养基中穿刺培养的生长特征培养并液化明胶的特征（a）丝状；（b）有小刺；（c）念珠状；（a）不液化；（b）火山口状；（c）芜箐状；（d）绒毛状；（e）假根状；（f）树状（d）漏斗状；（e）袋状（f）层状五、实验结果分“菌种名称、培养基名称、接种方法、培养温度、及时间、培养性状描述”等栏目，制表记录观察结果。
六、实验思考题1. 微生物接种方法的共同点是什么？据此可否想出其它接种方法?2. 若没有接种环，可否用别的接种工具照样接种？3. 平板划线分离纯种的依据是什么?操作中应该特别注意哪些环节？4. 倾注平板用的琼脂培养基为何要冷却至45℃？5. “无菌操作”在微生物接种、分离工作中有何意义？6. 若没有电热恒温培养设备，可否另想办法也能使接种在培养基上的微生物照样生长？7. 如何区别某种菌产生的是水溶性色素还是非水溶性色素？8. 混浊度（OD560值）相同、体积相等的大肠杆菌菌液和啤酒酵母菌液所含的菌数是否相同？为什么？9. 同一种菌在同一平板上所形成的菌落会否一样大？七、注意事项1．微生物的接种、分离操作，最好在无菌室或无菌罩进行。
若在普通室做，酒精灯火焰应稍大，要防止外来污染。