双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展

双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展

摘要:双报告基因即在一个信号系统内同时表达,但独立测量的两个荧光酶的报告基因。在双报告基因系统中,一个报告基因活性的改变,与基因表达的特定实验条件相关,而另个报告基因的组成型活性则提供内对照,使实验值正态化。目前很多实验都采用了荧光素酶报告基因(Luc),但从检测速度、灵敏度和线性范围来考虑,双荧光素酶即萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase)的组合,可以较好地体现检测结果的精确性。本文以萤火虫双荧光素酶报告基因系统为重点,综述了该报告系统的特点、应用和近年来的研究进展。

关键词:双报告基因萤火虫荧光素酶海肾荧光素酶

1 双荧光素酶报告基因系统在遗传毒性检测中的应用

正常情况下,生物体内的p53蛋白水平维持在较低水平,当细胞出现DNA损伤或者低氧刺激时,p53蛋白就会大量表达并通过三种方式应答DNA损伤,激活p21基因的表达引起细胞周期阻滞,激活DNA修复相关基因的表达,但如果损伤过度,p53基因就会激活促凋亡基因的表达诱导细胞凋亡。因此,p53蛋白的表达水平和转录活性的提高,是细胞出现DNA损伤的一种重要表现形式。在此理论基础上,可以构建由p53或p53靶基因的启动子驱动的荧光虫荧光素酶表达载体,辅以海肾荧光素酶报告基因载体(如pRL-CMV)作为内参质粒转染到细胞

中,观察具有遗传毒性的化学物质对荧光素酶报告基因表达的诱导性,从而检测化学物质遗传毒性。

2 双荧光素酶报告基因系统在信号通路研究中的应用

双荧光素酶报告基因系统常被运用于研究p53信号通路及NF-kB 信号通路。P53信号通路在1中已作阐述,通常构建由p53或p53靶基因的启动子驱动的荧光虫荧光素酶表达载体并转染到细胞系中,在此基础进行p53信号通路相关的研究。NF-kB即核转录因子,NF-kB信号通路核心成分是IkB激酶复合物、IkB抑制蛋白和NF-kB二聚体。当细胞受到来自胞内外的刺激后,IkB蛋白降解,NF-kB二聚体释放。释放后的二聚体被进一步激活后转移至细胞核与目的基因结合以促进目的基因的转录[3]。Ja Shil Hvun等构建由NF-kB基因启动子驱动的pGL3-luc载体,瞬转到人结肠癌细胞Caco-2中,用镉处理细胞后研究依赖NF-kB信号通路激活的白介素-8的产生情况[4]。

3 双荧光素酶报告基因系统在转录活性分析中的应用

某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序(顺式作用元件)共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。王健等通过萤火虫和海肾双荧光素酶分析了PC-1基因在肿瘤组织中的表达及其启动子区的克隆和活性[5]。Naoko MATSUO等通过

测定荧光虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因在高等植物中的表达来监测瞬态基因的表达情况[6]。Jason W.Harger等在酵母表达载体上的海肾和萤火虫报告基因之间插入移码信号,通过检测这两种蛋白的活性来研究啤酒酵母中的移码编程(progra mmed frameshifting)[7]。

4 双荧光素酶报告基因系统的发展

与传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)相比,萤火虫双荧光素酶报告基因系统更加灵敏,有望把可能削弱实验准确性的内在因素的变化降到最小,而且报告基因的检测极为快速(30s内完成测试)、简便。常用的检测双荧光素酶报告基因的试剂盒是Promega公司提供的E1910等试剂盒,能够定量检测到萤火虫荧光蛋白和海肾荧光蛋白的表达,为与双荧光素酶报告基因载体相关的实验研究提供了极大的便利,这将会促进双荧光素酶报告基因系统在更广更深的领域发挥空间。

参考文献

[1]Sherf,B.A.et al.,Dual-Luciferase reporter assay:An advanced co-reporter technology integrating firefly and Renilla luciferase assays[G]. Promega notes,1996,57:2-9.

[2]薛丽香,童坦君,等.报告基因的选择及其研究趋向[J].生理科学进展,2002,33(4):364-366.

[3]L.A.J O´Neilla,C.Kaltschmidtb,NF-kB:a crucial transcription factor for glial and neuronal cell function[J].Trends in neurosciences,1997,20(6):252-258.

[4]Ja Shil Hyun et al.Cadmium induces Interleukin-8 production via NF-kB activation in the human intestinal epithelial cell,Caco-2[J].Cytokine,2007,37:26-34.

[5]王健,周建光,等.PC-1基因在肿瘤组织中的表达及其启动子区的克隆和活性分析[J].癌症,2002,21(11):1187-1191.

[6]Naoko MATSUO et al.Dual Luciferase Assay for Monitoring Transient Gene Expression in Higher Plants[J].Plant Biotechology,2001,18(1):71-75.

[7]Jason W.Harger et al.An in vivo dual-luciferase assay system for studying translational recoding in the yeast Saccharomyces cerevisiae[J].RNA, 2003, 9:1019-1024.